劉 謙，劉麗麗，劉曉慧，張浛赫，王 宇，顏 紅，張漢民

(保定出入境檢驗(yàn)檢疫局, 河北保定 071001)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)乳膠氣球中的亞硝胺及可亞硝化物

劉 謙，劉麗麗，劉曉慧，張浛赫，王 宇，顏 紅，張漢民

(保定出入境檢驗(yàn)檢疫局, 河北保定 071001)

參照EN71：12—2013，對(duì)氣球中的13種揮發(fā)性亞硝胺及可亞硝化物進(jìn)行了遷移提取、分離凈化，并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行了定性和定量分析。氣球中的N-亞硝胺及前體物檢出限為0.05 mg/kg；回收率85.2%～113.6%，精密度3.23%～9.12%。運(yùn)用該方法分析的氣球樣品中，N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二正丁基胺（NDBA）及其前體物檢出頻率最高，占N-亞硝胺總遷移量的比例最大；N-甲基-N-亞硝胺苯胺（NMPhA）、N-亞硝基-二乙醇胺（NDELA）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基-雙-異丙基胺（NDiPA）、N-亞硝基二異丁胺（NDiBA）、N-亞硝基二異壬基胺（NDiNA）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亞硝基二芐胺（NDBZA）及其前體物均未檢出。該方法前處理過程簡(jiǎn)單，靈敏度高，適用于批量樣品的快速分析。

N-亞硝胺；可亞硝化物；氣球；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

0 前 言

N-亞硝胺是一類有—N—N=O結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，是目前已知最主要的強(qiáng)致癌物之一[1-8]。N-亞硝二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA） 屬于揮發(fā)性N-亞硝胺，具有一定的急性毒性、致癌性、致畸性和致突變性。亞硝胺廣泛存在于土壤、橡膠制品、皮革、化妝品、煙草及腌制食品中，可通過呼吸道、消化道等途徑進(jìn)入人體[9-15]。食品、煙草、化妝品和橡膠制品等都可能存在N-亞硝胺的污染。橡膠制品中的N-亞硝胺主要來(lái)自以仲胺為基礎(chǔ)的硫化促進(jìn)劑和硫磺給予體，這些物質(zhì)與空氣或配合劑中的氮氧化物反應(yīng)生成穩(wěn)定的N-亞硝胺。

氣球是一種常見的兒童橡膠玩具，在其加工過程中，硫化是最重要工藝之一，在高溫硫化、最終成型過程中會(huì)使用到硫化劑和硫化促進(jìn)劑，為此氣球中檢出N-亞硝胺屢見不鮮。荷蘭學(xué)者分別于2002年7月和2004年7月對(duì)市場(chǎng)上氣球樣品中N-亞硝胺及其前體物的遷移量進(jìn)行了普查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NDMA、NDBA（N-亞硝基二正丁基胺）及其前體物在氣球樣品中被普遍檢出。為此，德國(guó)政府將氣球中N-亞硝胺及前體物的遷移限量設(shè)定為0.05 mg/kg和5 μg/dm2。2011年，幸苑娜等[4]用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)購(gòu)自超市的氣球樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NDMA、NDEA 及NDBA均有檢出。鑒于亞硝胺可對(duì)人體產(chǎn)生的毒害影響，歐盟指令EN 12868—1999明確規(guī)定在彈性體、橡膠奶嘴、安撫奶嘴中N-亞硝胺的遷移量不得超過10 μg/kg。2009年6月，歐盟新玩具指令2009/48/EC發(fā)布，歐盟統(tǒng)一禁用300多種亞硝胺類化合物，并于2013年6月首次發(fā)布了EN 71：12—2013《玩具安全-第12部分：N-亞硝胺和N-亞硝基化合物》標(biāo)準(zhǔn)，限定了供3歲以下兒童使用的彈性體材料制造的玩具（含氣球）限量為0.05 mg/kg。我國(guó)對(duì)橡膠、彈性體材料中的N-亞硝胺也加以限制，規(guī)定其含量不得超過500 μg/ kg[16-20]。

面對(duì)美國(guó)和歐盟越來(lái)越嚴(yán)格的氣球中亞硝胺的限量要求，建立合理、快速、準(zhǔn)確的氣球中N-亞硝胺及可亞硝化物含量的測(cè)定方法尤為重要。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)氣球中13種亞硝胺及可亞硝化物進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)檢出情況進(jìn)行深入分析。結(jié)果表明，該方法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便。

2 試 驗(yàn)

2.1 儀器和設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters TQD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ESI源），美國(guó)Waters公司；梅特勒天平，瑞士梅特勤公司；PНS-3C精密рН計(jì)（上海雷磁公司）；SНA-B恒溫水浴振蕩器，常州國(guó)華電器公司。

2.2 試劑與材料

N-甲基-N-亞硝胺苯胺（NMPhA，純度＞99.5%）、N-亞硝基-乙二醇胺（NDELA，97.7%）、N-亞硝基嗎啉（NMOR，99.0%）、N-亞硝基二丙胺（NDPA，98.8%）、N-亞硝基-正二丁胺（NDBA，99.1%）、N-亞硝基哌啶（NPIP，99.2%）、N-亞硝基二乙胺（NDEA，99.5%）、N-亞硝基-雙-異丙基胺（NDiPA，99.0%）、N-亞硝基二異丁胺（NDiBA，97.0%）、N-亞硝基二異壬基胺（NDiNA，96.0%）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA，97.0%）、N-亞硝基二芐胺（NDBZA，96.0%）、N-亞硝基二甲基胺（NDMA，99.5%），均購(gòu)自德國(guó)Dr.公司；碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸鉀、亞硝酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2.3 樣品前處理

2.3.1 模擬唾液

參考EN 71：12—2013標(biāo)準(zhǔn)，將碳酸氫鈉4.2 g、氯化鈉0.5 g、碳酸鉀0.2 g和亞硝胺30.0 mg溶于蒸餾水中，用蒸餾水稀釋至900 mL,用0.1 mоl(xiāng)/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)рН至9.0，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度線。

2.3.2 N-亞硝胺處理過程

把氣球縱向切成兩半，獲得近對(duì)稱塊；根據(jù)樣品質(zhì)量再縱向剪成兩半，再次得到兩個(gè)近對(duì)稱塊。稱取3.5～4.5 g樣品，于50 mL錐形瓶中加入10倍樣品量的、預(yù)熱至（40+2）℃的模擬唾液，確保樣品完全浸入[必要時(shí)加入已預(yù)熱至（40+2）℃的玻璃珠]，該浸泡液于（40+2）℃的水浴中浸泡（60+3）min。將測(cè)試液轉(zhuǎn)移至50 mL具塞量筒中，該測(cè)試液用于N-亞硝胺的測(cè)試。

2.3.3 亞硝化處理過程

取2.3.1的測(cè)試液5 mL，于離心管中加入0.5 mL的1 mоl(xiāng)/L 鹽酸溶液，蓋緊混勻，于（40+2）℃水浴中保持（30+1）min；加入1.0 mL 的 1 mоl(xiāng)/L氫氧化鈉溶液，混合均勻。該測(cè)試液即為可亞硝化的N-亞硝胺的測(cè)試液。

2.4 儀器分析

2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：CNW C18，100 A，5 μm，長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑2.1 mm；流動(dòng)相：洗脫程序詳見表1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；氣簾氣：50 L/h；霧化氣：800 L/h；離子源溫度：120 ℃。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量詳見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件

本方法選擇了EN 71：12—2013的前處理?xiàng)l件，這主要是因?yàn)樵摲椒鞒毯?jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間和人力，可以同時(shí)檢測(cè)大量樣品，有機(jī)試劑的使用量小，減輕了對(duì)人體和環(huán)境的污染。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 流動(dòng)相的選擇

在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析中，流動(dòng)相的組成既影響目標(biāo)化合物的色譜峰形和分離效果，又影響其離子化效率和質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。本方法比較了甲醇-水。乙腈-水對(duì)化合物在C18色譜柱上分離的效果。結(jié)果表明，在甲醇-水、乙腈-水體系中，13種化合物均能得到對(duì)稱的峰形，考慮到在甲醇水體系中更容易形成[M+Н]+,本文選用甲醇-水作為流動(dòng)相。為了進(jìn)一步提高化合物的離子化效率，在純水體系里分別添加了0.05%、0.1%、0.2%三個(gè)濃度的甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸濃度不同對(duì)出峰的對(duì)稱性和靈敏度都有影響。當(dāng)流動(dòng)相添加0.1%的甲酸時(shí)，峰形對(duì)稱、信噪比高、靈敏度好，因此本方法最終選擇甲醇-甲酸（0.1%）水溶液作流動(dòng)相。

3.2.2 質(zhì)譜條件的選擇

13種N-亞硝胺類化合物均含有—N—N=O結(jié)構(gòu)，在ESI+模式下均能夠通過加合Н離子得到準(zhǔn)分子離子峰。在確定待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)的母離子和子離子的基礎(chǔ)上，對(duì)離子源溫度、霧化氣流量及溫度、碰撞電壓等條件進(jìn)行優(yōu)化。分別將13種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品用初始流動(dòng)相稀釋成1 μg/mL的工作液，在ESI+的模式下對(duì)各分析物進(jìn)行質(zhì)譜優(yōu)化，通過選擇離子監(jiān)測(cè)優(yōu)化去簇電壓，再通過優(yōu)化碰撞能量對(duì)子離子進(jìn)行全掃描，最終選擇響應(yīng)值最大、豐度最強(qiáng)、干擾最小的為子離子（表2）。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，13種N-亞硝胺類化合物分別被配置成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以信噪比S/N=3 計(jì)算儀器檢出限，其線性方程和相關(guān)系數(shù)詳見表3。13種亞硝胺在線性范圍為10～200 ng/mL之間線性關(guān)系良好，線性方程相關(guān)系數(shù)r2均大于等于0.990。檢出限為0.05 mg/kg。

表3 13種亞硝胺的曲線線性方程及線性范圍

3.4 回收率及精密度

按照2.3方法對(duì)未檢出亞胺類物質(zhì)的空白氣球樣品做13種亞硝胺的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加水平分別為50、100、500 ng/mL，每組有6個(gè)平行樣品，上機(jī)測(cè)試N-亞硝胺物質(zhì)及其前體物的含量。通過計(jì)算得到目標(biāo)物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果詳見表4。13種亞硝胺的回收率為85%～113%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.23%～9.12%。

表4 13種亞硝胺的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)

3.5 樣品結(jié)果分析

3.5.1 氣球中13種N-亞硝胺的平衡遷移量

根據(jù)文獻(xiàn)[4,8]介紹，兒童接觸氣球的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于接觸奶嘴的時(shí)間，EN 71：12—2013將模擬遷移時(shí)間由24 h改為1 h。為了確定氣球制備時(shí)的溫度和時(shí)間對(duì)氣球中亞硝胺及可亞硝化物含量的影響，按表5的條件制作了照EN 71：12—2013的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)氣球做了模擬遷移實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表5 乳膠氣球制備條件

從表6可以看出，所分析的16個(gè)樣品中，NDMA的檢出率最高，在12個(gè)樣品中有檢出，檢出含量0.041 2～1.980 0 mg/kg；其次是NDEA，有10個(gè)樣品檢出，平衡遷移量0.025 4～1.590 0 mg/kg。NDBA的前體物檢出也較多；在NDEA和NDMA的前體物同樣有檢出，且前體物遷移量高于NDEA和NDMA的遷移量，平衡遷移量分別為0.125～1.590 mg/kg和0.325～1.770 mg/kg；而NDBA在A5樣品中有檢出，但是其前體物未檢出，在A7、A8、B7、B6、B8前體物有檢出，但是亞胺類物質(zhì)卻未檢出。其他10種亞胺類物質(zhì)及前體物均未檢出。這一現(xiàn)象在荷蘭RIVM實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果中也有體現(xiàn)。在本研究中，NDBA及前體物在樣品中的檢出頻率不一致，如A5-1檢出但A5-2未檢出，造成這種現(xiàn)象的原因有待于進(jìn)一步研究。

表6 氣球中N-亞硝胺遷移量

（續(xù)前表）

3.5.2 溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞胺類物質(zhì)的影響

從表5和6的結(jié)果可以得出隨著溫度的升高，亞硝胺及可亞硝化物的含量會(huì)隨之增加的結(jié)論。當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí)，亞硝胺及可亞硝化物均沒有檢出；當(dāng)溫度高于40 ℃，NDMA、NAEA開始檢出并隨著溫度的增高含量逐漸增加。

本文分別實(shí)驗(yàn)了制備時(shí)間為3.0和3.5 h對(duì)氣球中N-亞硝胺和可亞硝化物含量的影響，結(jié)果表明，在相同溫度下制備時(shí)間為3.5h的比3 h的氣球中N-亞硝胺的含量及可亞硝化物的含量高。

4 結(jié) 論

采用EN 71：12—2013 對(duì)氣球中亞硝胺及可亞硝化物進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其前處理過程簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度高。另外，氣球生產(chǎn)過程中的反應(yīng)時(shí)間和溫度都對(duì)氣球中的亞硝胺及可亞硝化物含量有一定影響：隨著反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的增加，氣球中可亞硝化物和亞硝胺的含量都會(huì)增加。氣球企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)該適當(dāng)控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，以減少亞硝胺的生成。

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[責(zé)任編輯：朱 胤]

TQ330.7+2

B

1671-8232(2017)05-0030-06

2016-04-25

劉謙（1980— ），女，碩士，工程師，主要從事食品中藥物殘留、各類添加劑、輕紡制品有毒有害物質(zhì)檢測(cè)工作。