向 敏，扈鴻霞，于 非，季 榮，王 晗 (中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心，新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學(xué)實驗室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

動物生產(chǎn)層

短時高溫處理對意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70蛋白表達的影響

向 敏，扈鴻霞，于 非，季 榮，王 晗
(中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心，新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學(xué)實驗室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

本研究采用免疫組織化學(xué)分析方法，測定了HSP70蛋白在意大利蝗卵子發(fā)生期的表達定位及33～42 ℃高溫處理對其相對表達量的影響。結(jié)果表明，1)在卵黃發(fā)生前期，卵母細胞和濾泡細胞均表達HSP70蛋白，而在卵黃發(fā)生期和卵黃發(fā)生后期，HSP70蛋白陽性表達位于濾泡細胞；2)在33～42 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70蛋白相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢；其中36 ℃處理組HSP70蛋白相對表達量最高，顯著高于27 ℃對照組(P<0.05)；42 ℃處理組HSP70蛋白相對表達量最低，但與27 ℃對照組差異不顯著(P>0.05)。短時高溫處理對意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70蛋白相對表達量有顯著影響，推測HSP70蛋白的表達在意大利蝗抵抗短時高溫脅迫過程中具有重要作用。

意大利蝗；高溫脅迫；HSP70；卵黃發(fā)生；免疫組織化學(xué)

近年來，全球氣候變暖的趨勢加劇，極端高溫發(fā)生的頻率增加[1-2]。昆蟲是變溫動物，對環(huán)境溫度高度敏感，極端高溫的出現(xiàn)對其生長發(fā)育、生理代謝及生殖等具有重要影響[2-3]。但是，田間高溫可能僅在某一天發(fā)生且僅持續(xù)幾個小時，而且昆蟲在長期進化過程中，形成了較強的適應(yīng)能力以應(yīng)對短期環(huán)境變化[4]，偶爾的高溫不會導(dǎo)致其死亡。然而，大量研究表明，昆蟲的生殖系統(tǒng)對高溫極其敏感，因此極端高溫的出現(xiàn)，可能對昆蟲的生殖系統(tǒng)造成影響[5-7]。

熱激蛋白(heat shock proteins，Hsps)的表達和調(diào)控是有機體應(yīng)對高溫脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[8-9]。HSP70是熱激蛋白家族的主要成員，在提高機體耐熱性方面具有重要作用。昆蟲在受到高溫脅迫后，其耐熱能力與HSP70的表達量正相關(guān)，且在一定溫度范圍內(nèi)，HSP70表達量隨溫度升高而增加[10-13]。此外，熱激蛋白家族與有機體生殖系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。侯賽尼[14]對熱應(yīng)激后家蠶卵巢和精巢進行檢測發(fā)現(xiàn)，HSP70表達上調(diào)。對哺乳動物研究表明，HSP70不僅參與精子發(fā)生和成熟過程，而且在卵子發(fā)生和卵母細胞存活方面具有重要作用[15]。

配子發(fā)生是決定昆蟲生殖力的基礎(chǔ)，是昆蟲種群繁衍和延續(xù)的重要保障。氣候變暖背景下，害蟲始終保持較高的產(chǎn)生配子的能力，是其持續(xù)發(fā)生并暴發(fā)成災(zāi)的重要原因[16-19]。其中，卵子發(fā)生在動物的個體發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，一般分為3個時期：卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期及卵黃發(fā)生后期。卵黃發(fā)生是昆蟲生殖調(diào)控的核心[20-21]，包括脂肪體合成卵黃原蛋白(vitellogenin，Vg)、卵巢攝取并沉積卵黃蛋白(vitellin，Vn)兩個主要過程。卵母細胞中卵黃蛋白的迅速積累，可促進卵母細胞和卵巢的發(fā)育成熟，亦可為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，有利于提高孵化率及幼蟲生長發(fā)育，對昆蟲種群數(shù)量有顯著影響[22]。

意大利蝗(Calliptamusitalicus)是新疆荒漠半荒漠草原的優(yōu)勢危害種類，每年給新疆的畜牧業(yè)經(jīng)濟、生態(tài)和社會造成嚴重的損失[23-24]。近年來，意大利蝗適生區(qū)氣溫升高明顯[25]，繁殖期(5月-8月)日極端高溫經(jīng)常會超過33 ℃，甚至出現(xiàn)42 ℃極端高溫，且極端高溫出現(xiàn)天數(shù)也在逐年增加[26]。田間短時高溫是否對意大利蝗生長繁殖造成影響？為此，本研究采用免疫組織化學(xué)分析方法，研究短時高溫處理對意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70表達的影響，在細胞水平上直觀分析HSP70蛋白在卵子發(fā)生中的準確定位及表達動態(tài)，以期為進一步探討溫度脅迫下意大利蝗卵子發(fā)生中HSP70蛋白在細胞水平的作用機理及分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)，同時闡明意大利蝗應(yīng)對高溫脅迫時HSP70在生殖系統(tǒng)中的調(diào)控作用，為在細胞水平上揭示蝗蟲生態(tài)適應(yīng)的耐熱機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

于新疆哈密白石頭鄉(xiāng)(93°80′ E，43°31′ N)采集意大利蝗末齡蝗蝻，置于室外(100 cm×100 cm ×100 cm養(yǎng)蟲籠)飼養(yǎng)，待成蟲羽化后，取同天羽化的成蟲，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)[30 cm×30 cm ×30 cm養(yǎng)蟲籠，(27±1) ℃，相對濕度(45%±5%)，光照周期L∶D = 14∶10]，以新鮮玉米葉、小麥葉飼喂，每天更換玉米葉與小麥葉。

1.2 溫度處理

根據(jù)前期試驗可知，意大利蝗羽化后10～15 d卵巢管內(nèi)存在各個時期的卵母細胞，故選取羽化后10～15 d蝗蟲進行溫度處理試驗。 對照組：將羽化后成蟲置于(27±1) ℃、RH(45%±5%)、光照周期L∶D = 14 ∶10條件下常規(guī)飼養(yǎng)。

試驗組：設(shè)置33、36、39、42 ℃ 4個溫度處理組，每個溫度梯度處理4 h，處理后將其放回(27±1) ℃、相對溫度(45%±5%)條件下恢復(fù)1 h。每個溫度處理15頭雌蟲，3個重復(fù)。

1.3 免疫組織化學(xué)分析

在0.65%生理鹽水中進行解剖取出卵巢，放入Bouin’s液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋與切片，切片厚度為6 μm。 將切片常規(guī)脫蠟入水，用0.01 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)于96 ℃修復(fù)抗原20 min，使其自然冷卻；加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；經(jīng)5%牛血清蛋白BSA室溫封閉20 min；滴加HSP70一抗(1∶100)(設(shè)滴加PBS組為陰性對照)，4 ℃過夜；滴加生物素標記的第二抗體(山羊抗兔IgG)，37 ℃處理20 min；滴加鏈霉親和素-生物素(SABC)復(fù)合物37 ℃處理20 min，增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片[27]。顯微鏡下觀察和拍照(Motic數(shù)碼顯微鏡BA310)。

免疫組織化學(xué)染色后棕黃色區(qū)域為陽性區(qū)域。不同溫度處理下隨機取10張片子，每張切片隨機選取3個視野，使用Image-pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析HSP70相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果，不同溫度處理組間HSP70相對表達量進行單因素方差分析，并采用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較。采用Excel 2013制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSP70蛋白在意大利蝗卵子發(fā)生期的定位

意大利蝗卵巢結(jié)構(gòu)為無滋式，只有卵母細胞和濾泡細胞，無滋養(yǎng)細胞。在生長區(qū)內(nèi)含有由大到小的卵母細胞，每個正在發(fā)育的卵母細胞被一層濾泡細胞包圍。參照趙卓[28]對10種蝗蟲卵子發(fā)生的劃分，根據(jù)意大利蝗卵母細胞和濾泡細胞形態(tài)及變化特征，將意大利蝗卵子發(fā)生分為3個時期，分別為卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期和卵黃發(fā)生后期。免疫組織化學(xué)分析顯示，在卵黃發(fā)生前期，卵母細胞和濾泡細胞均呈現(xiàn)HSP70蛋白陽性表達，而在卵黃發(fā)生期和卵黃發(fā)生后期，HSP70蛋白陽性表達僅位于濾泡細胞(圖1)。

圖1 意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70的特異性表達Fig. 1 Specific expression of HSP70 in the oogenesis of Calliptamus italicus

2.2 不同溫度下HSP70蛋白相對表達量差異分析

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，不同溫度下意大利蝗卵子發(fā)生期均有HSP70蛋白表達(圖2)。對免疫組織化學(xué)結(jié)果進行圖像分析后表明，短時高溫處理對意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70蛋白相對表達量有顯著影響，隨著溫度升高，HSP70蛋白相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(圖3)。在卵子發(fā)生不同時期，33、36、39 ℃處理組HSP70蛋白相對表達量均顯著高于對照組(27 ℃)(P<0.05)，其中36 ℃處理組HSP70蛋白相對表達量最高，卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期和卵黃發(fā)生后期分別為0.739、0.124和0.054。在卵子發(fā)生不同時期，42 ℃處理組HSP70蛋白相對表達量低于對照組(27 ℃)，但差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

3 討論

意大利蝗卵子發(fā)生過程中，隨著卵母細胞和濾泡細胞形態(tài)、大小及功能的變化，HSP70蛋白的定位及相對表達量亦發(fā)生顯著變化。在卵黃發(fā)生前期，卵母細胞和濾泡細胞均處于旺盛生長期， 在高溫脅迫下，卵母細胞和濾泡細胞均大量合成HSP70以保證卵子發(fā)生和發(fā)育。在卵黃發(fā)生期，HSP70蛋白陽性表達僅位于濾泡細胞，卵母細胞內(nèi)未檢測到HSP70蛋白的表達，且濾泡細胞分泌合成的HSP70蛋白并不向卵母細胞中移動，只停留并分布在濾泡細胞周圍，這可能是由于在卵黃發(fā)生期，卵母細胞主要進行卵黃蛋白的積累以保證機體的繁殖力[28]，故僅由濾泡細胞合成HSP70蛋白抵抗高溫脅迫。在卵黃發(fā)生后期，由于濾泡細胞逐漸退化，HSP70蛋白相對表達量減少。

熱激蛋白是普遍存在于原核和真核生物中的一類高度保守的蛋白，其表達不僅有助于昆蟲耐熱性的獲得，且在昆蟲的生殖、發(fā)育等方面起著一定的作用[29-31]。本研究表明，對照組和處理組意大利蝗卵子發(fā)生期的濾泡細胞均可表達HSP70蛋白，且在適宜生長溫度(27 ℃)、旺盛生長溫度(33、36 ℃)和熱脅迫溫度(39、42 ℃)下[32-34]，HSP70蛋白相對表達數(shù)量呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，表明意大利蝗體內(nèi)能夠大量合成熱激蛋白以應(yīng)對高溫脅迫，從而對機體起重要的保護作用[35]。20～30 ℃是意大利蝗生長發(fā)育適宜的溫度條件[33]，故在此溫度范圍對意大利蝗并不構(gòu)成脅迫，細胞內(nèi)表達的HSP70蛋白與熱應(yīng)激無關(guān)，主要為生理條件下表達的組成型HSP70蛋白[36-37]。意大利蝗成蟲在29～35 ℃生長最為旺盛[32]，為促進卵子發(fā)生及卵巢發(fā)育，機體可能大量合成組成型HSP70蛋白。同時，高于30 ℃的溫度條件對意大利蝗造成一定熱脅迫，機體可能合成大量誘導(dǎo)型HSP70蛋白以提高其耐熱性。組成型HSP70蛋白和誘導(dǎo)型HSP70蛋白的累積，可能是33和36 ℃處理組HSP70蛋白相對表達量顯著增加的主要原因。當(dāng)溫度升高至39和42 ℃時，HSP70蛋白相對表達量顯著下降(P<0.05)，表明HSP70蛋白的熱保護作用只能在一定溫度范圍內(nèi)起作用[11,27,38]。但39、42 ℃處理組意大利蝗存活率仍為100%(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，這可能是由于除HSP70蛋白外，機體仍能通過合成熱激蛋白家族其他蛋白以增強機體耐熱性[39-41]。

圖2 不同溫度下HSP70蛋白表達的免疫組織化學(xué)分析Fig. 2 Immunohistochemical assay of HSP70 expression at different temperatures

圖3 意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70相對表達量Fig. 3 The relative expression level of HSP70 positive in oogenesis of Calliptamus italicus

注：不同小寫字母表示不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference among different temperatures at the 0.05 level.

本研究表明，在一定溫度范圍內(nèi)，高溫脅迫可引起意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70蛋白表達增強，以此提高其生殖系統(tǒng)的高溫耐受性。HSP家族中HSP70對環(huán)境脅迫最為敏感[42-43]。在溫度脅迫條件下，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量變性蛋白，而HSP70蛋白作為一種非特異性保護蛋白，可幫助變性蛋白恢復(fù)正確構(gòu)象，從而增強生物的耐熱能力，這可能是熱激蛋白在脅迫細胞內(nèi)的重要保護機制[44]。

References:

[1] Rahmstorf S,Coumou D.Increase of extreme events in a warming world.Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,2011,108(44):17905-17909.

[2] 梁利娜.溫度對梨小食心蟲生殖及滯育的影響.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文,2014. Liang L N.The effect of temperature on reproduction and diapause ofGrapholithamolesta(Busck) (Lepidoptera:Tortricidae).Master Thesis.Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2014.(in Chinese)

[3] 高書晶,韓海斌,王寧,徐林波,劉愛萍,特木爾.溫濕度對亞洲小車蝗飛行能力及主要能源物質(zhì)利用的影響.草業(yè)科學(xué),2016,33(7):1410-1417. Gao S J,Han H B,Wang N,Xu L B,Liu A P,Temuer.Influences of temperature and humidity conditions on flight capacity and main utilization of energy substances inOedaleusasiaticus.Pratacultural Science,2016,33(7):1410-1417.(in Chinese)

[4] Hoffmann A A,Sgrò C M.Climate change and evolutionary adaptation.Nature,2011,470:479-485.

[5] 王竑晟,徐洪富,崔峰.高溫處理對甜菜夜蛾雌蟲成蟲期生殖力及卵巢發(fā)育的影響.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,19(5):916-919. Wang H S,Xu H F,Cui F.Effect of high temperature on fecundity and ovary development of beet armywormSpodopteraexigua(Hǜbner).Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2006,19(5):916-919.(in Chinese)

[6] Guo J Y,Cong L,Zhou Z S,Wan F H.Multi-generation life tables ofBemisiatabaci(Gennadius) biotype B (Hemiptera:Aleyrodidae) under high temperature stress.Environmental Entomology,2012,41(6):1672-1679.

[7] Mironidis G K,Savopoulou-Soultani M.Effects of heat shock on survival and reproduction ofHelicoverpaarmigera(Lepidoptera:Noctuidae) adults.Journal of Thermal Biology,2010,35(2):59-69.

[8] Wan F H,Zhang G F,Liu S S,Luo C,Chu D,Zhang Y J,Zang L S,Jiu M,Lyu Z C,Cui X H,Zhang L P,Zhang F,Zhang Q W,Liu W X,Liang P,Lei Z R,Zhang Y J.Invasive mechanisms and management strategy ofBemisiatabaci(Gennadius) Biotype B:Progress report of 973 Program on invasive alien species in China.Science in China,Series C:Life Sceinces,2009,52(1):88-95.

[9] 王歡,李凱,方琦,葉恭銀.蝶蛹金小蜂熱激蛋白家族基因表達與熱保護功能.昆蟲學(xué)報,2012,55(8):903-910. Wang H,Li K,Fang Q,Ye G Y.Prokaryotic expression and thermo-protective function of heat shock proteins fromPteromaluspuparum(Hymenoptera:Pteromalidae).Acta Entomologica Sinica,2012,55(8):903-910.(in Chinese)

[10] Kalosaka K,Soumaka E,Politis N,Mintzas A C.Thermotolerance and HSP70 expression in the Mediterranean fruit flyCeratitiscapitata.Journal of Insect Physiology,2009,55(6):568-573.

[11] 鄭丹,崔旭紅,李紅亮,蔡沖,高永生,商晗武.三葉草斑潛蠅hsp70的克隆及其表達量在高低溫脅迫下的變化.植物保護學(xué)報,2010,37(2):159-164. Zheng D,Cui X H,Li H L,Cai C,Gao Y S,Shang H W.Cloning of heat shock protein gene,hsp70,inLiriomyzatrifoliiand its expression under temperature stress.Acta Phytophylacica Sinica,2010,37(2):159-164.(in Chinese)

[12] 馬文靜,馬紀.小胸鱉甲熱激蛋白基因(Mphsp70)的克隆、序列分析及溫度對其表達的影響.應(yīng)用昆蟲學(xué)報,2012,49(2):439-447. Ma W J,Ma J.Cloning and sequence analysis of a heat shock protein gene(Mphsp70) fromMicroderapunctipennisand its expression in relation to high temperatures.Chinese Journal of Applied Entomology,2012,49(2):439-447.(in Chinese)

[13] 石萌,劉曉靜,劉小寧,馬紀.溫度脅迫對荒漠昆蟲小胸鱉甲(鞘翅目:擬步甲科)幼蟲熱激蛋白基因hsp70 表達的影響.環(huán)境昆蟲學(xué)報,2014,36(3):335-342. Shi M,Liu X J,Liu X N,Ma J.Effect of thermal stresses on hsp70 gene expression in larvae of the desert insectMicroderapunctipennis(Coleoptera:Tenebrionidae).Journal of Environmental Entomology,2014,36(3):335-342.(in Chinese)

[14] 侯賽尼.家蠶耐高溫相關(guān)熱激蛋白的研究.杭州:浙江大學(xué)博士學(xué)位論文,2009. Seyed H H M.Proteomic analysis of heat shock proteins related to thermal tolerance in the silkworm,BombyxmoriL.PhD Thesis.Hangzhou:Zhejiang University,2009.(in Chinese)

[15] Block J,Chase C C,Hansen P J.Inheritance of resistance of bovine preimplantation embryos to heat shock:Relative importance of the maternal versus paternal contribution.Molecular Reproduction and development,2002,63(1):32-37.

[16] John T T,Casey D B.Climate change will exacerbate California’s insect pest problems.California Agriculture,2009,63(2):73-78.

[17] 陳瑜,馬春森.氣候變暖對昆蟲影響研究進展.生態(tài)學(xué)報,2010,30(8):2159-2172. Chen Y，Ma C S.Effect of global warming on insect:A literature review.Acta Ecologica Sinica,2010,30(8):2159-2172.(in Chinese)

[18] 戈峰.應(yīng)對全球氣候變化的昆蟲學(xué)研究.應(yīng)用昆蟲學(xué)報,2011,48(5):1117-1122. Ge F.Challenges facing entomologists in a changing global climate.Chinese Journal of Applied Entomology,2011,48(5):1117-1122.(in Chinese)

[19] Poyry J,Leinonen R,Soderman G,Nieminen M,Heikkinen R K,Carter T R.Climate-induced increase of moth multivoltinism in boreal regions.Global Ecology and Biogeography,2011,20(2):289-298.

[20] Amdam G V,Page R E,Fondrk M K,Brent C S.Hormone response to bidirectional selection on social behavior.Evolution & Development,2010,12(5):428-436.

[21] 戈林泉,吳進才.昆蟲卵黃蛋白及其激素調(diào)控的研究進展.昆蟲知識,2010,47(2):236-246. Ge L Q,Wu J C.Research progress in insect vitellin and its hormone regulation.Chinese Bulletin of Entomology,2010,47(2):236-246.(in Chinese)

[22] 龔和,翟啟慧.昆蟲卵黃原蛋白和卵黃發(fā)生.昆蟲學(xué)報,1979,22(2):219-236. Gong H,Zhai Q H.Insect vitellogenin and vitellogeneses.Acta Entomologica Sinica,1979,22(2):219-236.(in Chinese)

[23] 洪軍,倪亦非,杜桂林,贠旭疆.我國天然草原蟲害危害現(xiàn)狀與成因分析.草業(yè)科學(xué),2014,31(7):1374-1379. Hong J,Ni Y F,Du G L,Yun X J.Current situation and cause analysis of grassland pests on grassland in China.Pratacultural Science,2014,31(7):1374-1379.(in Chinese)

[24] 薛智平,張泉,牙森·沙力,王廣君,阿不都外力·伊瑪木,肖宏偉.意大利蝗取食特性及損失估計研究.植物保護,2010,36(1):95-98. Xue Z P,Zhang Q,Yasen·Shali,Wang G J,Abudouwaili·Yimamu,Xiao H W.Food selection ofCalliptamusitalicusand loss assessment for the grassland.Plant Protection,2010,36(1):95-98.(in Chinese)

[25] 王晗,于非,扈鴻霞,季榮.新疆意大利蝗適生區(qū)的氣候變化特征分析.中國農(nóng)業(yè)氣象,2014,35(6):611-621. Wang H,Yu F,Hu H X,Ji R.Climatic changes in suitable distribution areas ofCalliptamusitalicusL. Chinese Journal of Agrometeorology,2014,35(6):611-621.(in Chinese)

[26] 中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng).http://data.cma.cn/.

[27] 崔亞東,陸明星,杜予州.二化螟熱休克蛋白70基因的克隆及熱脅迫下的表達分析.昆蟲學(xué)報,2010,53(8):841-848. Cui Y D,Lu M X,Du Y Z.Cloning of the heat shock protein 70 gene fromChilosuppressalisand the analysis of its expression characteristics under heat stress.Acta Entomologica Sinica,2010,53(8):841-848.(in Chinese)

[28] 趙卓.東北四平地區(qū)蝗蟲配子發(fā)生及原癌基因c-kit特異性表達的生殖生態(tài)學(xué)研究.西安:陜西師范大學(xué)博士學(xué)位論文,2005. Zhao Z.Study on reproductive ecology of the specific expression ofc-kitduring locust gametogenesis in siping,Northeast of China.PhD Thesis.Xi’an:Shaanxi Normal University,2005.(in Chinese)

[29] 翟會芳,江幸福,羅禮智.甜菜夜蛾HSP90基因克隆及高溫脅迫下其表達量的變化.昆蟲學(xué)報,2010,53(1):20-28. Zhai H F,Jiang X F,Luo L Z.Cloning and expression ofHSP90 cDNA in larvae of the beet armyworm,Spodopteraexigua(Lepidoptera:Noctuidae) under high temperature stress.Acta Entomologica Sinica,2010,53(1):20-28.(in Chinese)

[30] Chapuis M P,Simpson S J,Blondin L,Sword G A.Taxa-specific heat shock proteins are over-expressed with crowding in theAustralianplaguelocust.Journal of Insect Physiology,2011,57(11):1562-1567.

[31] 申建茹,李明福,陳乃中,王進軍,萬方浩.蘋果蠹蛾熱激蛋白Hsp90基因的克隆及熱脅迫下的表達分析.昆蟲學(xué)報,2011,54(11):1236-1248. Shen J R,Li M F,Chen N Z,Wang J J,Wan F H.Cloning and analysis of the expression characteristics under heat stress ofHsp90 gene in the codling moth,Cydiapomonella(Lepidoptera:Tortricidae).Acta Entomologica Sinica,2011,54(11):1236-1248.(in Chinese)

[32] 趙忠偉,張英財,曹廣春,張澤華.溫度對意大利蝗生長發(fā)育的影響.應(yīng)用昆蟲學(xué)報,2013,50(2):466-473. Zhao Z W,Zhang Y C,Cao G C,Zhang Z H.Influence of temperature on the development ofCalliptamusitalicus.Chinese Journal of Applied Entomology,2013,50(2):466-473.(in Chinese)

[33] 王冬梅,李娟,李爽,扈鴻霞,季榮.溫度對意大利蝗呼吸代謝的影響.昆蟲學(xué)報,2014,57(3):373-378. Wang D M,Li J,Li S,Hu H X,Ji R.Effects of temperature on the respiratory metabolism ofCalliptamusitalicus(Orthoptera:Acrididae).Acta Entomologica Sinica,2014,57(3):373-378.(in Chinese)

[34] 任金龍,趙莉,趙炎,葛婧.意大利蝗對溫度耐受力的初探.草業(yè)科學(xué),2015,32(2):274-280. Ren J L,Zhao L,Zhao Y,Ge J.A preliminary study on temperature to lerance ability ofCalliptamusitalicus.Pratacultural Science,2015,32(2):274-280.(in Chinese)

[35] Xu J J,Shu J,Zhang Q.Expression of theTriboliumcastaneum(Coleoptera:Tenbrionidae)hsp90 gene and its relation to oogenesis during ovarian maturation.Journal of Genetics and Genomics,2010,37(8):513-522.

[36] Craig E A.The heat shock response.CRC Critical Reviews in Biochemistry,1985,18(3):239-280.

[37] Gething M J,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33-45．

[38] 張毅智.刺桐姬小蜂熱激蛋白HSP70和HSP90基因克隆與分析.福州:福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012. Zhang Y Z.Cloning and analysis ofHSP70 andHSP90 ofQuadrastichuserythrinaeKim(Hymenoptera:Eulophidae).Master Thesis.Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University,2012.(in Chinese)

[39] 王海鴻,雷忠仁.昆蟲熱休克蛋白的研究進展.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(10):2023-2034. Wang H H,Lei Z R.Current developments of heat shock proteins in insect.Scientia Agricultura Sinica,2005,38(10):2023-2034.(in Chinese)

[40] Sonoda S,Ashfaq M,Tsumuki H.Cloning and nucleotide sequencing of three heat shock protein genes (hsp90,hsc70,andhsp19.5) from the diamondback moth,Plutellaxylostella(L.) and their expression in relation to developmental stage and temperature.Archives of Insect Biochemistry and Physiology,2006,62:80-90.

[41] Zhang Q R,Denlinger D L.Molecular characterization of heat shock protein 90,70 and 70 cognate cDNAs and their expression patterns during thermal stress and pupal diapause in the corn earworm.Journal of Insect Physiology,2010,56(2):138-150.

[42] Aruda A M,Baumgartner M F,Reitzel A M,Tarrant A M.Heat shock protein expression during stress and diapause in the marine copepodCalanusfinmarchicus.Journal of Insect Physiology,2011,57(5):665-675.

[43] Jiang X F,Zhai H F,Wang L,Luo L Z,Sappington T W,Zhang L.Cloning of the heat shock protein 90 and 70 genes from the beet armyworm,Spodopteraexigua,and expression characteristics in relation to thermal stress and development.Cell Stress and Chaperones,2012,17(1):67-80.

[44] Colinet H,Lee S F,Hoffmann A.Temporal expression of heat shock genes during cold stress and recovery from chill coma in adultDrosophilamelanogaster.FEBS Journal,2010,277(1):174-185．

(責(zé)任編輯 武艷培)

Effects of brief exposure to high temperatures on HSP70 expression in oogenesis ofCalliptamusitalicus

Xiang Min， Hu Hong-xia， Yu Fei， Ji Rong， Wang Han
(International Research Center for the Collaborative Containment of Cross-Border Pests in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology, College of Life Sciences, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)

The expression of heat shock protein 70 (HSP70) in the oogenesis ofCalliptamusitalicuswas detected by immunohistochemistry after the exposure of adult insects to temperatures of 33, 36, 39, and 42 ℃ for 4 h. The results showed that HSP70 was expressed in the oocytes and follicular cells during the previtellogenic stage, but was only expressed in the follicular cells only during the vitellogenic and postvitellogenic stages. The relative expression of HSP70 showed an initial increase, but then decreased with an increase in temperature in the range from 33～42 ℃. The highest expression, which was significantly higher than those in the control (27 ℃), was observed when adult insects were exposed to 36 ℃ (P<0.05). The lowest expression was observed when adults were exposed to 42 ℃, but there was no significant difference between treatment at 42 and 27 ℃ (P>0.05). The relative expression of HSP70 was significantly different at different temperatures, which may be critical for the resistance and adaptation ofC.italicusto brief exposure to high temperature.

Calliptamusitalicus; brief exposure to high temperature; HSP70; vitellogenesis; immunohistochemistry

Wang Han E-mail:wanghanguoxi@sina.com

2016-07-20 接受日期：2017-03-24

國家自然科學(xué)基金(31260104)；新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室開放課題(2015KL028)；科技部國際合作專項(2015DFR30290)；新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控實驗室資助項目

向敏(1992-)，女，新疆庫爾勒人，在讀碩士生，研究方向為昆蟲生殖生態(tài)學(xué)。E-mail:1441109005@qq.com

王晗(1980-)，女，河北邢臺人，副教授，博士，研究方向為昆蟲生理生態(tài)學(xué)及適應(yīng)機制。E-mail:wanghanguoxi@sina.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0397

S433.2

A

1001-0629(2017)06-1299-07

向敏，扈鴻霞，于非，季榮，王晗.短時高溫處理對意大利蝗卵子發(fā)生期HSP70蛋白表達的影響.草業(yè)科學(xué),2017,34(6)：1299-1305.

Xiang M.Hu H X,Yu F,Ji R,Wang H.Effects of brief exposure to high temperatures on HSP70 expression in oogenesis ofCalliptamusitalicus.Pratacultural Science，2017,34(6)：1299-1305.