李瑞芳

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450000）

超聲波輔助提取黑果腺肋花楸黃酮及其抗運(yùn)動疲勞研究

李瑞芳

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450000）

以黑果腺肋花楸作為原料，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮工藝，并通過小鼠試驗(yàn)研究黑果腺肋花楸黃酮抗運(yùn)動疲勞功能。結(jié)果表明，超聲波輔助提取黃酮最佳參數(shù)為超聲功率70 W、超聲溫度61℃、超聲時(shí)間124 min，此時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率可達(dá)95.64%。影響黑果腺肋花楸黃酮提取率的因素由強(qiáng)到弱為超聲溫度>超聲時(shí)間>超聲功率。小鼠經(jīng)灌胃黑果腺肋花楸黃酮后，小鼠力竭游泳時(shí)間顯著延長且濃度越高效果越明顯，血乳酸含量與未灌胃黃酮組小鼠相比顯著降低，由此可說明，黑果腺肋花楸黃酮對小鼠具有較強(qiáng)的抗運(yùn)動疲勞功能。

響應(yīng)面；超聲波；黑果腺肋花楸；黃酮；抗疲勞

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又被稱為不老莓，營養(yǎng)價(jià)值很高，果實(shí)含有大量的多酚、黃酮以及花色苷等成分，具有多重功能[1-2]，有研究表明，其內(nèi)部含有的多酚在已知植物果實(shí)中含量最高，其內(nèi)部的花青素含量也很高，這些功能成分能夠?qū)C(jī)體起到降血壓、抗氧化以及清除機(jī)體的自由基等功效[3-4]；目前黑果腺肋花楸產(chǎn)品較少，開發(fā)利用率較低，需要研究其功能成分有利于其產(chǎn)品開發(fā)；超聲波法是現(xiàn)代較新型的技術(shù)之一，具有環(huán)保、效率高等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，很多活性成分提取均采用超聲波法輔助提取[7-8]，本研究采用超聲波法輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其最佳工藝參數(shù)，同時(shí)研究黑果腺肋花楸對小鼠的抗運(yùn)動疲勞功能，可為黑果腺肋花楸功能性產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸：陜西康躍生物科技有限公司；Al（NO3）3、無水乙醇、NaNO2等均為分析純：淄博市臨淄飛碩化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上?？道噬锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子天平：德州市昊誠實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TGL-16G型變頻高速離心機(jī)：北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司；AUT-M型超聲波發(fā)生器：深圳市潤正洗凈設(shè)備有限公司；721G型可見分光光度計(jì)：上海金梟電子有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：南京東邁科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮工藝流程

黑果腺肋花楸→洗滌→烘干→粉碎→過篩→超聲波輔助乙醇提取→離心分離→過濾→濾液濃縮→干燥→黃酮→待測

1.3.2 黑果腺肋花楸黃酮提取單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 超聲功率對黃酮提取率的影響

在超聲溫度60℃、超聲時(shí)間120 min時(shí)，超聲功率分別為 50、60、70、80、90 W 時(shí)，以黑果腺肋花楸黃酮提取率為考核指標(biāo)，分析超聲功率對黃酮提取率的影響。

1.3.2.2 超聲溫度對黃酮提取率的影響

在超聲功率70 W、超聲時(shí)間120 min時(shí)，超聲溫度分別為 50、55、60、65、70℃時(shí)，以黑果腺肋花楸黃酮提取率為考核指標(biāo)，分析超聲溫度對黃酮提取率的影響。

1.3.2.3 超聲時(shí)間對黃酮提取率的影響

在超聲功率70 W、超聲溫度60℃時(shí)，超聲時(shí)間分別為 80、100、120、140、160 min 時(shí)，以黑果腺肋花楸黃酮提取率為考核指標(biāo)，分析超聲時(shí)間對黃酮提取率的影響。

1.3.3 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素結(jié)果，以超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C），以黃酮提取率（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定超聲波輔助提取黃酮最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-10]

精確稱取蘆丁標(biāo)品1 g置于燒杯中，加入乙醇（75%）定容至100 mL，靜止20 min后，再從中取5 mL于容量瓶中，再加乙醇定容至100mL，可得到0.5mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中分別取 0、1、2、3、4、5、6 mL 溶液于25 mL具塞比色管里，再加入無水乙醇至10 mL，再加5%的NaNO20.8 mL，混勻后靜置5min，再加10%的Al（NO3）30.8 mL，混勻后靜置5 min，再加NaOH溶液（3%）5 mL，再加乙醇至 25 mL，混勻后靜置 20 min，分別于510 nm波長處測吸光度，同時(shí)用去離子水做對照。以蘆丁質(zhì)量濃度為X軸、吸光值為Y軸，得回歸方程：Y=0.421X＋0.002，R2=0.999 8。

1.3.5 黃酮提取率的測定[11-12]

精確稱取5 mL方法1.3.1中制取的濃縮液，同樣加到25 mL具塞比色管中，參照1.3.4中試驗(yàn)方法，測溶液吸光值，由回歸方程可計(jì)算出黃酮含量，再計(jì)算黃酮提取率。

1.3.6 小鼠抗疲勞試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)要求，隨機(jī)取80只KM雄性小鼠，重量為（22±0.5）g，SPF級，長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（湘）2014-0011，根據(jù)體重將小鼠組成4組，每組數(shù)量為20只。規(guī)定第1組小鼠為對照組、第2、3、4組均灌胃黑果腺肋花楸黃酮，劑量分別為0.1 mL/10 g鼠重、0.2 mL/10 g鼠重、0.3 mL/10 g鼠重，持續(xù)灌胃30 d后測小鼠各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.6.1 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[13-14]

小鼠經(jīng)末次灌胃黑果腺肋花楸30 min后，在其尾部負(fù)重體重5%的鐵絲，使小鼠在標(biāo)準(zhǔn)小鼠試驗(yàn)游泳箱中游泳，游泳箱深度35 cm，水溫（25.0±1.0）℃，當(dāng)小鼠頭部浸入水下10 s后無法浮到水面上即為體力耗竭，記下小鼠自游泳開始至體力耗竭的時(shí)間，作為小鼠游泳時(shí)間。

1.3.6.2 血乳酸含量測定[15]

小鼠經(jīng)末次灌胃黑果腺肋花楸30 min后，將小鼠置于游泳箱中進(jìn)行游泳。分別于游泳前、游泳后10 min、游泳10 min休息20 min等3個(gè)不同時(shí)間段，在小鼠眼眶靜脈叢用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行采血，參照試劑盒法檢測小鼠全血乳酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響

超聲功率對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響見圖1。

根據(jù)圖1，當(dāng)超聲功率為50 W時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率最低，隨著超聲功率的增大，黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)超聲功率達(dá)到70 W時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率最高。繼續(xù)增大超聲功率后，黑果腺肋花楸黃酮提取率幾乎不變，原因可能為當(dāng)超聲功率為70 W時(shí)已經(jīng)可滿足黃酮的提取，使得黃酮能夠充分溶出，故繼續(xù)增大超聲功率提取率幾乎不變，因此選擇超聲功率60、70、80 W為響應(yīng)面研究水平。

圖1 超聲功率對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of black fruit Aronia flavonoids

2.1.2 超聲溫度對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響

超聲溫度對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根據(jù)圖2，當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率最低，當(dāng)超聲溫度升高后，黑果腺肋花楸黃酮提取率迅速增大，當(dāng)超聲溫度達(dá)到60℃時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率達(dá)到最高，繼續(xù)提高超聲溫度后，黑果腺肋花楸黃酮提取率迅速下降，原因可能是溫度過高后使得黃酮損失過多，因此選擇超聲溫度55、60、65℃為響應(yīng)面研究水平。

2.1.3 超聲時(shí)間對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響見圖3。

根據(jù)圖3，當(dāng)超聲時(shí)間為80 min時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率最低，隨著超聲時(shí)間的延長，黑果腺肋花楸黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮提取率最高。繼續(xù)延長超聲時(shí)間，黑果腺肋花楸黃酮提取率幾乎不變，原因可能是當(dāng)超聲一定時(shí)間后黃酮已經(jīng)完全被提出，因此繼續(xù)延長時(shí)間效果不佳，選擇超聲時(shí)間為100、120、140 min為響應(yīng)面研究水平。

圖3 超聲時(shí)間對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of black fruit Aronia flavonoids

2.2 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

表2 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken central composite design arrangement and experimental results

采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的RSM（response surface methodology）分析試驗(yàn)?？疾斐暪β剩ˋ）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）對黑果腺肋花楸黃酮提取率（Y）的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert8.0.6軟件對表2進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到以黑果腺肋花楸黃酮提取率為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各條件編碼值的二次回歸方程為：

對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，可得到方差分析見表3，模型的可信度分析見表4。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the regression model

由表3、4可知，模型的P值小于0.000 1，遠(yuǎn)小于0.01，說明該模型極顯著，回歸模型與實(shí)際測定數(shù)值能夠很好的擬合，試驗(yàn)誤差較小，因此，可以用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，R2=99.19%，預(yù)測值與實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性，說明方程可靠性較高。在回歸模型中，B、C、AB、A2、B2、C2，對響應(yīng)值影響極顯著，A、AC，對響應(yīng)值影響顯著。影響產(chǎn)品感官評分由強(qiáng)到弱的因素為超聲溫度>超聲時(shí)間>超聲功率。

2.2.2 各因素的交互作用對產(chǎn)品感官評分影響

響應(yīng)面圖能夠非常直觀的表現(xiàn)出兩個(gè)因素之間的相互作用，也是各因素構(gòu)成的三維曲面圖。通過使一個(gè)因素不變，改變另兩個(gè)因素，將模型降維分析統(tǒng)計(jì)，目的是研究各因素間的相互作用對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響。由軟件分析可得到響應(yīng)面圖，見圖4。

等高線圖反應(yīng)兩個(gè)因素更直觀，在圖中橢圓形表示兩因素交互作用極顯著或者顯著，而圓形則表示兩因素交互作用不顯著。根據(jù)方差分析可知，超聲功率（A）與超聲溫度（B）之間的交互作用極顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖呈明顯的橢圓形；超聲功率（A）與超聲時(shí)間（C）之間交互作用顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖呈橢圓形。

圖4 各兩因素交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour plots of the interactive effects of each two factors

2.2.3 優(yōu)化工藝參數(shù)

為進(jìn)一步確定最佳參數(shù)，對擬合的回歸方程求分別一階偏導(dǎo)數(shù)，并設(shè)其為0，得到三元一次方程如下：

求解得：X1＝0.004、X2＝0.278、X3＝0.222，即最佳工藝參數(shù)為超聲功率70.04 W、超聲溫度61.39℃、超聲時(shí)間124.43 min，在此條件下黑果腺肋花楸黃酮提取率是94.83%。為便于實(shí)際操作，將參數(shù)修正為超聲功率70 W、超聲溫度61℃、超聲時(shí)間124 min，采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下黑果腺肋花楸黃酮提取率是95.64%，與理論預(yù)測值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化工藝參數(shù)是可行的。

2.3 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果

小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Mice weight loading swimming test results

從結(jié)果能夠明顯得出，小鼠經(jīng)灌胃30 d后，游泳時(shí)間顯著延長，小鼠經(jīng)灌胃黑果腺肋花楸黃酮濃度越高，小鼠平均游泳時(shí)間越長，因此，可說明黑果腺肋花楸黃酮具有抗疲勞功能。

2.4 血乳酸測定結(jié)果

小鼠血乳酸測定結(jié)果見表6。

表6 黑果腺肋花楸黃酮對游泳前后小鼠血乳酸值的影響Table 6 Effect of the Aronia melanocarpa flavonoids to swim around the mouse blood lactate values

由表6可見，小鼠灌胃黑果腺肋花楸黃酮30 d后，在游泳前安靜狀態(tài)時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮對小鼠體內(nèi)血乳酸含量無顯著性影響。游泳后10 min，每組小鼠血乳酸含量比游泳前有明顯提高。但和對照組相比，黑果腺肋花楸黃酮能顯著降低運(yùn)動小鼠血乳酸含量，并且灌胃劑量越大，下降越明顯。游泳10 min休息20 min，再測血乳酸含量，不同劑量的黑果腺肋花楸黃酮均能顯著降低小鼠血乳酸含量。說明黑果腺肋花楸黃酮具有抗疲勞功能。

3 結(jié)論

超聲波輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮最佳工藝參數(shù)為超聲功率70 W、超聲溫度61℃、超聲時(shí)間124 min，在此條件下，黑果腺肋花楸黃酮提取率可達(dá)到95.64%。影響黑果腺肋花楸黃酮提取率因素由大到小依次為超聲溫度>超聲時(shí)間>超聲功率。小鼠經(jīng)灌胃30 d后，游泳時(shí)間顯著延長，灌胃黑果腺肋花楸黃酮濃度越高，小鼠平均游泳時(shí)間越長。試驗(yàn)組和對照組比較，黑果腺肋花楸黃酮能顯著降低運(yùn)動小鼠血乳酸含量，并且灌胃劑量越大，下降越明顯，不同劑量的黑果腺肋花楸黃酮均能顯著降低小鼠血乳酸含量。由此可說明黑果腺肋花楸黃酮具有抗運(yùn)動疲勞功能，可為運(yùn)動員開發(fā)保健抗疲勞食品提供參考。

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Study on Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Aronia melanocarpa and Its Anti-exercise Fatigue

LI Rui-fang
（Zhengzhou University of Industry Technology，Zhengzhou 450000，Henan，China）

The single factor and response surface method was used to optimize the ultrasonic extraction of flavonoids from Aronia melanocarpa.The anti-fatigue effect of the flavonoids of Aronia melanocarpa was studied by mouse experiment.The results showed that the optimal extraction parameters was ultrasound power 70 W，ultrasonic temperature 61℃，and ultrasonic time 124 min.The extraction rate of flavonoids was 95.64%.The factors influencing the extraction rate of flavonoids from Aronia melanocarpa was ultrasonic temperature>ultrasonic time>ultrasonic power from strong to weak.After mice fed with flavonoids，the exhaustive swimming time of the mice was significantly prolonged and the higher the concentration the more obvious，the blood lactic acid content was compared with that of the non-perfused flavonoids group.Flavonoids of Aronia melanocarpa on mice had strong anti-exercise fatigue function.

response surface；ultrasound；Aronia melanocarpa；flavonoids；anti-fatigue

2017-01-20

李瑞芳（1984—），女（漢），講師，碩士，研究方向：體育運(yùn)動保健。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.014