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        補腎活血顆粒對去卵巢小鼠心臟巨噬細胞M1/M2極化的影響

        2017-07-01 08:25:11賈承明馬靜陳昌波曹亮李穎琪吳雷
        中國醫(yī)藥導報 2017年14期

        賈承明+馬靜+陳昌波+曹亮+李穎琪+吳雷濤

        [摘要] 目的 探討補腎活血顆粒是否能夠通過調(diào)控巨噬細胞M1/M2極化治療去卵巢小鼠心臟微血管病變。 方法 按照隨機數(shù)字表法將30只SPF級8周齡C57BL/6小鼠分為假手術組、模型組和治療組。制備去卵巢小鼠模型8周后,治療組給予補腎活血顆粒(含生藥6 g/mL),灌胃8周,1次/d;假手術組和模型組給予同體積生理鹽水,灌胃8周,1次/d。通過HE染色、免疫熒光染色和實時定量PCR等方法檢測補腎活血顆粒對心臟組織結(jié)構(gòu)、超氧陰離子、CD31、CD68和白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的mRNA表達的影響。 結(jié)果 與假手術組比較,模型組心臟組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、超氧陰離子、CD68表達明顯增加(P < 0.05),CD31、IL-10 mRNA表達明顯減少(P < 0.05)。與模型組比較,治療組小鼠心臟組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、超氧陰離子明顯降低(P < 0.05),CD31、IL-10 mRNA表達明顯增多(P < 0.05),但兩組CD68表達差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。 結(jié)論 補腎活血顆??赡芡ㄟ^調(diào)控巨噬細胞M1/M2極化治療去卵巢小鼠心臟微血管病變。

        [關鍵詞] 補腎活血顆粒;巨噬細胞極化;心臟微血管病變;去卵巢

        [中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2017)05(b)-0029-04

        [Abstract] Objective To explore whether Bushen Huoxue Granules could cure cardiac microvascular dysfunction by regulating M1/M2 macrophage polarization in female ovariectomized mice. Methods According to random number table, 30 SPF level and 8 weeks old C57BL/6 mice were divided into sham group, model group and treatment group. Eight weeks after ovariectomy, treatment group was given Bushen Huoxue Granules (containing crude drugs 6 g/mL) by gavage, once a day, for eight weeks. Sham group and model group were given the same volume of physiological saline. HE staining, immunofluorescence staining and real-time quantitative PCR were used to detect the influences of Bushen Huoxue Granules on organization structures of heart tissue, the ultra oxygen anion, platelets endothelial cell adhesion molecules (CD31), CD68, and the mRNA expression of interleukin (IL)-1β, tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-10 and vascular endothelial growth factor (VEGF). Results Compared with the sham group, the expression of IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, ultra oxygen anion, CD68 cells in model group were increased (P < 0.05), while the expression of CD31, IL-10 mRNA were decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the expression of IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, ultra oxygen anion of heart tissue in the treatment group were decreased (P < 0.05), while the expression of CD31 and IL-10 mRNA were increased (P < 0.05). No significant difference was found with the expression of CD68 between the model group and treatment group (P > 0.05). Conclusion Bushen Huoxue Granules may cure cardiac microvascular dysfunction by regulating M1/M2 macrophage polarization in ovariectomized mice.

        [Key words] Bushen Huoxue Granules; Macrophage polarization; Cardiac microvascular dysfunction; Ovariectomized

        研究證實,心臟微血管病變是女性絕經(jīng)后心血管疾病的危險因素[1-3]。炎性反應始終貫穿于心臟微血管病變中[4-5],而巨噬細胞表型M1/M2在炎性反應中發(fā)揮重要作用[6]。前期研究證實[7-8],補腎活血顆粒不僅能治療微血管性心絞痛,還能抑制炎性反應,但其能否調(diào)控心臟巨噬細胞M1/M2極化影響炎性反應,尚無報道。因此,本研究擬通過觀察巨噬細胞M1/M2極化與心臟微血管損傷的關系,探討補腎活血顆粒對心臟微血管的保護作用機制,為臨床應用提供可靠的實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        將由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供的30只SPF級、8周齡、體重19~21 g、雌性C57BL/6小鼠適應性喂養(yǎng)1周,12 h晝夜交替,室溫18~22℃,濕度50%~60%,食物和水自由攝取。動物合格證號SCXK(軍)-2007-007。動物使用過程符合《陜西省實驗動物管理辦法》。

        1.2 實驗藥品

        補腎活血顆粒(仙茅、仙靈脾、知母、黃柏、當歸、葛根、醋香附、遠志)(西京醫(yī)院中藥房提供,批號:504 251L),戊巴比妥鈉(北京普博斯生物),CD31兔抗大鼠單克隆抗體(批號:SAB5600061)、CD68兔抗小鼠多克隆抗體(批號:SAB1401062)、FITC-/Rho交聯(lián)二抗(批號:FITC1)(美國,SIGMA公司),氫化乙啡啶(DHE)-超氧陰離子熒光探針(碧云天生物技術研究所,批號:S0036),TRIzol提取液(批號:15596-018)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(批號:28025-014)(美國,Invitrogen公司),SYBR green qRT-PCR檢測試劑盒(日本,TAKARA公司,批號:13417000),引物合成(上海桑尼生物科技有限公司)。

        1.3 實驗儀器

        光學顯微鏡(型號:CX41-12C02),倒置熒光顯微鏡(型號:IX73)(日本,Olympus公司),激光共聚焦顯微鏡(日本,Nikon公司,型號:Nikon A1 R),NIS-Viewer圖像處理軟件系統(tǒng)(日本,Nikon公司),Bio-RadCFX96型實時定量PCR儀(美國,Bio-Rad公司),臺式低溫高速離心機(德國,Eppendorf公司,型號:5424R)。

        1.4 實驗分組

        采用隨機數(shù)字表法將30只小鼠分為三組,分別為假手術組、模型組和治療組。參考文獻[9],治療組小鼠灌服中藥顆粒劑水溶液5 mL/(kg·d)(含生藥6 g/mL),造模后第9周開始灌胃,連續(xù)8周,1次/d;假手術組和模型組小鼠灌服同體積生理鹽水,造模后第9周開始灌胃,連續(xù)8周,1次/d。

        1.5 小鼠去卵巢模型制作

        1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg,腹腔注射)麻醉小鼠后,俯臥位固定,腰椎后側(cè)正中切口約1 cm,切除雙側(cè)卵巢后將輸卵管、血管等結(jié)扎,縫合皮膚并消毒[10]。治療組和假手術組操作同上,但假手術組不切除卵巢,僅切除少許卵巢周圍的脂肪組織。術后第8天開始,采用陰道涂片法[11],觀察模型組和治療組小鼠動情周期,連續(xù)6 d,1次/d,若沒有出現(xiàn)規(guī)則的動情周期,則表明造模成功,造模失敗的小鼠棄去。

        1.6 HE染色

        心臟組織經(jīng)9%福爾馬林固定液過夜脫水后,石蠟包埋切片,切片組織經(jīng)過二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟,蘇木精染色3~5 min,1%鹽酸乙醇分化30 s,1%氨水返藍10 s,1%伊紅染色1 min,酒精脫水,晾干后封片。

        1.7 熒光探針標記超氧陰離子

        參考文獻[12],取適量濃度為2 mmol/L的DHE覆蓋心臟組織,37℃避光孵育30 min后封片。

        1.8 免疫熒光染色測定CD31和CD68的表達

        取適量山羊血清將組織切片進行封閉,滴加一抗(1∶250)4℃孵育過夜,PBS洗3次后滴加二抗(1∶200),37℃孵育1 h,PBS洗3次后封片。

        1.9 實時熒光定量PCR

        取新鮮心臟組織采用TRIzolR試劑盒提取總RNA,定量后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,將cDNA用熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)在Bio-rad CFX96實時熒光定量PCR儀上進行檢測相關mRNA的表達。反應條件:94℃變性2 min,94℃ 20 s,60℃ 34 s,44個循環(huán);最后加溶解曲線檢測。實時定量PCR的引物序列為:白細胞介素(IL)-1β(上游引物:5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′,下游引物:5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′);腫瘤壞死因子(TNF)-α(上游引物:5'-CGCGGATCCATGAGCACTGAAAGCATG-3′,下游引物:5'-CCGCTCGAGTCACA-GGGCAATGATCCCAAAG-3′);IL-10(上游引物:5′-TTTAGGCGAGAAGCTGAAGG-3′,下游引物:5′-TCT-TCACAGGGCAGGAATCT-3′);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(上游引物:5′-AGGCAGACTATTCAGCGGACTC-3′,下游引物:5′-CTCAAAACCGTTGGCACGA-3′);β-actin(上游引物:5′-CTGTATTCCCCTCCATCGTG-3′,下游引物:5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′)。

        1.10 統(tǒng)計學方法

        應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 一般狀況

        與假手術組比較,去卵巢小鼠陰道脫落細胞涂片見大量白細胞和少量角化上皮細胞,無周期性陰道細胞變化。20只去卵巢小鼠中,16只小鼠心肌組織變性,炎癥細胞不同程度浸潤,4只心肌結(jié)構(gòu)較為完整,故該模型造模成功率為80%。

        2.2 對心臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

        假手術組心肌結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,胞漿豐富;模型組心肌細胞腫脹,橫紋模糊,心肌組織出現(xiàn)變性,炎癥細胞浸潤增多,心肌間質(zhì)充血;治療組心肌組織結(jié)構(gòu)較為完整,炎癥細胞浸潤較模型組減少。見圖1A(封三)。

        2.3 對心臟組織超氧陰離子的影響

        與假手術組比較,模型組心臟組織超氧陰離子平均熒光強度升高,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05);與模型組比較,治療組超氧陰離子平均熒光強度降低,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。見圖1B(封三)。

        2.4 對心臟組織CD31表達的影響

        與假手術組比較,模型組心臟組織CD31平均熒光強度降低,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。與模型組比較,治療組CD31平均熒光強度升高,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。見圖1C(封三)。

        2.5 對心臟組織CD68表達的影響

        與假手術組比較,模型組心臟組織單位面積內(nèi)CD68表達數(shù)增多,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。模型組和治療組心臟組織單位面積內(nèi)CD68表達數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。見圖1D(封三)。

        2.6 對去卵巢小鼠心臟IL-1β、TNF-α、IL-10、VEGF mRNA表達的影響

        與假手術組比較,模型組心臟IL-1β、TNF-α mRNA表達水平升高(P < 0.05),IL-10、VEGF mRNA表達水平降低(P < 0.05)。與模型組比較,治療組心臟IL-1β、TNF-α mRNA表達水平降低(P < 0.05),IL-10、VEGF mRNA表達水平升高(P < 0.05)。見圖2。

        3 討論

        絕經(jīng)后女性心臟微血管病變發(fā)病率高,嚴重影響生活質(zhì)量,受到心血管領域?qū)W者廣泛重視。該病屬中醫(yī)“胸痹”“心痛”范疇,腎虛血瘀是其主要病理機制之一。前期研究證實[8-9],補腎活血顆粒對去卵巢大鼠心肌微血管的保護作用與阻斷NF-κBp50(IκBα)-IL-1β通路有關,且該復方濃度為3 g/mL時效果最佳。而IL-1β是M1型巨噬細胞的標志炎癥因子,故推測巨噬細胞表型與去卵巢心臟微血管損傷有關,同時為了探究補腎活血顆粒的保護作用,所以采用前期研究中效果最佳的濃度進行實驗。

        研究表明[13],心臟微血管病變中伴有炎癥細胞浸潤,促炎因子增多,超氧陰離子自由基積聚導致血管內(nèi)皮細胞受損。炎性反應中的巨噬細胞主要有M1和M2兩種表型,且M1可向M2極化[14]。M1促進炎性反應,分泌炎性因子,如IL-1β和TNF-α,增強炎性反應,導致組織損傷;M2抑制炎性反應,高表達IL-10,促進組織修復和血管生成[15-17]。

        本研究發(fā)現(xiàn),去卵巢模型心臟組織變性,單位面積內(nèi)的炎癥細胞、CD68細胞(M1/M2型巨噬細胞的共同標志[18])及IL-1β、TNF-α mRNA表達水平增多,超氧陰離子升高,表明去卵巢后心臟組織巨噬細胞浸潤增多,促炎因子分泌增多,炎性反應加重,致使心臟超氧陰離子積聚,同時發(fā)現(xiàn)VEGF和CD31表達下降,這一結(jié)果與以往研究[19]結(jié)果相同,即在炎性反應中超氧陰離子積聚與心臟微血管受損密切相關[20],提示小鼠去卵巢后會引起心臟微血管炎性損傷。同時,與模型組比較,治療組心臟組織結(jié)構(gòu)較為完整,單位面積內(nèi)炎癥細胞減少,VEGF和CD31表達升高,M2標志因子IL-10表達增多,M1標志因子IL-1β、TNF-α表達減少,且超氧陰離子降低,表明治療組心臟組織炎癥減弱,微血管損傷減輕。然而,治療組心臟單位面積內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量沒有明顯變化。以上結(jié)果表明,補腎活血顆粒改善心臟微血管損傷,與巨噬細胞的數(shù)量無關,而是使其極性發(fā)生了轉(zhuǎn)化,即M1向M2轉(zhuǎn)化,達到抑制微血管炎性反應和促進心臟微血管修復的雙重作用。

        總之,補腎活血顆粒治療去卵巢小鼠心臟微血管病變的機制可能與調(diào)控巨噬細胞M1/M2極化相關,即該復方干預后,M1/M2極化發(fā)生改變,炎性反應減弱,損傷組織得到修復,最終達到治療的目的。但是,由于本研究僅涉及到動物水平,初步探討了補腎活血顆粒對巨噬細胞極化的影響,其相關分子機制研究有待進一步探索。

        本研究在第四軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室完成,特別感謝。

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        (收稿日期:2017-01-23 本文編輯:張瑜杰)

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