鄧文偉，鄧 萌，楊廣祿，王淑英，孫國(guó)志，李 堯，張 輝，姚海濤，王景霞

(1. 佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

山茱萸多糖對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響①

鄧文偉1，鄧 萌1，楊廣祿1，王淑英2，孫國(guó)志2，李 堯2，張 輝2，姚海濤2，王景霞2

(1. 佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

目的：觀察絲山茱萸對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法：清潔級(jí)Wistar大鼠共75只；體重200～250g，隨機(jī)分為6組：(1)假手術(shù)組，10只；(2)青年組，13只；(3)Aβ對(duì)照組，13只；(4)陽(yáng)性對(duì)照組，13只；(5)水煎劑組，13只；(6)多糖組，13只；標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一喂養(yǎng)，飲水自由。除青年組外，其他各組大鼠連續(xù)42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg)，之后建立AD大鼠模型，采用淀粉樣蛋白1-40(Bamyloid,1-40) 海馬立體定向微量注射方法；morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果：A-42注射前后大鼠行為學(xué)變化:造模前各組大鼠尋找平臺(tái)時(shí)間、目標(biāo)項(xiàng)限停留時(shí)間無(wú)顯著性差異，造模后,組間比較(P<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照組與模型組比較(P<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;山茱萸多糖組與模型組比較(P<0.01), 山茱萸水煎劑組與模型組比較(P<0.01)。結(jié)論：山茱萸多糖可改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

山茱萸多糖；AD；大鼠

老年性癡呆(Alzheimer’sdisease，AD)是繼心臟病、腫瘤和中風(fēng)之后的第四大死亡原因[1]。為防治AD，學(xué)者們進(jìn)行了大量的研究工作，并應(yīng)用葉酸、多奈呱齊、卵磷脂、銀杏提取物等藥物治療AD。在治療過(guò)程中由于藥物作用的特異性、有效性及毒副反應(yīng)，使得藥物在臨床應(yīng)用中受到限制[2]。近年來(lái)在治療AD的藥物上，中藥取得了一定的成果，山茱萸作為補(bǔ)益肝腎藥，使載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。山茱萸的主要成分有單糖、多糖、苷類、有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜類、皂苷、蒽醌、黃酮、甾體、三萜、內(nèi)酯等多種成分[3～7]，現(xiàn)有研究結(jié)果表發(fā)現(xiàn)山茱萸具有抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗癌等作用[8，9]，且毒副作用小，與治療AD的藥物多奈呱齊在提高AD患者操作性總有效率方面，差異無(wú)顯著性[10]。本實(shí)驗(yàn)采用海馬注射Aβ1-40制作大鼠AD模型，應(yīng)用morris水迷宮檢測(cè)山茱萸對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品

清潔級(jí)Wistar大鼠75只，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重200～250g，隨機(jī)分為6組：(1)假手術(shù)組，10只；(2)青年組，13只；(3)Aβ對(duì)照組，13只；(4)陽(yáng)性對(duì)照組，13只；(5)水煎劑組，13只；(6)多糖組，13只；標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一喂養(yǎng)，飲水自由。除青年組外，其他各組大鼠連續(xù)42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg)，這后進(jìn)行手術(shù)。術(shù)前進(jìn)行水迷宮檢測(cè)，10%的水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉(380mg/kg)，將大鼠固定在腦立體定位儀上，前囟后3.8mm，中線右側(cè)2mm，進(jìn)針至距腦表面3mm，緩慢注射，用時(shí)2min，假手術(shù)組注射2μL生理鹽水，Aβ對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠注射凝聚態(tài)Aβ1-40(10μg·μL-1) 2μL，留針10min后緩慢拔出，切口縫合，讓大鼠在低溫環(huán)境下蘇醒。連續(xù)經(jīng)胃灌服給藥30d，于最后一次給藥后次日，行水迷宮檢測(cè)。

2 方法

2.1 大鼠行為學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)方法

檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)采用Morris水迷宮法。實(shí)驗(yàn)在隔音的房間內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中水池、光源、鼠籠、操作者的位置等因素均要保持不變。實(shí)驗(yàn)采用直徑120cm，高50cm的圓形水池，水迷宮上方攝像系統(tǒng)與電腦相連，預(yù)先在水池中注入含奶粉的清水，水深約30cm，溫度(21±1.5)℃，奶粉加入量以看不見(jiàn)平臺(tái)為準(zhǔn)(高出平臺(tái)2cm)。以水池4個(gè)象限作為大鼠的入水點(diǎn)，將平臺(tái)置于入水點(diǎn)之外的任意象限的中央，每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中保持平臺(tái)位置不變，放入水中時(shí)要面向池壁，記錄大鼠從入水到找到平臺(tái)所游過(guò)的路徑及需要的時(shí)間(即逃避潛伏期)作為學(xué)習(xí)和記憶的成績(jī)、記錄大鼠在水中尋找平臺(tái)路線圖。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)定120秒為最長(zhǎng)游泳時(shí)間限制，若動(dòng)物在120秒之內(nèi)找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)停留30秒，若找不到平臺(tái)則將大鼠引至平臺(tái)并停留30秒，以強(qiáng)化其記憶。訓(xùn)練6d，每天5次，之后24h內(nèi)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在60秒內(nèi)跨越平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)等，此數(shù)據(jù)作為空間探索能力的指標(biāo)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在D-半乳糖注射42d后、手術(shù)后7d(給藥前)和給藥后分別進(jìn)行，Aβ注射后大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)下降30%以上則視為AD造模成功，本實(shí)驗(yàn)中共有53只大鼠達(dá)到要求，分別用于實(shí)驗(yàn)組(多糖組和水煎劑組)、陽(yáng)性對(duì)照組和Aβ對(duì)照組。

山茱萸購(gòu)、山茱萸多糖、鹽酸多奈哌齊、Aβ1-40分別購(gòu)于佳木斯醫(yī)藥采購(gòu)供應(yīng)站(產(chǎn)地浙江省)、寧波德康生物制品有限公司、濟(jì)南德信佳生物科技有限公司和上海瑞奇生物科技有限公司。干燥粉碎后的茱萸果實(shí)制備水煎劑，加入6倍體積的蒸餾水，浸泡24h后2次煎煮，濾液合并，2次抽提，濃縮成膏狀，使用前用雙蒸水將多糖及水煎劑分別配置成0.057g生藥/mL的溶液、Aβ制成10μg·μL-1濃度的溶液，密封后37℃孵育7d，成絮狀凝聚態(tài)之后使用。EB、乙醇、異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇、乙醚、苯酚、濃硫酸等為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 測(cè)定造模前、后及給藥后大鼠逃避的潛伏期

大鼠連續(xù)42d腹腔注射D-半乳糖后(手術(shù)前)進(jìn)行Aβ注射(手術(shù)后)、給藥30d后(給藥后)，分別進(jìn)行大鼠在定位航行中的逃避潛伏期(尋找平臺(tái)時(shí)間)檢測(cè)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠逃避潛伏期的變化及山茱萸對(duì)其影響±s，s)

注：與手術(shù)前比較※P<0.05，※※P<0.01;與青年組比較■P<0.05，■■P<0.01；與假手術(shù)組比較△P<0.05，△△P<0.01；與造模后比較#P<0.05，##P<0.01；與Aβ對(duì)照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較★P<0.05，★★P<0.01；與水煎劑組比較□P<0.05，□□P<0.01。

由表1 可見(jiàn)，與青年組比較，手術(shù)前(注射D-半乳糖之后)和手術(shù)后(注射Aβ后，模型制作結(jié)素后)大鼠逃避潛伏期均延長(zhǎng)(P<0.01)，手術(shù)造模后大鼠的潛伏期也較手術(shù)前延長(zhǎng)(P<0.01)，與假手術(shù)組比較， 在Aβ注射前各組大鼠逃避潛伏期沒(méi)有明顯差異(P>0.05)；Aβ對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組和水煎劑組在造模后潛伏期無(wú)明顯差異(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組和水煎劑組大鼠在給藥30d后潛伏期明顯縮短(P<0.01)，與Aβ對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組和水煎劑組差別顯著(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，三組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各組均未達(dá)到手術(shù)前及青年大鼠水平。

3.2 大鼠造模前后及給藥后空間探索實(shí)驗(yàn)的測(cè)定

3.2.1 大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)

AD造模前后在空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 AD模型大鼠跨越平臺(tái)的次數(shù)及山茱萸對(duì)其影響±s)

由表2可見(jiàn)，除青年組外，其他各組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)；造模后Aβ對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、水煎劑組和多糖組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)組間沒(méi)有顯著差別(P>0.05)，但均明顯少于術(shù)前(P<0.01)，與假手術(shù)組比較均有顯著差異(P<0.01)；結(jié)果顯示在手術(shù)前各組間無(wú)顯著性差別；陽(yáng)性對(duì)照組、水煎劑組和多糖組大鼠跨越平臺(tái)的次數(shù)均顯著增加，與Aβ對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，比較三組之間結(jié)果無(wú)明顯差異，且三組均沒(méi)達(dá)到術(shù)前和青年組水平(P>0.05)。

3.2.2 大鼠經(jīng)過(guò)有效區(qū)的次數(shù)

AD模型制作前后大鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)有效區(qū)的次數(shù)，見(jiàn)表3。

表3 大鼠經(jīng)有效區(qū)的次數(shù)以及山茱萸對(duì)其影響±s)

由表3可知，除青年組外，其他各組大鼠經(jīng)有效區(qū)的次數(shù)均明顯減少(P<0.01)；造模后Aβ對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組和水煎劑組大鼠經(jīng)有效區(qū)的次數(shù)均顯著少于手術(shù)前(P<0.01)，且均較假手術(shù)組有明顯減少(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組、水煎劑組和多糖組大鼠經(jīng)過(guò)有效區(qū)的次數(shù)均明顯增加(P<0.01)，亦比Aβ對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；其中多糖組與水煎劑組大鼠較陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，但三組比較結(jié)果顯示均未達(dá)到青年組和手術(shù)前大鼠水平(P>0.05)。

3.3 大鼠游程比和原象限時(shí)間比及給藥后的變化

大鼠在原象限游泳距離與總路程之比值(游程比)及在給藥后的變化檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 AD模型大鼠游程比及山茱萸對(duì)其影響±s,%)

由表4可見(jiàn)，假手術(shù)組、Aβ對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組和水煎劑組大鼠游程比較青年組均明顯降低(P<0.05)；模型制作后Aβ對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖組和水煎劑組大鼠組間游程比無(wú)顯著差異(P>0.05)，但均較手術(shù)前顯著降低(P<0.01)，且與假手術(shù)組比較有顯著差異(P<0.01)；多奈哌齊、多糖和水煎劑均能顯著提高大鼠游程比(P<0.01)，較Aβ對(duì)照組顯著提高，但三個(gè)用藥組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

Morris水迷宮是目前最廣泛使用評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)與記憶能力的方法，主要針對(duì)與海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)的記憶功能進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于AD動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組和山茱萸干預(yù)組，模型組的大鼠上臺(tái)的潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)的次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間和游程比均未下降，表明Aβ?lián)p害了大鼠的保持能力和空間記憶獲取能力，證明造模成功；與模型組比較，山茱萸干預(yù)組大鼠上臺(tái)的潛伏期顯著縮短，穿越原的平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間和游程比都有較大提高，提示山茱萸對(duì)Aβ導(dǎo)致的AD大鼠的保持能力和空間記憶獲取能力有較大的改善，能改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。

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1.黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：2014-256；2.黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12541791；3.黑龍江省中醫(yī)藥管理局，編號(hào)：ZHY16-018。

鄧文偉(1963～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

王景霞(1964～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:WWX1964@163.com。

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1008-0104(2017)03-0032-03

2017-04-06)