盧巖，田夢，沈慶思，張晶，孫振高，張永臣，賈紅玲

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隔藥灸臍對卵巢早衰模型大鼠Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表達的影響

盧巖1，田夢1，沈慶思1，張晶1，孫振高2，張永臣1，賈紅玲2

1.山東中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，山東濟南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東濟南 250014

目的 觀察隔藥灸臍對卵巢早衰模型大鼠Bcl-2和Bax表達的影響，探討其對卵巢的保護機制。方法 采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建立大鼠卵巢早衰模型。48只雌性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥灸臍組、西藥組，每組12只。隔藥灸臍組大鼠隔藥灸“神闕”，30 min/d，隔日1次，連續(xù)14 d；西藥組大鼠予戊酸雌二醇灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。采用免疫組化、Western blot和實時熒光定量PCR檢測大鼠卵巢凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的表達。結(jié)果 模型組大鼠卵巢質(zhì)量明顯低于正常組（＜0.05）。Bcl-2、Bax蛋白主要表達在細胞胞漿中，隔藥灸臍組和西藥組較模型組卵泡顆粒細胞Bax表達范圍明顯縮小，Bcl-2表達范圍明顯增加。與正常組比較，模型組大鼠卵巢Bcl-2蛋白和mRNA表達明顯降低（＜0.05，＜0.01），Bax蛋白和mRNA表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，隔藥灸臍組和西藥組大鼠卵巢Bcl-2蛋白和mRNA表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），Bax蛋白和mRNA表達明顯降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)論 隔藥灸臍可能通過上調(diào)卵巢早衰模型大鼠卵巢Bcl-2和下調(diào)Bax的表達，改善卵巢功能。

卵巢早衰；隔藥灸臍；神闕；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲前出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)、性器官萎縮、高卵泡刺激素、黃體生成素水平及低雌激素水平等圍絕經(jīng)期癥狀。流行病學研究顯示，POF發(fā)病率在30歲前約為1/1000[1]，40歲前約為1%～3.6%[2]，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。隔藥灸臍法綜合艾灸、藥物、穴位三者的優(yōu)勢，能激發(fā)、調(diào)動和增強機體自身的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可促進子宮、卵巢的血液循環(huán)，從而促進卵泡的發(fā)育和成熟。卵巢顆粒細胞在卵泡發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，顆粒細胞功能的減退、凋亡可觸發(fā)卵泡閉鎖，是卵巢早衰的根本原因。Bax、Bcl-2為調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞的凋亡重要因子。Bcl-2蛋白能抑制細胞凋亡，促進卵泡生長、發(fā)育；Bax蛋白則促進細胞凋亡，使卵泡停止發(fā)育，發(fā)生閉鎖[3-4]，導致卵巢早衰。本實驗觀察隔藥灸臍對卵巢早衰大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表達的影響，探討其治療機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wistar雌性大鼠60只，2～3月齡，體質(zhì)量180～220 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于室溫22～26 ℃、相對濕度60%環(huán)境，通風良好，自然晝夜光線，適應性飼養(yǎng)5 d。

1.2 藥物、試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司），戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢谷歌生物科技公司，G2026）；兔抗actin（武漢谷歌生物科技公司，GB13001-1），兔抗Bax（Abcam，ab32503），兔抗Bcl-2（CST，2870S）。Bead Ruptor 12多樣品研磨珠均質(zhì)儀（Omni公司），熒光定量PCR儀（ABI公司，7300），紫外分光光度計（上?，F(xiàn)科儀器有限公司，752-P），電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C），掃描儀（EPSON公司，V300），灰度分析軟件（Alpha Innotech公司，alphaEaseFC），圖像分析軟件（Adobe PhotoShop）。

1.3 分組和造模

60只雌性大鼠隨機分為正常組12只和造模組48只。采用連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺建立卵巢早衰動物模型[5]，注射結(jié)束后，每日固定時間取大鼠陰道脫落細胞置于顯微鏡下觀察動情周期變化。若出現(xiàn)動情周期紊亂、動情間期延長、動情期消失等則為造模成功[6]，剔除動情周期沒有紊亂的大鼠，將造模成功的大鼠隨機分為隔藥灸臍組、西藥組和模型組，最終每組12只大鼠納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.4 干預方法

大鼠“神闕”（CV8）選穴標準參照文獻[7]。隔藥灸臍組大鼠采用本實驗室自制艾灸固定器仰臥位固定[8]，臍部去毛，常規(guī)消毒后將自制藥膏（肉蓯蓉、淫羊藿、不老草、肉桂、乳香、沒藥等組成）均勻涂抹大鼠“神闕”（CV8），用自制艾條固定器將艾條（直徑約0.8 cm，長約11.0 cm）固定，置于距離涂抹藥膏處約2 cm處施溫和灸，按艾條燃燒情況進行調(diào)節(jié)，每根艾條燃燒將要結(jié)束無法固定時進行更換，每次灸30 min，隔日1次，治療周期為14 d。西藥組大鼠予戊酸雌二醇0.09 mg/（kg?d）灌胃，每日1次，治療6 d，休息1 d，治療周期為14 d。正常組和模型組不作任何治療，僅做與隔藥灸臍組和西藥組同樣的抓取、固定。實驗結(jié)束后大鼠麻醉，仰臥位固定，取雙側(cè)卵巢稱重。一部分卵巢置于多聚甲醛固定（8只/組），免疫組化檢測卵巢Bcl-2和Bax蛋白表達；另一部分卵巢置于-80 ℃冰箱保存，用于Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的檢測。

1.5 卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)測定

卵巢稱重，計算卵巢指數(shù)[卵巢濕重（mg）÷體質(zhì)量（g）]。

1.6 免疫組化檢測

采用免疫組化方法檢測大鼠卵巢組織參與細胞凋亡調(diào)控相關(guān)因子Bcl-2和Bax的蛋白表達。多聚甲醛固定，切片包埋，按照試劑盒說明書進行操作，鏡下觀察Bcl-2和Bax的蛋白表達。

1.7 Western blot檢測

大鼠卵巢組織分別提取蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白上樣并電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入一抗，4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜后加入二抗，室溫孵育30 min，經(jīng)化學發(fā)光、曝光、顯影、定影，掃描膠片，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。

1.8 實時熒光定量PCR檢測

大鼠卵巢組織充分研末后取上清液，依次加入三氯甲烷、異丙醇等提取RNA。取PCR管，加入含2 μg RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄，反應條件42 ℃，保溫60 min，結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共循環(huán)40次。采用ΔΔCt法進行結(jié)果處理，以GAPDH為內(nèi)參，計算Bcl-2和Bax mRNA相對表達量，以2-ΔΔCt表示。引物序列：R-Bcl-2-S（GGATCCAGGATAACGGAGGC）、R-Bcl-2-A（ATG CACCCAGAGTGATGCAG）；擴增片段長度為141 bp；R-Bax-S（TGAACTGGACAACAACATGGAG）、R-Bax-A（AGCAAAGTAGAAAAG GGCAACC），擴增片段長度為148 bp；R-GAPDH-S（TTCCTACCCCCAATGTA TCCG），R-GAPDH-A（CATGAGGTCCACCACCCT GTT），擴增片段長度為281 bp。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±表示，多組間比較采用方差分析，方差齊用法，方差不齊用Dunnett' T3法。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 隔藥灸臍對卵巢早衰大鼠一般狀況的影響

正常組大鼠毛發(fā)光亮柔順，活潑好動，反應靈敏；模型組大鼠毛發(fā)枯槁豎立，狂躁不安，易激惹；隔藥灸臍組和西藥組大鼠一般情況較模型組有所好轉(zhuǎn)，毛色恢復光澤，精神較好，反應較為靈敏；隔藥灸臍組大鼠治療后行為情況更接近正常組，尤其在施灸過程中，大鼠情緒安定，無煩躁不安癥狀，呈現(xiàn)假寐狀態(tài)。

2.2 隔藥灸臍對卵巢早衰大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠卵巢質(zhì)量顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，隔藥灸臍組、西藥組卵巢質(zhì)量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。模型組大鼠卵巢指數(shù)低于正常組，西藥組、隔藥灸臍組較模型組卵巢指數(shù)增加（＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，#＜0.05

2.3 隔藥灸臍對卵巢早衰大鼠卵巢組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織Bcl-2蛋白表達明顯降低（＜0.05），Bax蛋白表達明顯升高（＜0.05），Bcl-2/Bax比值明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，隔藥灸臍組和西藥組大鼠卵巢組織Bcl-2蛋白表達明顯升高（＜0.05），Bax蛋白表達明顯降低（＜0.05），Bcl-2/Bax比值明顯升高（＜0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

表2 各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，#＜0.05；與模型組比較，*＜0.05

Bcl-2和Bax蛋白在各組大鼠卵巢組織均有表達，主要在細胞胞漿中，以棕色著色為主。正常組大鼠Bcl-2在各級卵泡顆粒細胞及黃體細胞中均有表達，模型組Bcl-2在卵泡顆粒細胞僅散在表達，隔藥灸臍組和西藥組Bcl-2表達范圍明顯大于模型組，見圖2。正常組大鼠Bax表達見于黃體細胞，卵泡顆粒細胞僅見散在表達；模型組Bax主要表達于顆粒細胞的細胞質(zhì)，在閉鎖卵泡、生長卵泡及竇狀卵泡中表達較明顯；隔藥灸臍組和西藥組卵泡顆粒細胞Bax表達范圍明顯小于模型組，見圖3。

2.4 隔藥灸臍對卵巢早衰大鼠卵巢組織Bcl-2和Bax mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織Bcl-2 mRNA表達顯著降低、Bax mRNA表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，西藥組和隔藥灸臍組大鼠卵巢組織Bcl-2 mRNA表達均顯著升高，Bax mRNA表達均顯著降低，Bcl-2/Bax比值均顯著升高（＜0.01）。結(jié)果見表3。

正常組模型組 隔藥灸臍組西藥組

正常組模型組 隔藥灸臍組西藥組

表3 各組大鼠卵巢組織Bcl-2和Bax mRNA表達比較（±）

組別只數(shù) Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax 正常組41.050±0.3490.410±0.1032.727±1.046 模型組40.259±0.083##1.718±0.486##0.167±0.088## 隔藥灸臍組41.114±0.274**0.516±0.174**2.336±0.854** 西藥組41.233±0.255**0.610±0.086**2.040±0.432**

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，**＜0.01

3 討論

根據(jù)卵巢早衰的臨床癥狀，可將其歸于中醫(yī)學“血枯”“閉經(jīng)”“血隔”等范疇?！端貑?上古天真論篇》曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！毕到y(tǒng)闡述了腎氣通過天癸而促進生殖之精的形成，從而維持生殖機能。腎氣盛則天癸至，腎氣衰則天癸竭。月經(jīng)的產(chǎn)生不僅關(guān)乎腎氣是否充足，還與沖任二脈的盛衰有關(guān)。正如《靈樞?五音五味》：“沖脈、任脈皆起于胞中?！薄短绞セ莘?卷一》云：“夫任者妊也，此是人之生養(yǎng)之本。”“血?！敝疀_脈與“陰脈之海”之任脈與天癸關(guān)系密切。

隔藥灸臍法綜合了穴位、藥物和艾灸的共同作用，能夠激發(fā)、調(diào)動和增強機體的組織能力，從而促進卵泡的發(fā)育和成熟。吳亦鼎《神灸經(jīng)論》提出：“夫灸取于人，以火性熱而至速，體柔而用剛，能消陰翳，走而不守，善入臟腑，取艾之辛香作炷，能通十二經(jīng)，入三陰，理氣血，以治百病，效如反掌?！卑氖┯谏耜I能夠激發(fā)經(jīng)氣、調(diào)動經(jīng)脈，使氣血和合、陰陽互補互長，興奮下丘腦-垂體-性腺系統(tǒng)，改善微循環(huán)[9]，防治POF。隔藥灸臍組方中所用肉蓯蓉、淫羊藿、不老草、肉桂能溫補腎陽，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：肉蓯蓉主五勞七傷，補中……養(yǎng)五臟，強陰，益精氣，多子……淫羊藿滋益精血，溫補肝腎，清風明目，益志寧神。不老草活血氣，封填骨髓，滋腎水，補益真陰之效?！庇醒芯勘砻?，溫腎陽中藥具有類雌激素的作用，能夠調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸，從而促進卵泡和子宮發(fā)育[10]?！蹲裆斯{》在描述人體氣機運行時有“氣氣歸臍”的說法，臍為先天結(jié)蒂、后天氣舍，其穴神闕屬任脈，任脈為“陰經(jīng)之?！保c“陽經(jīng)之?！钡亩矫}相通；十二經(jīng)之海的沖脈與任脈會于臍下；另外，足陽明胃經(jīng)挾臍，足太陰之筋結(jié)于臍，手少陰之筋下系于臍，故神闕可謂一穴而系全身，為元陰元陽系結(jié)的部位。因此，隔藥灸臍能夠和陰陽、行氣血、調(diào)沖任。本實驗結(jié)果顯示，大鼠注射環(huán)磷酰胺造模后毛發(fā)枯槁豎立、狂躁不安、易激惹；隔藥灸臍組和西藥組大鼠精神狀況較模型組好轉(zhuǎn)，毛色恢復光澤，反應較靈敏；隔藥灸臍組大鼠治療后與西藥組比較，大鼠行為情況更接近正常組，尤其在施灸過程中，大鼠情緒安定，無煩躁不安癥狀，呈現(xiàn)假寐狀態(tài)，表明隔藥灸臍能改善POF引起的一系列臨床表現(xiàn)，發(fā)揮其無毒副作用的優(yōu)勢，提高大鼠的生存質(zhì)量。

環(huán)磷酰胺是常用的化療藥物，因有毒副作用，能干擾DNA正常代謝，尤其對卵巢、骨髓等分裂增殖活躍的組織影響明顯[11]，常被用于制備POF大鼠模型。本研究結(jié)果亦表明，環(huán)磷酰胺腹腔注射后，與正常組比較，模型組大鼠卵巢質(zhì)量顯著降低。有研究表明，POF的發(fā)病機制是由于卵母細胞過快耗竭所致，卵母細胞的活化及持續(xù)生長發(fā)育依賴于其周圍的顆粒細胞的營養(yǎng)及旁分泌作用[12]。卵巢顆粒細胞凋亡可導致卵泡閉鎖，是POF的根本原因。

Bcl-2和Bax是顆粒細胞凋亡過程中重要的因子，通過形成異二聚體Bcl-2/Bax、同二聚體Bcl-2/Bcl-2或Bax/Bax 的形式影響細胞凋亡。Bcl-2與Bax互為拮抗作用，當體內(nèi)Bax蛋白表達升高，Bax/Bax同二聚體形成增多，Bcl-2的活性下降，從而加速細胞凋亡[13-14]。反之，如果Bcl-2蛋白水平升高，則Bcl-2/Bax異二聚體形成增多，細胞凋亡則被抑制[15]。受凋亡刺激后細胞的生存能力由Bcl-2與Bax比值決定[16-17]。若Bcl-2表達水平升高、比值上調(diào)，抑制細胞凋亡；Bax表達水平升高、比值下調(diào)，促進細胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，Bcl-2與Bax蛋白在各組大鼠卵巢組織中均有表達，大多在卵巢顆粒細胞胞漿中，多以棕色、深棕色著色為主。正常組大鼠Bax表達多見于黃體細胞，卵泡顆粒細胞僅見散在Bax表達；模型組Bax主要表達于顆粒細胞的細胞質(zhì)，在閉鎖卵泡、生長卵泡及竇狀卵泡中表達較明顯；隔藥灸臍組和西藥組卵泡顆粒細胞Bax表達范圍明顯小于模型組。正常組大鼠Bcl-2在各級卵泡顆粒細胞及黃體細胞中表達量均多，模型組Bcl-2在卵泡顆粒細胞僅散在表達，隔藥灸臍組和西藥組Bcl-2表達范圍明顯大于模型組。與正常組比較，模型組大鼠Bcl-2蛋白和mRNA表達明顯降低，Bax蛋白和mRNA表達顯著升高，Bcl-2/Bax蛋白和mRNA表達比值明顯降低，表明環(huán)磷酰胺所致的大鼠POF與大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax因子含量的變化密切相關(guān)。經(jīng)治療后，隔藥灸臍和西藥組大鼠卵巢組織Bcl-2蛋白和mRNA的表達水平顯著升高，Bax蛋白和mRNA的表達水平顯著降低，Bcl-2/Bax蛋白和mRNA表達比值顯著高于模型組，提示隔藥灸臍可以通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax水平，改變Bcl-2/Bax比值，促進卵巢顆粒細胞分裂、抑制其過度凋亡，減少卵泡閉鎖、抑制其凋亡，改善卵巢功能，促進POF的逆轉(zhuǎn)。

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Effects of Herb-partition Moxibustion at Navel on Protein and mRNA Expressions of Bcl-2 and Bax in Rats Model with Premature Ovarian Failure

LU Yan1, TIAN Meng1, SHEN Qing-si1, ZHANG Jing1, SUN Zhen-gao2, ZHANG Yong-chen1, JIA Hong-ling2

Objective To observe the effects of herb-partition moxibustion at navel on the expressions of Bcl-2 and Bax in rats with premature ovarian failure (POF); To explore its mechanism underlying improvement of POF. Methods POF model was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide. Forty-eight Female Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, moxibustion group and Western medicine group, with 12 rats in each group. Rats of moxibustion group were treated with herb-partition moxibustion at navel (Shenque, CV8), 30 min/d, once every other day; rats of Western medicine group were given intragastric dose of estradiol valerate, once a day, for 14 d. The protein and mRNA expressions of Bax and Bcl-2 in ovarian granulosa cells were detected by immunohistochemal method, Western blot and qRT-PCR, respectively. Results The weights of ovaries in the model group rats were significantly lower than those in the normal group (<0.05). The expressions of Bcl-2 and Bax protein in ovarian tissue of each group were mainly expressed brown coloration and in the cytoplasm of cells. The range of Bax protein in granulosa cells of moxibustion group and Western medicine group was significantly less than that in model group. The range of Bcl-2 in moxibustion group and Western medicine group was significantly larger than that in model group. Compared with the normal group, the expressions of Bcl-2 protein and mRNA in the model group rats significantly decreased (<0.05,<0.01), and the expression of Bax protein and mRNA significantly increased (<0.05,<0.01). The expression level of Bcl-2 protein and mRNA was significantly higher in the moxibustion group and in the western medicine group than that in the model group (<0.05,<0.01). The expression level of Bax protein and mRNA in the moxibustion group was significantly lower than that in the model group (<0.05,<0.01). Conclusion The herb-partition moxibustion at navel can improve the function of ovaries by up regulating the expression of Bcl-2 and down regulating the expression of Bax in POF rats model.

premature ovarian failure; herb-partition moxibustion at navel; Shenque (CV8); Bcl-2; Bax; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.010

R245

A

1005-5304(2017)07-0040-05

國家自然科學基金（81373676）；山東中醫(yī)藥大學橫向項目(730032)

賈紅玲，E-mail：zhangyc58@sina.com

（2016-11-25）

（2017-01-24；編輯：華強）