張媛媛，劉曉亮，初國(guó)銘，崔婉婷，何蓉，趙彥艷

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng) 110004)

·論著·

無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查與結(jié)果分析

張媛媛，劉曉亮，初國(guó)銘，崔婉婷，何蓉，趙彥艷

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng) 110004)

目的 探討無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集5 469例孕婦外周血標(biāo)本，提取血漿游離DNA進(jìn)行高通量測(cè)序篩查胎兒染色體非整倍體，對(duì)21、18、13和性染色體三體高風(fēng)險(xiǎn)者行羊水或臍血穿刺，進(jìn)行多重定量熒光PCR(QF-PCR)檢測(cè)和染色體核型分析驗(yàn)證。結(jié)果 無(wú)創(chuàng)篩查出染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)樣本71例(1.3%)，其中21-三體30例(1例為嵌合型)、18-三體7例、13-三體6例、X染色體數(shù)量增多11例、X染色體數(shù)量減少17例。21、18、13-三體除有5例未做介入性產(chǎn)前診斷，3例為假陽(yáng)性外，其余均與QF-PCR和核型分析驗(yàn)證結(jié)果一致。性染色體陽(yáng)性結(jié)果者經(jīng)核型分析驗(yàn)證有13例為異常，準(zhǔn)確率為46.4%。其余5 398例無(wú)創(chuàng)篩查陰性結(jié)果者后期經(jīng)B超監(jiān)測(cè)和電話隨訪，未發(fā)現(xiàn)21、18、13以及性染色體非整倍體患兒。結(jié)論 無(wú)創(chuàng)性胎兒染色體非整倍體篩查技術(shù)對(duì)21、18、13-三體的檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，可以作為傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查診斷策略的有益補(bǔ)充，但對(duì)性染色體非整倍體檢測(cè)的準(zhǔn)確性較低，尚需進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)和分析方法。

染色體非整倍體；產(chǎn)前篩查；DNA高通量測(cè)序技術(shù)；血漿游離DNA

染色體非整倍體是出生缺陷最常見(jiàn)的遺傳性病因，常見(jiàn)類型有21-三體、18-三體、13-三體、X-三體、Klinefelter綜合征、Turner綜合征等[1]?；純撼１憩F(xiàn)為先天性非進(jìn)行性智力障礙，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和(或)合并畸形，目前尚無(wú)有效的治療方法。傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查和診斷方法(孕早期超聲檢查、孕中期血清學(xué)篩查、羊水細(xì)胞染色體核型分析)均有一定的局限性。隨著新一代測(cè)序技術(shù)研究的深入，無(wú)創(chuàng)性胎兒基因檢測(cè)得到了快速發(fā)展，其通過(guò)對(duì)孕婦外周血血漿游離DNA檢測(cè)，經(jīng)生物信息學(xué)分析，可無(wú)創(chuàng)篩查胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體，已成為國(guó)內(nèi)外產(chǎn)前篩查的熱點(diǎn)項(xiàng)目。本研究采用多重定量熒光(QF)-PCR檢測(cè)和核型分析驗(yàn)證，評(píng)估無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查在產(chǎn)前篩查診斷中的價(jià)值，為該技術(shù)在臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1～12月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科和遺傳科就診，并自愿接受無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查的孕婦5 469例。孕婦均為單胎妊娠，孕周為12～34+6周。采用Cell-Free DNA BCT管(Streck，美國(guó))采集靜脈血8～10 mL用于檢測(cè)。

1.2 無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查方法 將采血管于4 ℃下1 600 g離心10 min，吸取上清分裝到1.5 mL離心管中。離心管室溫16 000 g離心10 min，吸取中間層血漿約4 mL，轉(zhuǎn)入3支1.5 mL血漿收集管中，取一支血漿進(jìn)行檢測(cè)，其余置于-80 ℃超低溫冰箱保存。利用血漿游離DNA提取試劑盒(磁珠法，貝瑞和康)提取血漿游離DNA，Qubit Fluorometer核酸定量計(jì)檢測(cè)DNA濃度。合格的DNA樣本經(jīng)文庫(kù)制備、文庫(kù)混合后，通過(guò)Illumina NextSeq CN500基因測(cè)序儀完成高通量測(cè)序。進(jìn)入貝比安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)3.0(貝瑞和康)錄入樣本信息和芯片，查看質(zhì)控，分析數(shù)據(jù)，判斷胎兒是否為染色體非整倍體患兒。對(duì)于篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，簽署知情同意書(shū)后，采集羊水或臍血，進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)和細(xì)胞的染色體核型分析。

1.3 羊水和臍血采集 在超聲指導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)采集羊水25 mL或臍靜脈穿刺術(shù)采集臍血2 mL。

1.4 QF-PCR檢測(cè) 按照文獻(xiàn)[2]的方法，采用Chelex-100法提取基因組DNA。取羊水1.5 mL，12 000 r/min離心2 min，吸棄上清；取臍血20 μL，加1 mL純水，劇烈渦旋10 s，12 000 r/min離心2 min，吸棄上清；在收集的羊水和臍血細(xì)胞中加5%Chelex-100溶液100 μL，劇烈渦旋10 s，56 ℃水浴30 min；劇烈渦旋10 s，100 ℃煮沸8 min，再劇烈渦旋10 s，12 000 r/min離心4 min，取上清用于PCR。針對(duì)21、18、13、X和Y染色體上的22個(gè)多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)(STR)序列進(jìn)行多重QF-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒(AxyGene，美國(guó))純化、95 ℃變性、迅速冷卻，于基因分析儀(ABI genetic analyzer 3730，美國(guó))進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用GeneMapper v4.1軟件(Applied Biosystem，美國(guó))讀取片段分析數(shù)據(jù)，結(jié)合英國(guó)臨床分子遺傳協(xié)會(huì)(CMGS)頒布的指南“QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines(2012)v3.01”分析結(jié)果。

1.5 染色體核型分析 取羊水20 mL或臍血0.6 mL，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)、收獲、制片和G顯帶，利用Leica全自動(dòng)染色體分析系統(tǒng)進(jìn)行中期細(xì)胞的掃描和圖像采集，分析5個(gè)核型，計(jì)數(shù)15個(gè)中期分裂相，遇到嵌合型時(shí)增加計(jì)數(shù)至30個(gè)或以上，參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制ISCN(2009)進(jìn)行核型分析診斷。

2 結(jié)果

5 469例孕婦無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者71例，占樣本總數(shù)的1.3%，包括21-三體30例(1例為嵌合型)、18-三體7例、13-三體6例、X染色體數(shù)量增多11例和X染色體數(shù)量減少17例。其中66例接受了羊水或臍血的多重QF-PCR檢測(cè)和核型分析，其余5例高風(fēng)險(xiǎn)者(包括3例21-三體和2例18-三體)由于B超提示多發(fā)畸形，未進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷而選擇直接引產(chǎn)。多重QF-PCR結(jié)果和核型分析結(jié)果均顯示48例與無(wú)創(chuàng)篩查結(jié)果一致，包括25例21-三體、5例18-三體、5例13-三體、6例47,XXN和7例(2例嵌合型)45,X，除有1例懷疑47,XXX胎兒孕婦由于本人也是47,XXX而選擇繼續(xù)妊娠，其余孕婦均選擇終止妊娠；另2例21-三體、1例13-三體和15例性染色體數(shù)量異常高風(fēng)險(xiǎn)者QF-PCR和核型結(jié)果正常，孕婦繼續(xù)妊娠，出生后經(jīng)外周血染色體核型分析驗(yàn)證，結(jié)果均正常。見(jiàn)表1。5 398例無(wú)創(chuàng)篩查陰性結(jié)果孕婦后期經(jīng)B超監(jiān)測(cè)和電話隨訪，目前尚未發(fā)現(xiàn)21、18、13以及性染色體非整倍體患兒。

3 討論

1997年Lo等[3]采用PCR法在孕婦外周血中檢測(cè)到Y(jié)染色體特異性片段，證實(shí)母體外周血血漿、血清中存在胎兒游離DNA。自此，科研人員開(kāi)始研究利用胎兒游離DNA進(jìn)行產(chǎn)前胎兒基因檢測(cè)。2008年，Chiu等[4]和Fan等[5]兩個(gè)研究組分別對(duì)孕婦外周血中游離DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)計(jì)算21號(hào)染色體片段與其他所有染色體片段的比例，準(zhǔn)確篩查出21-三體胎兒。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查以其靈敏、準(zhǔn)確、快速、無(wú)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢(shì)得到了醫(yī)生和孕婦的青睞，已在美國(guó)、澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家推廣應(yīng)用[6、7]，國(guó)內(nèi)多個(gè)產(chǎn)前診斷中心也已廣泛開(kāi)展。

表1 71例無(wú)創(chuàng)性胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查高風(fēng)險(xiǎn)者多重QF-PCR檢測(cè)和核型分析結(jié)果

本研究中我們成功提取5 469例孕婦的外周血血漿游離DNA并進(jìn)行胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查，檢出21、18、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)者43例，除去5例未行介入性產(chǎn)前診斷，其余38例高風(fēng)險(xiǎn)者有3例是假陽(yáng)性，包括2例21-三體和1例13-三體，無(wú)創(chuàng)篩查21、18、13-三體的總體符合率達(dá)到99.9%，敏感性為100%，特異性為99.9%?；仡檱?guó)內(nèi)其他研究組報(bào)道的結(jié)果，Zhou等[8]檢測(cè)了7 705例份樣本，發(fā)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)對(duì)21、18、13-三體檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為100%和99%；林穎等[9]檢測(cè)了7 050例份樣本，報(bào)道的敏感性和特異性分別為100%和99.96%；劉靜等[10]檢測(cè)了4 003例份樣本，證實(shí)無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)對(duì)18、21-三體檢測(cè)的符合率達(dá)100%。以上研究表明，基于新一代測(cè)序技術(shù)的無(wú)創(chuàng)胎兒染色體非整倍體篩查對(duì)21、18、13-三體檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性。不容忽視的是本研究以及上述研究組在檢測(cè)中均發(fā)現(xiàn)了假陽(yáng)性樣本，由于母體血漿中的游離DNA來(lái)源于母體和胎盤(pán)組織，因此母體嵌合、胎盤(pán)嵌合、胎兒游離DNA比例低/高等因素都可能影響篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。金玉霞等[12]分析了1例18-三體假陽(yáng)性胎兒分娩后的胎盤(pán)組織，證實(shí)為胎盤(pán)18-三體嵌和，說(shuō)明無(wú)創(chuàng)篩查出的高風(fēng)險(xiǎn)者尚需進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷確診。另外，無(wú)創(chuàng)篩查也能準(zhǔn)確提示嵌合型的樣本，本研究中有1例嵌合型21-三體，核型分析結(jié)果為47,XN,+21[34]/46,XN[16]，而QF-PCR對(duì)嵌合體的診斷有一定局限性，只檢測(cè)出嵌合比例高的核型，提示為21-三體。

本研究中我們除篩查到21、18、13-三體外，還有28例樣本為性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)核型分析驗(yàn)證有13例為異常，準(zhǔn)確率為46.4%，說(shuō)明無(wú)創(chuàng)篩查胎兒性染色體非整倍體具有一定價(jià)值，但由于母體性染色體異常、胎盤(pán)嵌合等原因使無(wú)創(chuàng)篩查對(duì)于胎兒性染色體異常檢測(cè)的準(zhǔn)確率較低，假陽(yáng)性率較高[13、14]。

產(chǎn)前篩查的主要目的之一是減少不必要的介入性產(chǎn)前診斷，無(wú)創(chuàng)胎兒常見(jiàn)染色體非整倍篩查與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比，有較高的敏感性和特異性，對(duì)21、18、13-三體均具有較好的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)價(jià)值，特別是一定程度上提高了性染色體異常的檢出率。一些血清學(xué)篩查陽(yáng)性結(jié)果的孕婦可能會(huì)選擇進(jìn)一步行無(wú)創(chuàng)篩查而非介入性產(chǎn)前診斷，但是研究表明，與核型分析相比，無(wú)創(chuàng)篩查會(huì)漏診約20%的其他染色體異常病例[15、16]，包括目標(biāo)染色體以外的其他染色體非整倍體和假陰性樣本；即如果血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)而無(wú)創(chuàng)篩查結(jié)果正常，則染色體異常風(fēng)險(xiǎn)約為2%[15]。另外，無(wú)創(chuàng)篩查也無(wú)法檢測(cè)B超提示異常胎兒的染色體微小缺失、重復(fù)或其他畸變，對(duì)雙胎、多胎妊娠也存在一定的檢測(cè)局限性。

綜上所述，無(wú)創(chuàng)篩查只能作為一種較精確的篩查，而不能取代現(xiàn)行的任何其他檢測(cè)項(xiàng)目，只有將其與遺傳咨詢和現(xiàn)有的產(chǎn)前篩查診斷模式很好地結(jié)合起來(lái)，才能充分發(fā)揮各自技術(shù)優(yōu)勢(shì)，為臨床提供準(zhǔn)確參考。

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Non-invasive common fetal chromosomal aneuploidy screening and result analysis

ZHANGYuanyuan,LIUXiaoliang,CHUGuoming,CUIWanting,HERong,ZHAOYanyan

(ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

ObjectiveTo explore the application value of non-invasive common fetal chromosomal aneuploidy screening.MethodsA total of 5 469 maternal peripheral blood samples were collected, and plasma free DNA was extracted for high throughput sequencing to detect fetal chromosomal aneuploidies. Samples with high risk of trisomies 21, 18, 13, X and Y were verified by multiplex quantitative fluorescent PCR (QF-PCR) and karyotype analysis by using amniotic fluid or cord blood.ResultsAfter non-invasive prenatal screening, 71 (1.3%) showed positive results, including 30 cases of trisomy 21, 7 cases of trisomy 18, 6 cases of trisomy 13, 11 cases with increased X chromosome, and 17 cases with decreased X chromosome. In trisomies 21, 18 and 13, 5 cases rejected interventional prenatal diagnosis, 3 cases were false positive, and the rest were all consistent with the results of QF-PCR and karyotyping. In positive results of sex chromosome aneuploidies, 13 cases were confirmed abnormal by karyotyping, and the accuracy rate was about 46.4%. The other 5 398 pregnant women with negative screening results were monitored by B ultrasound and were telephoned for follow-up, and none of them were found trisomies 21, 18, 13, X and Y.ConclusionsNon-invasive fetal chromosomal aneuploidy screening can accurately detect trisomies 21, 18 and 13, which can serve as a useful complement to traditional prenatal screening and diagnosis. While the accuracy of sex chromosome aneuploidies detection is low, we still need to further optimize the detection and analysis method.

chromosomal aneuploidy; prenatal screening; DNA next-generation sequencing technology; plasma free DNA

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81500242，31571198)。

張媛媛(1983-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)槌Ｒ?jiàn)單基因病和染色體病的遺傳學(xué)診斷。E-mail： zyy.0526@163.com

趙彥艷(1960-)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)樾难芗膊〉姆肿舆z傳學(xué)。E-mail： yyzhao@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.001

R596.1

A

1002-266X(2017)20-0001-04

2016-04-08)