馮 果，李 瑋，何 新，吳增光，鄭傳奇，田小芳，冷安碧，李 月（.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 30093；.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 55005；3.貴州省貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院院士工作站，貴陽(yáng) 55005）

·民族醫(yī)藥·

正交試驗(yàn)結(jié)合綜合評(píng)分法優(yōu)化苗藥了哥王的提取工藝Δ

馮 果1，2，3＊，李 瑋2，3，何 新1，吳增光1，鄭傳奇2，田小芳2，冷安碧2，李 月2（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3.貴州省貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院院士工作站，貴陽(yáng) 550025）

目的：優(yōu)化了哥王的提取工藝。方法：以了哥王的有效成分傘形花內(nèi)酯、西瑞香素的含量和浸膏收率作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，以溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、滲漉速度為考察因素，采用單因素試驗(yàn)對(duì)了哥王的3種提取方法（滲漉法、煎煮法和回流提取法）進(jìn)行比較，篩選最優(yōu)提取方法；再用正交試驗(yàn)對(duì)最優(yōu)提取方法的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并驗(yàn)證。結(jié)果：提取方法的綜合評(píng)分排序?yàn)闈B漉法＞回流提取法＞煎煮法，以滲漉法更優(yōu)。滲漉法的最優(yōu)工藝條件為滲漉溶劑70%乙醇，溶劑量為14倍藥材量，滲漉速度為5 m L/（min·kg）；驗(yàn)證試驗(yàn)中3次試驗(yàn)的綜合評(píng)分分別為98.3、99.3、98.8（RSD＝0.51%，n＝3）。結(jié)論：了哥王有效成分的提取方法選用滲漉法，優(yōu)選出的滲漉法提取工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

了哥王；提取工藝；正交試驗(yàn)；傘形花內(nèi)酯；西瑞香素；滲漉法

了哥王[Wikstroemia indica（Linn.）C.A.Mey.]為瑞香科蕘花屬植物[1]，為南方常用苗藥，主要分布于廣西、廣東、江西、貴州等地[2]，其根、莖、葉和果實(shí)均可入藥。了哥王性寒、味苦、辛、微溫、有大毒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛等功效。目前，從了哥王中分離得到的80多種化合物可分為十大類[3-12]：香豆素類、木脂素類、黃酮類、蒽醌類、甾族類、皂苷類、萜類、酰胺類、多糖和揮發(fā)油，此外，還含有大量的酯、酮、烯及醇類化合物等。了哥王具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧、利尿、引產(chǎn)、鎮(zhèn)咳袪痰等藥理作用[13-15]，臨床廣泛用于急性扁桃體炎、慢性支氣管炎、頸淋巴結(jié)腫大、乳腺炎等疾病的治療，另外對(duì)肝炎、肝硬化、肝腹水、肢體疼痛、帶狀皰疹、皮下剝離傷、坐骨神經(jīng)痛等也有一定的療效，還可用于治療多種癌癥如乳腺癌、惡性淋巴癌、肺癌及各種體表癌[16]。了哥王如得到合理開發(fā)利用，則有希望成為最有開發(fā)價(jià)值的民族藥之一，市場(chǎng)潛力巨大。本研究主要以了哥王提取物主要有效成分西瑞香素和傘形花內(nèi)酯含量為指標(biāo)，對(duì)了哥王有效成分的提取方法進(jìn)行篩選，再對(duì)最優(yōu)提取方法的工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，確定其最優(yōu)提取工藝，為了哥王的深入開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；粉碎機(jī)（浙江大鵬機(jī)械有限公司）；LT1002E型電子天平（常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司）；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004型電子分析天平（上海衡平儀器儀表廠）；HH-S4型水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6020型減壓真干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KQ-3200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

了哥王藥材（2016年1月10日采購(gòu)于廣西壯族自治區(qū)玉林市玉州區(qū)玉林銀豐國(guó)際中藥港，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院李瑋副教授鑒定為正品）；西瑞香素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111758，純度：＞98%）；傘形花內(nèi)酯對(duì)照品（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號(hào)：BW 5534，純度：＞98%）；乙醇等為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸水率的測(cè)定

稱取了哥王藥材粗粉100 g，置于具塞廣口瓶中，加水分別浸泡20、30、45m in與1、2、12 h后取出，稱取濕藥材的質(zhì)量，計(jì)算其吸水率[（藥材濕質(zhì)量－藥材干質(zhì)量）/藥材干質(zhì)量×100%]。結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)吸水率分別為 320.13%、380.56%、388.11%、389.19%、390.15%、391.14%。藥材粗粉在20min內(nèi)吸水很快，吸水量為原藥材的3.2倍；到30min，仍有較大的吸水率，吸水率從原藥材的3.2倍增加到3.8倍；從30min到45min，增加的幅度較小，延長(zhǎng)其浸泡時(shí)間到12 h，也未見(jiàn)明顯吸水，吸收曲線呈直線，故選擇該藥材操作浸泡時(shí)間為30m in。

2.2 提取方法

2.2.1 滲漉法 取了哥王藥材粗粉100 g，用2.5倍量70%乙醇浸潤(rùn)1 h，裝筒、浸泡48 h，按3m L/（min·kg）的流速滲漉，用12倍量的70%乙醇滲漉至無(wú)色無(wú)味。收集滲漉液，混合，回收乙醇，濃縮，干燥成干浸膏，粉碎成細(xì)粉，得了哥王乙醇提取物浸膏粉。

2.2.2 煎煮法 稱取了哥王藥材粗粉100 g，置于煎煮容器中，第1次加12.8倍量水，浸泡30min，煎煮1.5 h；第2次加6倍量水，煎煮1.0 h；第3次加6倍量水，煎煮0.5 h；過(guò)濾，合并3次煎煮液，濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉備用。

2.2.3 回流提取法 取了哥王藥材粗粉100 g，置于回流提取裝置中，第1次加12.8倍量70%乙醇，浸泡30 min，回流提取1.5 h；第2、3次分別加6倍量70%乙醇，各回流提取1 h；過(guò)濾，合并3次提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉備用。

2.3 傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品33.00、21.00mg，置于50m L量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.660、0.420mg/m L的對(duì)照品貯備液，4保存，備用。取貯備液稀釋制成二者質(zhì)量濃度分別約為0.330、0.210 mg/m L的混合對(duì)照品溶液，4保存，備用。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取了哥王提取物粉末約0.5 g，置于具塞三角燒瓶中，加甲醇30m L超聲（超聲功率：150W，超聲頻率：40 kHz）提取30m in，過(guò)濾，揮干濾液。殘?jiān)眉状既芙?，溶液轉(zhuǎn)移至10m L量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C1（8250mm×4.6mm，5μm）；紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)：0～15min，324 nm；15～45min，346 nm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5m in，22%～25% A；5～15m in，25%～25%A；15～20m in，25%～30%A；20～25m in，30%～33%A；25～30m in，33%～30%A；30～35m in，30%～28%A；35～40m in，28%～25%A；40～45 m in，25%～22%A）；流速：1 m L/min；柱溫：30；進(jìn)樣量：20μL。在此條件下分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液（滲漉法提取物）注入色譜儀。結(jié)果表明，傘形花內(nèi)酯和西瑞香素成分能與其他成分達(dá)到較好的分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于3 000，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10.0m L至10m L量瓶中，甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得傘形花內(nèi)酯回歸方程為y＝57.086x+37.736（r＝0.999 7），西瑞香素回歸方程為y＝41.162x+2.962 8（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，傘形花內(nèi)酯、西瑞香素分別在0.33～6.60μg、0.21～4.20μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果，精密度試驗(yàn)中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素峰面積的RSD分別為1.73%、1.51%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)中二者含量的RSD分別為2.25%、0.73%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中48 h內(nèi)二者峰面積的RSD分別為0.74%、1.30%（n＝7）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中二者平均回收率分別為98.73%、99.98%（RSD分別為2.59%、1.84%，n＝9）。2.3.6 含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液20μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各提取物中有效成分的含量。

2.4 浸膏收率測(cè)定

將“2.2”項(xiàng)下3種方法提取的浸膏置于蒸發(fā)皿中，干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算浸膏收率，浸膏收率（%）＝浸膏質(zhì)量/藥材粗粉質(zhì)量×100%。

2.5 3種提取方法結(jié)果比較

以傘形花內(nèi)酯、西瑞香素的含量和浸膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其加權(quán)評(píng)分分別為30、30、40，綜合評(píng)分（Y）＝各方法樣品中傘形花內(nèi)酯的含量/3種方法樣品中傘形花內(nèi)酯含量的最大值×30+各方法樣品中西瑞香素的含量/ 3種方法樣品中西瑞香素含量的最大值×30+各方法樣品中浸膏收率/3種方法樣品中浸膏收率最大值×40，以綜合評(píng)分值的大小評(píng)價(jià)提取方法，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同提取方法評(píng)價(jià)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Evaluation results of different extraction methods（n＝3）

由表1可知，在3種提取方法中，各單一及綜合指標(biāo)高低順序均為滲漉法＞回流提取法＞煎煮法，即在這3種提取方法中以滲漉法的提取效果最好，選此方法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化滲漉法提取工藝

2.6.1 因素與水平的確立 在滲漉法中，影響有效成分提取的因素主要有溶劑量（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、滲漉速度（C），根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用3因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表2。

表2 因素與水平Tab 2 Factorsand levels

2.6.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 稱取了哥王粗粉30 g，共9份，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取、溶液制備、測(cè)定并計(jì)算相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表3直觀分析表明，以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，由極差（R）的大小可知，影響因素A＞B＞C，其中A3＞A2＞A1、B2＞B3＞B1、C2＞C1＞C3，即提取工藝最優(yōu)條件為A3B2C2；又由表4方差分析表明，A與B有顯著影響（P＜0.05）?？紤]到實(shí)際提取過(guò)程中的成本及提取效率因素，綜合后確定其最優(yōu)提取工藝條件為A3B2C2，即加14倍量70%乙醇，以5m L/（min·kg）流速進(jìn)行滲漉提取。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and resu ltsof orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis results

2.7 提取液的濃縮干燥工藝的篩選

按優(yōu)化的提取工藝參數(shù)分別提取2批藥液，一批按常壓濃縮干燥法（溫度80），另一批采用低壓真空濃縮干燥法（溫度60，真空度0.07～0.08MPa），測(cè)定其浸膏收率和傘形花內(nèi)酯、西瑞香素的含量，篩選濃縮干燥方法。結(jié)果兩種方法下3個(gè)指標(biāo)的平均值分別為9.57%、9.68%，0.044 9、0.045 2mg/g，2.226、2.312mg/g，性狀分別為棕褐色塊狀固體和棕褐色疏松固體。這表明兩種方法比較各指標(biāo)差異不大，但采用低壓真空濃縮干燥法所得浸膏干燥疏松，故選擇其為了哥王提取液的濃縮干燥方法。

2.8 工藝驗(yàn)證

稱取了哥王藥材3批，每批10 kg，按優(yōu)化的提取工藝條件，進(jìn)行提取、濃縮、干燥，并測(cè)定其傘形花內(nèi)酯、西瑞香素的含量和浸膏收率。結(jié)果，3次試驗(yàn)中傘形花內(nèi)酯含量分別為0.044 3、0.044 0、0.045 0mg/g，西瑞香素的含量分別為2.248、2.285、2.257mg/g，浸膏收率分別為9.95%、10.14%、9.93%，綜合評(píng)分分別為98.3、99.3、98.8（RSD＝0.51%，n＝3），提示優(yōu)化的提取工藝重現(xiàn)性好、穩(wěn)定、可行。

3 討論

在前期進(jìn)行的含量測(cè)定預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)多種流動(dòng)相組成（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液）及洗脫方式（等度、梯度）進(jìn)行了考察，并對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)（324、350、346 nm）、流速（0.8、1.0m L/m in）、柱溫（25、30、35）等進(jìn)行了篩選，最后確定了乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相、梯度洗脫、不同時(shí)間切換波長(zhǎng)（0～15min，324 nm；15～45min，346 nm）的條件，結(jié)果表明各峰間分離度較好、基線平穩(wěn)、試驗(yàn)重復(fù)性較好、含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

了哥王的根及莖非常堅(jiān)硬，纖維性非常強(qiáng)，含糖、淀粉類及水溶性的成分少，大多數(shù)有效成分易溶于乙醇及有機(jī)溶劑，但在臨床及藥物生產(chǎn)過(guò)程中不可能大量使用有毒及對(duì)環(huán)境污染較大的有機(jī)溶劑，故在研究過(guò)程中大多使用水及不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑。在前期研究中，筆者用浸漬法提取了哥王的有效成分，但該方法提取周期長(zhǎng)，提取過(guò)程中提取溶劑不易形成濃度差，故提取效率低；另外李姣姣等[17]采用超聲波結(jié)合微波提取法對(duì)了哥王的黃酮類成分進(jìn)行了提取，該方法也只是針對(duì)某一類有效部位的提取。了哥王的臨床應(yīng)用大多以煎劑為主，但在近幾年的研究過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)了哥王的大多有效成分不僅不易溶于水，而且容易被熱破壞，故結(jié)合實(shí)際，筆者對(duì)了哥王的常用提取方法煎煮法、滲漉法和回流提取法進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，滲漉法的提取效果更好，有效成分及浸膏收率相對(duì)較高，加熱對(duì)藥物的破壞小，故選擇滲漉法為了哥王藥材有效成分的最優(yōu)提取方法。

西瑞香素和傘形花內(nèi)酯是了哥王香豆素類成分的主要有效成分，也是了哥王抗腫瘤、抗炎、抗真菌、抗病毒、抗焦慮的有效成分[9，16，18-19]，故選擇二者含量為提取工藝條件優(yōu)化的主要指標(biāo)。

了哥王為常用苗藥，其療效確切，但毒性較大[20]，在《嶺南采藥錄》《廣西中藥志》等著作中均有“大毒”“有毒”的記載。本研究為其后續(xù)毒性、藥效、藥理及炮制增效減毒機(jī)制的研究及進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的基礎(chǔ)。

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Extraction Technology Optim ization of M iao M edicine Wikstroem ia indica by Orthogonal Test and Com p rehensive Scoring M ethod

FENG Guo1，2，3，LIWei2，3，HE Xin1，WU Zengguang1，ZHENG Chuanqi2，TIAN Xiaofang2，LENG Anbi2，LIYue2（1. School of Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2. School of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；3.Academician Workstation，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine in Guizhou，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To optim ize the extraction technology of Wikstroemia indica.METHODS：Using the active ingredient contents of umbelliferone and daphnoretin，and extraction yield as comprehensive evaluation indexes，solvent dosage，ethanol volume fraction，percolation rate as investigation factors，single factor testwas conducted to compare the 3 extractionmethods（percolation method，boiling method，reflux extraction method），and screen the optim ized one；and the technology conditions of optim ized method were optim ized and verified.RESULTS：The comprehensive score ordered as percolation method，reflux extraction method，boiling method，which was better by percolation method.The optimal technology conditions was as follow as percolation solvent of 70%ethanol，14-fold herbs at percolation rate of 5m L/（min·kg）；the comprehensive scores in 3 testswere 98.3，99.3，98.8（RSD＝0.51%，n＝3）.CONCLUSIONS：Percolation method is optim ized for extracting active ingredient of W.indica，which is stable and reproducible.

Wikstroemia indica；Extraction technology；Orthogonal test；Umbelliferone；Daphnoretin；Percolationmethod

R284.2

A

1001-0408（2017）16-2216-04

2016-09-20

2016-12-14）

（編輯：劉 萍）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（No.2007BAI48B08-1）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201610662025）；國(guó)家工程技術(shù)研究中心組建項(xiàng)目（No.2014FU125Q09）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局?。ㄊ校┘?jí)中藥炮制技術(shù)傳承基地建設(shè)項(xiàng)目（No.國(guó)中醫(yī)科技〔2015〕136號(hào)）；貴州省高校工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目（No.黔教合KY字〔2012〕021號(hào)）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥新制劑與新技術(shù)、藥動(dòng)學(xué)。電話：0851-88233090。E-mail：453989352@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.15