王公釗，劉君星，辛 華，王振玉，劉春輝，喬 峰，王 琳

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

載阿霉素的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)對C6細(xì)胞的毒性研究①

王公釗1，劉君星2，辛 華1，王振玉1，劉春輝1，喬 峰1，王 琳1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究載DOX(阿霉素)的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)(NPS)對C6細(xì)胞(大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞)的毒性作用。方法：通過乳化/溶劑蒸發(fā)法制備NPS-DOX和Tf-NPS-DOX，用MTT法檢測NPS-DOX和Tf-NPS-DOX對體外培養(yǎng)的C6細(xì)胞的毒性作用，并以NPS、Tf-NPS、DOX作為對照組。結(jié)果：24h時(shí)，藥物濃度為0.1μg/mL時(shí)，Tf-DOX-NPS的作用比較明顯，存活率為78.90%，而NPS-DOX組為93.77%，DOX組為95.54%；隨著藥物濃度的增高及時(shí)間的延長，48hNPS-DOX體現(xiàn)了更好的殺傷作用，4μg/mL作用48h時(shí)存活率僅為19.34%，而DOX的存活率為34.98%，Tf-DOX-NPS存活率為26.36%。結(jié)論：載DOX(阿霉素)的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)比單純抗癌藥對C6細(xì)胞的毒性作用更強(qiáng)。

納米載藥系統(tǒng)；阿霉素；靶向；C6細(xì)胞

阿霉素(Doxorubicin)是一種應(yīng)用廣泛的化療藥物，已經(jīng)被美國食品藥品管理局認(rèn)證為最有效的癌癥化療藥物之一，但其較低水溶性及低選擇性限制了它的臨床應(yīng)用，患者用藥后骨髓抑制和心臟毒性呈現(xiàn)劑量依賴[1]。在過去的十幾年中，對共聚物納米粒做為運(yùn)載化療藥物工具的研究日益增加，納米載藥系統(tǒng)憑借其獨(dú)特的藥物靶向策略和藥物釋放機(jī)制改善了藥物遞送過程中穩(wěn)定性低、溶解度小、選擇性差等問題，顯著增強(qiáng)了藥物的抗腫瘤作用[2，3]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了具有良好生物相容性的兩親性納米聚合物γ-PGA-co-PLA-DPPE(γ-多聚谷氨酸-聚乳酸-二棕櫚酰磷酯酰乙醇胺)作為載體，通過乳化/溶劑蒸發(fā)法包載阿霉素，并在載體上引入轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)靶向基，最后以C6細(xì)胞為模型，比較納米藥物和游離藥物在相同劑量時(shí)對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀(RS-232-C，美國BIO-RAD公司)，倒置式生物顯微鏡(CKX41，Olympus)，二氧化碳培養(yǎng)箱(E191IR/W200IR，美國西蒙公司)。C6細(xì)胞購買于ATCC細(xì)胞庫，MTS試劑(CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay)購買于Promega公司。所有其他試劑和溶劑均為分析級。

1.2 方法

1.2.1 載藥納米粒子的制備

納米載體由國家納米中心提供，載有阿霉素的納米粒子是通過乳化/溶劑蒸發(fā)法制備[4]。以Tf-NPS-DOX為例，將20mg納米共聚物溶于2mL二氯甲烷(DCM)構(gòu)成共聚物溶液，1mg的DOX溶解在1mLDCM中。取400μLDOX溶液滴加到2mL共聚物溶液中，并加入1%的PVA。磁力攪拌10min后，在40w功率下超聲5min，所得乳狀液減壓蒸餾除去溶液中的二氯甲烷。旋蒸后的乳狀液在13000rpm下離心20min得靶向載藥納米粒子，去離子水洗滌三次除去殘留的PVA。將載藥納米粒子溶解在PBS(pH=7.4)溶液中，備用。

1.2.2MTT法檢測藥物對細(xì)胞的毒性作用

用MTT法測定NPS、Tf-NPS、NPS-DOX、Tf-NPS-DOX、DOX對體外培養(yǎng)的C6細(xì)胞的細(xì)胞毒性。體外培養(yǎng)C6細(xì)胞(培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清，1.2%雙抗，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度5%)，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，用PBS沖洗細(xì)胞2遍，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)濃度至 1×105/mL；將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100μL(約1×104個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μL含4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL的NPS、Tf-NPS、NPS-DOX、Tf-NPS-DOX、DOXDMEM培養(yǎng)基，另設(shè)空白組(不加藥)，每個(gè)濃度4個(gè)平行樣品，繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間24h和48h；每孔加入20μLMTS試劑，37℃靜置1h。全自動酶標(biāo)儀于490nm波長檢測溶液吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繪制不同藥物濃度下不同作用時(shí)間的細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果

圖A、B顯示，從0.01～4μg/mL不同濃度的藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞存活率的變化?？梢园l(fā)現(xiàn)，NPS組在0.1μg/mL以下時(shí)沒有產(chǎn)生明顯的毒性，證明了共聚物納米粒子在0.1μg/mL以下具有良好的生物安全性。

NPS-DOX組、Tf-NPS-DOX組、DOX組，隨著藥物作用時(shí)間的增加以及阿霉素濃度的升高，細(xì)胞活力明顯降低。藥物作用24h時(shí)，Tf-NPS-DOX組在較低濃度(0.1μg/mL)時(shí)，率先顯示出比較好的抑制作用，細(xì)胞存活率為78.90%，這是由癌細(xì)胞表面高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高效的介導(dǎo)Tf-NPS-DOX入胞產(chǎn)生作用[5]；高濃度時(shí)，24h三組的毒性作用相差不大，而培養(yǎng)48h后，NPS-DOX組、Tf-NPS-DOX組毒性作用明顯優(yōu)于DOX組，可以歸因于阿霉素由NPS-DOX、Tf-NPS-DOX釋放緩慢。這是因?yàn)榧{米粒子進(jìn)入細(xì)胞是采取主動轉(zhuǎn)運(yùn)，但游離的DOX進(jìn)入細(xì)胞是通過擴(kuò)散，擴(kuò)散通路的激活可以使游離DOX快速進(jìn)入細(xì)胞，而裝載DOX的納米顆粒的藥物釋放需要酸性環(huán)境觸發(fā)，如酸性細(xì)胞器[4]。

圖A，圖B 分別為NPS、Tf-NPS、NPS-DOX、Tf-NPS-DOX、DOX作用于C6細(xì)胞24h、48h的細(xì)胞存活率-藥物濃度曲線

3 討論

化療藥物是治療腫瘤的主要方法之一，但化療藥會隨著血液循環(huán)到達(dá)全身絕大部分器官與組織，選擇性差；而且具有明顯的閾值，增加到一定量時(shí)具有明顯的毒副作用，呈現(xiàn)劑量依賴性[6]。納米載藥系統(tǒng)可以通過被動靶向(主要為EPR效應(yīng))和主動靶向(載藥納米顆粒表面腫瘤靶向配體修飾)克服這一缺陷，比如：RGD修飾的納米載藥系統(tǒng)，EricA.Murphy等人用RGD修飾載有阿霉素的納米粒子，并觀察到載藥納米粒子在整合素過量表達(dá)的腫瘤血管處富集并引起細(xì)胞的凋亡，相對于游離阿霉素，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)了15倍[7]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用γ-PGA的親水性及PLA的疏水性片段，組成新型的兩親性納米粒子γ-PGA-co-PLA-DPPE，并在載體上結(jié)合了Tf以提高藥物的靶向性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，具有轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的藥物在較低濃度時(shí)率先顯示出較好的抑制作用,此與TfR的高效介導(dǎo)藥物入胞相關(guān)。在正常細(xì)胞中，TfR(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)表達(dá)水平較低，而快速生長的腫瘤細(xì)胞因?yàn)樾梃F量增加，TfR表達(dá)顯著增加，可達(dá)正常細(xì)胞的10～100倍[8]，相比非靶向載藥納米粒子，腫瘤靶向修飾的載藥納米膠束能夠更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，更迅速地穿透細(xì)胞膜并更多的在細(xì)胞內(nèi)積累。此外通過對24h與48h結(jié)果對比，得出載藥納米顆粒具有緩釋特性，可以增加藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，降低用藥量。

綜上所述，我們評價(jià)了載DOX的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)對C6細(xì)胞的毒性作用，可為臨床用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，希望能夠早日將更多的納米載藥系統(tǒng)推向臨床試驗(yàn)。

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佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目，編號：LZR2015-013。

王公釗(1990～)男，山東泰安人，在讀碩士研究生。

王琳(1974～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:wanglin4477@163.com。

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