衣慧婷，張 麗，郭 麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

白藜蘆醇對(duì)衰老的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞小窩蛋白-1表達(dá)的影響①

衣慧婷，張 麗，郭 麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察小窩蛋白-1(Cav-1)在白藜蘆醇(Res)作用于衰老的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中的變化。方法：體外培養(yǎng)HUVECs，通過傳代形成細(xì)胞的衰老模型，以衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性、細(xì)胞增殖能力和p53、p21蛋白為衰老標(biāo)志物進(jìn)行觀察。通過不同濃度Res作用衰老的HUVECs后，SA-β-gal法檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期來反映細(xì)胞增殖能力，Westernblot蛋白印跡法檢測(cè)p53、p21和Cav-1蛋白表達(dá)。結(jié)果：與衰老組相比，隨著Res作用濃度的增加，各用藥組藍(lán)染細(xì)胞逐漸減少(P<0.05)，但與青年組相比，藍(lán)染細(xì)胞增多(P<0.01)；與衰老組比較，Res不同濃度組G0/G1期細(xì)胞比例均降低(P<0.01)，S期細(xì)胞比例均明顯增多(P<0.01)，但與青年組相比，G0/G1期細(xì)胞比例增高(P<0.01)；與衰老組比較，Res不同濃度組p53、p21和Cav-1表達(dá)均降低，且呈Res濃度依賴性。結(jié)論：Res可以延緩HUVECs衰老，其分子機(jī)制可能與下調(diào)衰老細(xì)胞Cav-1表達(dá)有關(guān)。

白藜蘆醇；細(xì)胞衰老；內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙；小窩蛋白-1

內(nèi)皮細(xì)胞衰老引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能減退是心腦血管疾病隨年齡增加的主要因素之一[1,2]，衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及舒張能力減弱，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。血管內(nèi)皮功能障礙一直以來都被認(rèn)為是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓等心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，是一種天然多酚類植物抗毒素，主要存在于葡萄中，亦存在于花生，藍(lán)莓中，因“法國悖論”而聞名世界。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)心血管、抗衰老、抗菌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗糖尿病、抗炎等方面都具有積極的作用[3]。張麗等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Res有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其機(jī)制與抑制小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)的mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)eNOS表達(dá)，促進(jìn)NO的釋放有關(guān)。通常意義上的血管內(nèi)皮功能障礙，指的是各種原因引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生物利用度減弱或者NO的合成不足所導(dǎo)致的內(nèi)皮依賴性舒張功能的減弱。因此，衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞中可能也存在相似的機(jī)制。本研究通過在體外建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)衰老模型，以探討Res在衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的效應(yīng)和作用機(jī)制，為尋找抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能藥物的臨床和科研領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)購自Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Hyclone公司，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(Senescenceassociated-β-Galactosidase,SA-β-gal)染色試劑盒購自碧云天公司，碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，兔抗Cav-1抗體、鼠抗p21抗體、鼠抗p53抗體、鼠抗Actin抗體購自SantaCluz公司。

1.2HUVECs分離培養(yǎng)和細(xì)胞衰老鑒定

原代細(xì)胞分離自出生后12h內(nèi)的新生兒臍帶(由佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科提供)。取孕婦剖腹產(chǎn)術(shù)后新鮮臍帶約15cm，PBS沖洗干凈。采用胰蛋白酶(0.25%)消化處理方法分離血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]。HUVECs用含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、溫度為37℃，傳代并計(jì)算細(xì)胞群體倍增水平(Populationdoubings，PDLs)[6]，PDL=Log(N2/N1)，N2為終末細(xì)胞數(shù)，N1為初始細(xì)胞數(shù)，PDL會(huì)隨代數(shù)而增加。SA-β-Gal活性是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。根據(jù)染色情況，將PDL≤8HUVECs定義為青年細(xì)胞，PDL≥44HUVECs定義為衰老細(xì)胞[7]。

1.3SA-β-Gal檢測(cè)細(xì)胞衰老情況

根據(jù)細(xì)胞衰老特異性SA-β-Gal檢測(cè)試劑盒操作方法，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液后，按500μL/孔加入清理液，再棄去清理液，按500μL/孔加入固定液，室溫下孵育5min后吸去固定液，按500μL/孔加入酸性液，并重復(fù)一次。最后，按400μL/孔加入染色工作液，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，在倒置顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化情況

細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，24h后待細(xì)胞貼壁，進(jìn)行藥物處理。指定時(shí)間后，消化收集經(jīng)藥物處理過細(xì)胞，加入冰冷的PBS緩沖液并將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液。800rpm/min離心5min，PBS洗兩遍，逐滴加入1mL冰冷的70%乙醇，4℃固定過夜。染色前PBS洗兩遍后重懸于500μL的PBS中，加入RNaseA，37℃孵育30min。常溫避光染色1h，流式細(xì)胞儀測(cè)定碘化丙啶熒光強(qiáng)度，CELLQuestPro分

析細(xì)胞周期變化。

1.5Westernblot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白

收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞，用冰冷的PBS洗2次，加入預(yù)冷的含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30min，4℃、12000g離心15min，測(cè)定蛋白濃度，加入3×上樣緩沖液煮5min，然后SDS-PAGE電泳、封閉、轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育，曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1HUVECs培養(yǎng)及衰老鑒定

原代HUVECs按照群體倍增水平方法傳代(Populationdoublings，PDL)方法傳代，倒置顯微鏡下可觀察到PDL8HUVECs呈現(xiàn)短梭狀或鋪路石樣緊密排列，而PDL44HUVECs失去鋪路石樣緊密排列特征，細(xì)胞體積增大，形態(tài)不一，可見胞漿中有較多的顆?；蚩张荨檫M(jìn)一步鑒定PDL44HUVECs是否呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，我們分別對(duì)PDL8和PDL44HUVECs進(jìn)行SA-β-gal染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞周期相關(guān)基因檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDL44HUVECs藍(lán)染細(xì)胞比例相比PDL8HUVECs增加了7倍(P﹤0.01)(圖1，A)；PDL44HUVECs細(xì)胞周期發(fā)生G1期阻滯(圖1，B)；PDL44HUVECs細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白p53和p21的表達(dá)水平相比PDL8HUVECs分別上調(diào)64.3%(P=0.02)和40.8%(P=0.01)，PDL44HUVECs細(xì)胞中Cav-1的表達(dá)水平上調(diào)34.6%(P=0.02)(圖1，C)。以上現(xiàn)象均提示PDL44HUVECs呈衰老狀態(tài)。

圖1 衰老HUVECs的鑒定

注：A.PDL8HUVECs(a)及PDL44HUVECs(b)SA-β-gal染色B. 流式細(xì)胞術(shù)分析PDL8HUVECs(a) 及PDL44HUVECs(b) 細(xì)胞周期C.Westernblot檢測(cè)PDL8HUVECs(1) 及PDL44HUVECs(2)p53、p21和CAV-1蛋白的表達(dá)

2.2Res對(duì)衰老的HUVECsβ-半乳糖苷酶活性的影響

不同濃度Res(0.01μM、0.1μM、1μM)作用于HUVECs96h，利用SA-β-Gal染色試劑盒可以檢測(cè)HUVECs在Res作用下細(xì)胞衰老的情況，SA-β-Gal染色呈藍(lán)色為陽性衰老細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，與衰老組相比，隨著Res作用濃度的增加，各用藥組藍(lán)染細(xì)胞逐漸減少(P<0.05)，但與青年組相比，藍(lán)染細(xì)胞增多(P<0.01)。

圖2 不同濃度Res對(duì)衰老的HUVECs SA-β-Gal活性的影響

注：*P<0.05，#P<0.01

2.3Res對(duì)衰老的HUVECs細(xì)胞周期的影響

不同濃度Res(0.01μM、0.1μM、1μM)作用于HUVECs24h，與衰老組比較，各濃度組G0/G1期細(xì)胞比例均降低(P<0.01)，S期細(xì)胞比例均明顯增多(P<0.01)。但與青年組相比，G0/G1期細(xì)胞比例增高(P<0.01)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度Res對(duì)衰老的HUVECs細(xì)胞周期的影響

圖4Westernblot檢測(cè)不同濃度Res對(duì)衰老的HUVECsp53、p21和Cav-1蛋白表達(dá)的影響

2.4Res對(duì)衰老的HUVECsp53、p21和Cav-1表達(dá)的影響

不同濃度Res(0.01μM、0.1μM、1μM)作用于HUVECs96h，Westernblot檢測(cè)p53、p21和Cav-1蛋白的表達(dá)。與衰老組比較，各濃度組p53、p21和Cav-1表達(dá)均降低，且呈Res濃度依賴性。

3 討論

目前，世界各國正逐漸步入人口老齡化社會(huì)。隨著年齡的增長(zhǎng)，心血管病的發(fā)病率明顯升高，血管老化是心血管病發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高的重要環(huán)節(jié)。血管老化的病理變化主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及由其引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。血管內(nèi)皮除了具備物理屏障功能，還可調(diào)節(jié)血管新生與重構(gòu)、參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)凝血與纖溶反應(yīng)以及調(diào)節(jié)血管舒縮能力等。其中，NO為血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的主要的血管舒張松弛因子，主要由eNOS以L-精氨酸為底物，在四氫生物蝶呤(BH4)的輔助下合成的，主要的生理功能為舒張血管、清除氧自由基[8]、抑制小板聚集等[9]。當(dāng)在病理?xiàng)l件或者衰老的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生物利用度減弱或者NO的合成不足，引起內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。因此，提高NO的水平可以延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老進(jìn)程。Cav-1是膜整合蛋白，參與膽固醇平衡、分子運(yùn)輸和跨膜信號(hào)發(fā)放事件。目前，誘發(fā)細(xì)胞老化的刺激信號(hào)途徑主要為：p56-p21途徑和p16-Rb途徑，Cav-1可通過p56-p21途徑阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖的作用，參與細(xì)胞衰老。在心血管事件中，Cav-1還能充當(dāng)eNOS基因的抑制劑，它從胞膜的分離與細(xì)胞老化和心力衰竭有關(guān)，這個(gè)過程能夠?qū)е耬NOS活性的下降[10]。前期研究表明，Res抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制與抑制Cav-1表達(dá)，上調(diào)eNOS表達(dá)，促進(jìn)NO的釋放有關(guān)。細(xì)胞的衰老是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的主要因素之一，而血管內(nèi)皮功能障礙貫穿高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化始終，反過來它們也能加重內(nèi)皮損害，造成惡性循環(huán)。由此可見，血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及其功能障礙在也血管病的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要作用。因此深入了解血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及其功能障礙的產(chǎn)生機(jī)制具有重要的意義。我們通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Res能夠降低衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而能夠延緩細(xì)胞衰老，為合理有效的干預(yù)心血管疾病提供理論依據(jù)。

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1.黑龍江省自然科學(xué)基金資助，編號(hào)：D201210；2.黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12541781。

衣慧婷(1985～)女，遼寧丹東人，在讀碩士研究生。

張麗(1973～)女，黑龍江鶴崗人，碩士，副教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:heyealice@163.com。

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A

1008-0104(2017)03-0023-03

2016-11-15)