蔡洲，李道，吳際，吳瓊，梅燕

(武漢科技大學(xué)城市學(xué)院，武漢430083)

丹酚酸B對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎保護(hù)作用及其機(jī)制

蔡洲，李道，吳際，吳瓊，梅燕

(武漢科技大學(xué)城市學(xué)院，武漢430083)

目的 探討丹酚酸B對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎保護(hù)作用及其機(jī)制，為丹酚酸B臨床用于治療腎間質(zhì)纖維化提供依據(jù)。方法 取雄性SD大鼠45只隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組和丹酚酸B組，模型組和丹酚酸B組采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立腎間質(zhì)纖維化模型，假手術(shù)組游離輸尿管和腎臟后不結(jié)扎。自手術(shù)第2天開始，丹酚酸B組予12.5 mg/kg丹酚酸B灌胃，假手術(shù)組、模型組予等量雙蒸水灌胃，連續(xù)灌胃7天；灌胃結(jié)束時(shí)腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠，取梗阻側(cè)腎組織。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，對(duì)梗阻側(cè)腎組織進(jìn)行HE、Masson染色，采用免疫組化法和Western blotting法檢測梗阻側(cè)腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織長成因子(CTGF)mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組、丹酚酸B組BUN、Scr水平均高于假手術(shù)組，丹酚酸B組均高于假手術(shù)組，組間比較P均<0.05。HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，模型組、丹酚酸B組梗阻側(cè)腎組織纖維化、炎性細(xì)胞浸潤，但丹酚酸B組纖維化程度明顯減輕、炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。模型組、丹酚酸B組TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于假手術(shù)組，丹酚酸B組均低于模型組，組間比較P均<0.05。結(jié)論 丹酚酸B對(duì)大鼠腎纖維化形成有抑制作用；下調(diào)TGF-β1、CTGF表達(dá)，調(diào)節(jié)TGF-β1/CTGF信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

腎間質(zhì)纖維化；丹酚酸B；轉(zhuǎn)化生長因子β1；結(jié)締組織生長因子；大鼠

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎病進(jìn)展為終末期腎病的病理基礎(chǔ)。其病理基礎(chǔ)為腎臟膠原蛋白合成增加、降解減少，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉淀[1]。丹參是唇形科鼠尾草屬植物，具有涼血消癰、祛瘀生新、活血調(diào)經(jīng)等作用[2]。丹參總酚酸是丹參提取物，具有抗氧化、抗炎、改善腎功能等作用[3,4]。丹酚酸B是丹參總酚酸中主要水溶性活性成分之一，具有抗肝纖維化作用，但其對(duì)腎纖維化的影響及作用機(jī)制尚未明確[5,6]。2015年12月～2016年12月，本研究探討了丹酚酸B對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠45只，清潔級(jí)，購自華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量220～250 g，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(鄂)2010-0057。丹酚酸B購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司(批號(hào)131010)，ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀購自美國Bio-Tek公司。兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗體、兔抗大鼠結(jié)締組織生長因子(CTGF)抗體、兔抗大鼠β-actin抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。免疫組化試劑盒購自美國Sigma公司。AU5800全自動(dòng)生化分析儀、光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 腎間質(zhì)纖維化模型建立及分組處理 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丹酚酸B組，每組15只。模型組和丹酚酸B組采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立腎間質(zhì)纖維化模型。具體步驟：大鼠經(jīng)乙醚麻醉，乙醇消毒切口處皮膚，自腹正中線偏左切開皮膚、打開腹腔并游離輸尿管和腎臟，組織鉗托起左側(cè)輸尿管中段并用止血鉗夾住，用絲線將左側(cè)輸尿管遠(yuǎn)端和近腎盂段結(jié)扎，剪斷結(jié)扎點(diǎn)之間的輸尿管，縫合皮膚并關(guān)閉切口。假手術(shù)組游離輸尿管和腎臟后不結(jié)扎，其余步驟同模型組。自手術(shù)第2天開始，丹酚酸B組予12.5 mg/kg丹酚酸B灌胃，假手術(shù)組、模型組均給予等量雙蒸水灌胃，三組均持續(xù)給藥7天。灌胃結(jié)束當(dāng)天腹主動(dòng)脈取血；處死大鼠，取梗阻側(cè)腎組織。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 腎功能檢測 取各組腹主動(dòng)脈血標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。

1.3.2 腎組織病理學(xué)變化 取部分梗阻側(cè)腎組織標(biāo)本，甲醛固定，切片制成光鏡標(biāo)本，進(jìn)行HE、Masson染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。

1.3.3 腎組織TGF-β1、CTGF表達(dá)檢測 ①TGF-β1mRNA及CTGF mRNA表達(dá)：采用免疫組化法。取部分梗阻側(cè)腎組織標(biāo)本，石蠟包埋后常規(guī)切片；過氧化氫室溫封閉10 min，PBS沖洗3次；37 ℃胃蛋白酶消化30 min，PBS沖洗3次；加入檸檬酸緩沖液并加熱10 min。室溫自然冷卻，BSA封閉液37 ℃孵育0.5 h；滴加TGF-β1抗體(1∶100)和CTGF抗體(1∶100)，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，4 ℃濕盒內(nèi)過夜。PBS沖洗3次后滴加二抗，37 ℃濕盒內(nèi)孵育0.5 h。DAB-過氧化氫顯色劑顯色5～8 min，水洗后蘇木素復(fù)染，無水乙醇分化、脫水，封片后鏡下觀察。每組中每只大鼠制作3張切片，每個(gè)切片選取5個(gè)高倍鏡視野，利用圖像分析軟件讀片，以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性，計(jì)算陽性染色面積占整個(gè)視野面積的百分比。②TGF-β1蛋白及CTGF蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取部分梗阻側(cè)腎組織標(biāo)本，勻漿器充分研磨后加入裂解液裂解并提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小配置適合濃度的凝膠、分離膠和濃縮膠。電泳加壓轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉1 h。加入特異性TGF-β1抗體和CTGF抗體，稀釋比例為1∶1 000，以β-actin(1∶5 000)作為對(duì)照。去除一抗，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，漂洗，化學(xué)發(fā)光法X片顯影，采用Image J軟件得到條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組血BUN、Scr水平比較 模型組、丹酚酸B組BUN、Scr水平均高于假手術(shù)組，丹酚酸B組均高于假手術(shù)組，組間比較P均<0.05。見表1。

表1 三組血BUN、Scr水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 三組腎組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎間質(zhì)無改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，間隙緊密，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組腎間質(zhì)纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤小管間質(zhì)，小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，腎小管出現(xiàn)部分萎縮、壞死、擴(kuò)張、閉塞；丹酚酸B組腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織輕度增生，部分小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，腎小管出現(xiàn)輕度擴(kuò)張、閉塞和萎縮。Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎小管間質(zhì)染色較少，染色主要位于小管基底膜和管周圍區(qū)域，可見小管基底膜連續(xù)、光滑；模型組腎小管擴(kuò)張明顯，管壁變薄，基底膜呈現(xiàn)不同程度斷裂增厚，腎間質(zhì)膠原成分增加、增寬，浸潤炎性細(xì)胞增多；丹酚酸B組腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，腎間質(zhì)變窄，膠原成分減少。

2.3 三組腎組織TGF-β1、CTGF表達(dá)比較 假手術(shù)組TGF-β1、CTGF陽性染色細(xì)胞平均分布于腎小管和腎小球基膜；模型組TGF-β1、CTGF大量表達(dá)于腎間質(zhì)，腎小管和腎小球基膜上也有分布；丹酚酸B組TGF-β1、CTGF中等程度不均勻表達(dá)于腎間質(zhì)，腎小管和腎小球基膜上也有少量分布。模型組、丹酚酸B組TGF-β1、CTGF陽性染色面積占整個(gè)視野面積的百分比和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于假手術(shù)組，丹酚酸B組均低于模型組，組間比較P均<0.05。見表2、3。

表2 三組腎組織TGF-β1、CTGF mRNA表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表3 三組腎組織TGF-β1、CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

腎臟原發(fā)病進(jìn)展至終末期均表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少、腎間質(zhì)纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積，其中腎間質(zhì)纖維化被認(rèn)為是幾乎所有腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病的共同病理改變。中醫(yī)認(rèn)為，慢性腎功能衰竭是由于腎臟絡(luò)脈阻滯、瘀血內(nèi)阻致脾腎衰敗、瘀濁內(nèi)壅[7]。丹參性微寒、味苦，入肝經(jīng)、心、心包，有藥用價(jià)值的部分主要是根莖和干燥根。藥理學(xué)研究表明，丹參具有涼血消癰、祛瘀止痛、活血通絡(luò)、清心除煩等作用，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)均具有保護(hù)作用[8,9]，可用于治療心絞痛、心煩不眠、經(jīng)閉痛經(jīng)、肝脾腫大等多種疾病。對(duì)于單味中藥單一成分的研究可以明確該成分的作用效果和作用機(jī)制。丹酚酸B是丹參總酚酸(丹參提取物)中主要的水溶性活性成分之一，具有良好的抗肝纖維化作用[10]，但其對(duì)腎纖維化的作用報(bào)道較少。

單側(cè)輸尿管梗阻是目前較成熟的制備腎間質(zhì)纖維化模型的方法，且嚙齒類動(dòng)物的纖維化特征與人類相似，因此本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻制備腎纖維化模型。本研究結(jié)果顯示，模型組、丹酚酸B組BUN、Scr水平均高于假手術(shù)組，提示腎纖維化大鼠模型腎功能受損；丹酚酸B組BUN、Scr均高于假手術(shù)組，提示丹酚酸B可改善腎纖維化大鼠腎功能。進(jìn)一步對(duì)梗阻側(cè)腎組織進(jìn)行HE染色和Masson染色，結(jié)果顯示模型組、丹酚酸B組腎組織存在纖維化，但丹酚酸B組纖維化程度明顯減輕、炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；提示丹酚酸B能夠抑制腎間質(zhì)纖維化病理改變。

TGF-β1是TGF-β家族成員之一，具有免疫抑制功能[11]，也是傳統(tǒng)的促纖維化因子，在腎臟中表達(dá)量最多。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。TGF-β1通過刺激腎小管上皮細(xì)胞促進(jìn)α-SMA表達(dá)，阻斷TGF-β1后α-SMA表達(dá)顯著降低[12,13]。因此，TGF-β1被認(rèn)為能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成和腎小球纖維化[14]。有研究認(rèn)為，丹酚酸B能夠抑制TGF-β1產(chǎn)生，抑制Smad2、Smad3磷酸化，通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路調(diào)節(jié)腎纖維化[15]。但TGF-β1具有雙向調(diào)節(jié)作用，即在成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞中，低濃度TGF-β1促進(jìn)增殖、高濃度抑制增殖；適量的激活TGF-β1能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、修復(fù)損傷創(chuàng)面、重塑生理結(jié)構(gòu)等作用。因此，單純拮抗TGF-β1并不一定能延緩腎臟纖維化的進(jìn)展；因?yàn)樽枰諸GF-β1的同時(shí)也抑制了TGF-β1的免疫調(diào)節(jié)和抗炎等生物學(xué)效應(yīng)，甚至引起腎功能進(jìn)行性減退[13]。CTGF是一種分泌性多肽，富含半胱氨酸，廣泛分布于人體多個(gè)組織器官中，與纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。在CTGF啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了TGF-β1的反應(yīng)元件，推測CTGF可能是TGF-β1的下游因子。正常腎小管上皮細(xì)胞CTGF低表達(dá)，采用TGF-β1干預(yù)后CTGF表達(dá)明顯升高，細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌顯著增加。Shi等[16]研究認(rèn)為，在病理狀態(tài)下CTGF表達(dá)上調(diào)與部分纖維化性疾病和增生性疾病密切相關(guān)。由于CTGF功能相對(duì)單一，因此其有望成為代替TGF-β1作為纖維化疾病治療的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，模型組和丹酚酸B組TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白表達(dá)量均高于假手術(shù)組，丹酚酸B組均低于模型組；提示腎臟纖維化形成過程中TGF-β1、CTGF表達(dá)顯著上調(diào)，TGF-β1、CTGF表達(dá)增加或活化參與了腎臟纖維化的作發(fā)生。丹酚酸B可抑制TGF-β1、CTGF表達(dá)，調(diào)節(jié)TGF-β1/CTGF信號(hào)通路，降低細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，干預(yù)腎纖維化進(jìn)程，發(fā)揮抗纖維化作用。

綜上所述，丹酚酸B灌胃對(duì)大鼠腎纖維化形成有抑制作用。其作用機(jī)制可能與下調(diào)腎組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)，調(diào)節(jié)TGF-β1/CTGF信號(hào)通路有關(guān)。本研究的不足為未建立TGF-β1、CTGF基因切除大鼠進(jìn)行反面驗(yàn)證。此外，中藥單體可能具有多個(gè)作用靶點(diǎn)，丹酚酸B是否可以通過其他途徑發(fā)揮腎臟保護(hù)作用仍需進(jìn)一步探索。

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2017-02-23)