趙娜，馮玲，楊宇石，徐澍，方藝

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550000)

17p染色體遺傳學(xué)不穩(wěn)定與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系

趙娜，馮玲，楊宇石，徐澍，方藝

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550000)

目的 檢測乳腺病變組織標(biāo)本17p染色體區(qū)間6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)和雜合性缺失(LOH)情況，進(jìn)一步探討乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制。方法 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法檢測106例份乳腺病變標(biāo)本[其中乳腺導(dǎo)管上皮普通型增生(UDH)31例、非典型增生(ADH)10例、乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS)32例、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)33例]17p染色體上6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(D17S695、D17S261、D17S786、D17S796、D17S831、D17S654)MSI及LOH發(fā)生情況。結(jié)果 106例標(biāo)本中6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均有一定頻率的LOH/MSI發(fā)生。D17S261、D17S796位點(diǎn)LOH/MSI發(fā)生總頻率分別為32.1%、24.5%(P<0.05)。D17S261位點(diǎn)LOH/MSI發(fā)生率UDH低于DCIS，DCIS低于IDC(P均<0.01)；D17S796位點(diǎn)LOH/MSI發(fā)生率UDH低于DCIS(P<0.01)。結(jié)論 乳腺病變組織標(biāo)本17p染色體區(qū)間6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)微衛(wèi)星均有一定頻率的LOH/MSI發(fā)生，17p染色體的遺傳學(xué)不穩(wěn)定是乳腺癌發(fā)生的前奏，D17S261、D17S796位點(diǎn)在UDH向IDC演變過程中可能起到關(guān)鍵作用。

乳腺癌；乳腺疾?。?7p染色體；微衛(wèi)星不穩(wěn)定；雜合性缺失

近年來乳腺癌的發(fā)病率迅速上升，且呈年輕化趨勢[1]。研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)和雜合性缺失(LOH)是腫瘤發(fā)生途徑的早期步驟，且是參與癌變的重要機(jī)制[2]。目前已有假設(shè)提出，乳腺癌有可能與結(jié)腸癌類似，是從增生性病變向浸潤性癌演進(jìn)的一個(gè)連續(xù)的組織學(xué)進(jìn)程，其過程中通常伴有遺傳學(xué)不穩(wěn)定[3]。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道17p染色體在多種腫瘤(如肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等)LOH及MSI發(fā)生頻率較高，但在乳腺增生性病變中LOH及MSI發(fā)生情況的相關(guān)報(bào)道較少。本研究在17p染色體上選擇了6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，檢測了106例份乳腺病變組織的MSI及LOH情況，旨在為乳腺癌的早期診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009～2014年經(jīng)病理確診的106例份乳腺組織庫存蠟塊，其中乳腺導(dǎo)管上皮普通型增生(UDH)31例、不典型增生(ADH)10例、乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS)32例、乳腺浸潤性癌(IDC)33例。所有病例為女性，年齡(57±21)歲，無家族史，且均為原發(fā)腫瘤。標(biāo)本均已由病理醫(yī)師做回顧性診斷。

1.2 MSI及 LOH檢測

1.2.1 DNA提取 石蠟組織切片取8～10片，二甲苯脫蠟完全后加入無水乙醇洗脫，蛋白酶K消化，石蠟組織DNA試劑盒美國Omega提取DNA，測定濃度(A260/A280在1.8～2.0的樣本作為實(shí)驗(yàn)的模板DNA)；-20 ℃保存。

1.2.2 引物合成 選取17p染色體上6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，引物序列見表1。引物序列均來自GenBank數(shù)據(jù)庫，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析 PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL。其中DNA模版2 μL，Taq mix 25 μL(TaKaRa公司產(chǎn)品，內(nèi)含1.25 U Taq、0.4 mmol/L dNTP、4 mmol/L Mg2+及Buffer)，上、下游引物各1 μL，剩余量用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃最后延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳以觀察擴(kuò)增效果；再取PCR產(chǎn)物5 μL，加變性上樣緩沖液5 μL混勻，進(jìn)行94 ℃變性10 min，冰浴驟冷，80 V電壓下進(jìn)行8%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳60 min， 電泳液為1×TBE。電泳結(jié)束后， 取下凝膠， 經(jīng)10%冰醋酸固固定、0.1% AgNO3溶液染色。顯色至條帶清晰，最后觀察結(jié)果并記錄。

表1 6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列及退火溫度

判定標(biāo)準(zhǔn)：與正常組織比較，若被測組織等位基因出現(xiàn)條帶數(shù)目的改變或位置遷移記為MSI；若某一條等位基因條帶消失或相對密度減少50%以上記為LOH。陽性結(jié)果均重復(fù)2次，以排除假陽性。見圖1。

注：T為病變組織，N為正常組織；A箭頭所指為等位條帶消失；B箭頭所指為等位條帶密度減少50%；C箭頭所指為條帶數(shù)目增加(本實(shí)驗(yàn)結(jié)果MSI以條帶增加為主)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。多組間率的比較采用兩樣本構(gòu)成比的χ2檢驗(yàn)，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步比較采用χ2分割法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

106例份乳腺病例標(biāo)本中，D17S695、D17S654、D17S786、D17S796、D17S831、D17S261位點(diǎn)在UDH、ADH、DCIS、IDC中均有不同程度的LOH/MSI發(fā)生，見圖2、表2。D17S261、D17S796位點(diǎn)UDH、ADH、DCIS、IDC的LOH/MSI總發(fā)生頻率分別為32.1%、24.5%，二者比較P<0.05；D17S695、D17S786、D17S654、D17S831位點(diǎn)UDH、ADH、DCIS、IDC中LOH/MSI發(fā)生頻率分別為19.8%、22.6%、34.0%、14.2%，P>0.05。D17S261位點(diǎn)UDH的LOH/MSI發(fā)生頻率低于DCIS，DCIS低于IDC(P均<0.01)；D17S796位點(diǎn)UDH的LOH/MSI發(fā)生頻率低于DCIS(P<0.01)。

注：T1、N1為DCIS；T2、N2為IDC；T3、N3，T5、N5為UDH；N4、T4為ADH；其中T2箭頭所指為MSI(+)，其余均為LOH(+)。

3 討論

腫瘤的形成主要是由于正常細(xì)胞的生長受控、分化受阻所致[4]。大多數(shù)研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞表型的形成關(guān)系到兩條獨(dú)立的途徑：一種是以DNA錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷為主，以基因組MSI為特征；另一種則以腫瘤抑制基因失活為主，以LOH為特征。兩條途徑分別代表了兩種不同基因組不穩(wěn)定性的機(jī)制[5]。

表2 106份標(biāo)本所在各位點(diǎn)UDH、ADH、DCIS、IDC的LOH/MSI發(fā)生頻率(%)

MSI又稱復(fù)制錯(cuò)誤,首先在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌中被發(fā)現(xiàn),隨后在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤中得以證實(shí)，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6]。微衛(wèi)星是一種散布于人全基因組中的簡單串列重復(fù)序列，多存在于非編碼區(qū)內(nèi)，通常為1～6個(gè)堿基對的15～30個(gè)重復(fù)單位，大約每100 000 bp中出現(xiàn)一個(gè)[7]。MSI是指經(jīng)遺傳異常狀態(tài)，這種狀態(tài)下，與正常細(xì)胞相比，微衛(wèi)星的等位基因在基因組的增加或缺失的重復(fù)單元頻率更高[8]。MSI狀態(tài)是通過腫瘤與正常組織DNA進(jìn)行比較確定的，其結(jié)果根據(jù)改變的微衛(wèi)星序列的數(shù)目進(jìn)行分類。如果改變是存在于兩個(gè)或兩個(gè)以上的五個(gè)微衛(wèi)星序列中，該腫瘤被歸類為高M(jìn)SI(MSI-H)；如果只有一個(gè)標(biāo)記被突破，則被劃分為低MSI(MSI-L)；沒有變化的五個(gè)微衛(wèi)星之間存在的腫瘤則被認(rèn)為是微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)[9]。MSI作為最早應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室篩查遺傳性非息肉病性大腸癌的分子標(biāo)記，其敏感性為100%，特異性在90%以上[10]。

LOH是基因組中很常見的一種基因組改變，其發(fā)生是由于一個(gè)等位基因的雜合性缺失，或母系或父系的染色體或染色體區(qū)與其他等位基因同時(shí)缺失的重疊。根據(jù)不同的拷貝數(shù)狀態(tài)，雜合性缺失包括復(fù)制中立的、復(fù)制丟失的和復(fù)制增加的[11]。目前已經(jīng)證實(shí)，LOH是多種腫瘤的重要遺傳事件，且在正常細(xì)胞中由于節(jié)段性異倍性已經(jīng)顯示出純合性的純合子等位基因或其他機(jī)制[12]。

已有研究表明，大多數(shù)腫瘤癌旁正常組織中的基因組存在不穩(wěn)定性，是提高IDC風(fēng)險(xiǎn)的潛在標(biāo)志物[13]。目前DCIS、IDC有關(guān)LOH的多是通過比較病變組織與配對的鄰近或遠(yuǎn)處正常組織的LOH進(jìn)行[14]，并提出假設(shè)，組織學(xué)上正常的組織基因也正常。然而這種假設(shè)并不成立，因?yàn)橐恍┳C據(jù)已證實(shí)LOH發(fā)生在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)均正常的早期乳腺癌患者的正常乳腺組織中[15～17]。本研究結(jié)果顯示，位于17p12區(qū)的D17S261以及位于17p13區(qū)的D17S796在乳腺普通型增生發(fā)展為乳腺癌的過程中出現(xiàn)了明顯的LOH與MSI改變。提示在乳腺癌中17p染色體上LOH/MSI出現(xiàn)了高頻改變。而在乳腺普通型增生發(fā)生時(shí)，提前關(guān)注17p染色體部分位點(diǎn)的突變可預(yù)測其發(fā)展為乳腺癌的可能性。

本研究結(jié)果提示，17p染色體的遺傳學(xué)不穩(wěn)定是乳腺癌發(fā)生的前奏，D17S261、D17S796位點(diǎn)突變在UDH向IDC演變過程中可能起到關(guān)鍵作用。提示臨床可通過檢測正常乳腺組織或良性病變?nèi)橄俳M織D17S261、D17S796位點(diǎn)突變情況預(yù)測乳腺癌發(fā)生的可能性并進(jìn)行預(yù)防。但該位點(diǎn)突變是作為獨(dú)立因素還是與其他位點(diǎn)協(xié)同作用參與乳腺癌的發(fā)生，以及是否可作為評估乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立因素，還有待大量的研究證實(shí)。

[1] 周興,錢立庭.人乳頭瘤病毒感染與乳腺癌的關(guān)系研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2015,55(7):100-102.

[2] Migdalska-S?k M, Karowicz-Bilińska A, Pastuszak-Lewandoska D, et al. Assessment of the frequency of genetic alterations (LOH/MSI) in patients with intraepithelial cervical lesions with HPV infection: a pilot study[J]. Med Oncol, 2016,33(5):51-52.

[3] 馮玲,徐澍,趙娜,等.乳腺癌和導(dǎo)管增生病變與1p染色體不穩(wěn)定的關(guān)系[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué),2016,32(5):501-504.

[4] Zhou R, Curry JM, Roy LD, et al. A novel association of neuropilin-1 and MUC1 in pancreatic ductal adenocarcinoma: role in induction of VEGF signaling and angiogenesis[J]. Oncogene, 2016,35(43):5608-5618.

[5] 從文銘,張樹輝,冼志紅,等.肝細(xì)胞癌腫瘤抑制基因的雜合性缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究[J].中華病理學(xué)雜志,2005,34(2):71-74.

[6] Geiersbach KB, Samowitz WS. Microsatellite instability and colorectal cancer[J]. Arch Pathol Lab Med, 2011,135(10):1269-1277.

[7] Shao J, Washington MK, Saxena R, et al. Heterozygous disruption ofthe PTEN promotes intestinal neoplasia in APCmin/+mouse: roles of osteopontin[J]. Carcinogenesis, 2007,28(12):2476-2483.

[8] Lu Y, Soong TD, Elemento O. A novel approach for characterizing microsatellite instability in cancer cells[J]. PLoS One, 2013,8(5):e63056.

[9] Srdjan M, Jadranka A, Ivan D, et al. Microsatellite instability & survival in patients with stage Ⅱ/Ⅲ colorectal carcinoma[J]. Indian J Med Res, 2016,143(7):104-111.

[10] Bonis PA, Trikalinos TA, Chung M, et al. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: diagnostic strategies and their implications[J]. Evid Rep Technol Assess (Full Rep), 2007(150):1-180.

[11] Forghanifard MM, Vahid EE, Dadkhah E, et al. Loss of heterozygosity and microsatellite instability as predictive markers among Iranian esophageal cancer patients[J]. Iran J Basic Med Sci, 2016,19(7):726-733.

[12] Gavin H, Roth A, Daniel L, et al. Integrative analysis of genome-wide loss of heterozygosity and monoallelic expression at nucleotide resolution reveals disrupted pathways in triple-negative breast cancer[J]. Genome Res, 2012,22(10):1995-2007.

[13] Fang C, Wang FB, Li Y, et al. Down-regulation of miR-199b-5p is correlated with poor prognosis for breast cancer patients[J]. Biomed Pharmacother, 2016(84):1189-1193.

[14] Zikan M, Bohm J, Pavlista D, et al. Comparative analysis of loss of heterozygosity and expression profile in normal tissue, DCIS and invasive breast cancer[J]. Clin Transl Oncol, 2011,13(9):652-655.

[15] Rennstam K, Ringberg A, Cunliffe HE, et al. Genomic alterations in histopathologically normal breast tissue from BRCA1 mutation carriers may be caused by BRCA1 haploinsufficiency[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2010,49(1):78-90.

[16] Reis-Filho JS, Lakhani SR. The diagnosis and management of pre-invasive breast disease: Genetic alterations in pre-invasive lesions[J]. Breast Cancer Res, 2003,5(6):313-319.

[17] Ruan X, Liu H, Boardman L, et al. Genome-wide analysis of loss of heterozygosity in breast infiltrating ductal carcinoma distantnormal tissue highlights arm specific enrichment and expansion across tumor stages[J]. PLoS One,2014，9(4):e95783．

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔科合J字2278)；貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY字3016)。

徐澍(E-mail： xushu@gmc.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.013

R737.9

A

1002-266X(2017)24-0043-03

2016-06-03)