徐 健，韓 雪，劉春芳，趙俊軍，李 平，任麗娜，江 玲，王妮妮

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院 呼吸科，遼寧 大連 116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116033)

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惡性胸腔積液去血細(xì)胞塊臨床應(yīng)用價(jià)值研究

徐 健1，韓 雪1，劉春芳1，趙俊軍2，李 平2，任麗娜1，江 玲1，王妮妮1

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院 呼吸科，遼寧 大連 116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116033)

目的 通過(guò)與胸膜配對(duì)比較觀察去血細(xì)胞塊的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集2015年1月至2016年6月在大連市中心醫(yī)院呼吸科就診的可疑惡性胸腔積液患者36例，血性積液占47.22%。使用50%酒精作為去血?jiǎng)┲瞥杉?xì)胞塊，隨后行內(nèi)科胸腔鏡獲得胸膜病理結(jié)果。通過(guò)與胸膜病理對(duì)比觀察去血細(xì)胞塊的檢出率、制片質(zhì)量、免疫組化染色的差異。結(jié)果 血性、非血性積液的細(xì)胞塊及胸膜病理的檢出率分別為64.71%、78.95%、88.89%，血性與非血性細(xì)胞塊比較及兩組與胸膜病理比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞塊聯(lián)合胸膜病理檢出率在非血性、淡血色及深血色胸腔積液中可達(dá)94.74%、100%及100%。非血性、淡血色與深血色積液細(xì)胞塊切片中不能用于診斷切片的檢出率分別為10.53%(9/51)，9.52%(2/21)，20.00%(6/30)，兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紅細(xì)胞背景干擾診斷的切片在上述3組中檢出率分別為0、0、7.84%(4/30)，深血色積液組與其他兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。去血細(xì)胞塊與配對(duì)胸膜的免疫組化染色結(jié)果對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 細(xì)胞塊病理作為一種創(chuàng)傷更小的檢查方法，能夠成為胸膜病理的補(bǔ)充。

胸腔積液；胸膜疾?。粣盒孕厍环e液；細(xì)胞塊；胸膜病理

隨著肺癌等惡性腫瘤發(fā)病率的逐年上升，惡性胸腔積液的患者數(shù)量也逐年增加。依據(jù)積液中細(xì)胞的數(shù)量、分類(lèi)及百分比、腫瘤標(biāo)記物及細(xì)胞學(xué)涂片等診斷的方法已經(jīng)不能滿足臨床的需要。而且部分惡性積液為血性的，積液中紅細(xì)胞數(shù)量過(guò)多掩蓋了腫瘤細(xì)胞，干擾診斷結(jié)果。一些文獻(xiàn)使用氯化銨、乙醇、甲醇、冰醋酸等化學(xué)劑作為去血?jiǎng)┨幚硌苑e液，并證明經(jīng)去血處理的細(xì)胞涂片紅細(xì)胞溶解破壞，背景干凈，腫瘤細(xì)胞核膜保存完好[1-2]。由于細(xì)胞涂片陽(yáng)性率只有60%左右，一些胸膜疾病如惡性胸膜間皮瘤也不能依據(jù)細(xì)胞涂片確診[3]，本文中使用50%酒精作為去血?jiǎng)┨幚硌孕厍环e液再制成細(xì)胞塊，通過(guò)與胸膜病理的配對(duì)對(duì)比，觀察去血細(xì)胞塊在檢出率、切片質(zhì)量、免疫組化染色等方面的差異，明確去血細(xì)胞塊的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

收集2015年1月至2016年6月在大連市中心醫(yī)院呼吸科就診的、新發(fā)現(xiàn)的、臨床懷疑惡性的胸腔積液。所有病例先行單腔靜脈留置針胸腔閉式引流術(shù)引流積液行胸水常規(guī)、LDH、蛋白定量、細(xì)胞涂片等檢測(cè)，排除漏出性、未確診、確診炎性及細(xì)胞涂片確診惡性的胸腔積液。將肉眼非血性和血性胸腔積液按照不同的方法制成細(xì)胞塊用于評(píng)估。血性積液再按照積液中紅細(xì)胞數(shù)量分為淡血色組(紅細(xì)胞數(shù)量8000～40000個(gè)/mm3)和深血色組(紅細(xì)胞數(shù)量≥40000個(gè)/mm3)。

最終入選符合標(biāo)準(zhǔn)患者36例，男24例，女12例，平均年齡(68.44±12.98)歲。其中肉眼非血性胸腔積液19例，包括肺腺癌轉(zhuǎn)移16例，惡性胸膜間皮瘤1例，B細(xì)胞及T細(xì)胞淋巴瘤各1例；血性胸腔積液17例，包括肺腺癌轉(zhuǎn)移8例，惡性胸膜間皮瘤3例，B細(xì)胞淋巴瘤2例，乳腺癌胸膜轉(zhuǎn)移2例，肺鱗狀細(xì)胞癌胸膜轉(zhuǎn)移1例，惡性胸膜間皮瘤伴前列腺癌1例。血性積液占47.22%，深血色積液占27.78%。

1.2 細(xì)胞塊制作方法

去血細(xì)胞塊的制作方法：(1)血性胸腔積液200 mL，以2000 r/min離心10 min；(2)棄上清，保留沉淀細(xì)胞；(3)等體積50%酒精作為去血?jiǎng)┘尤爰?xì)胞沉淀中旋渦震蕩15 s；(4)加入等體積生理鹽水，以2000 r/min離心10 min，棄上清液，保留沉淀細(xì)胞；(5)深血色積液可重復(fù)(3)、(4)步驟一次；(6)生理鹽水洗滌沉淀細(xì)胞并離心1次；(7)濾紙包裹細(xì)胞沉淀，10%甲醛固定30 min；(8)石蠟包埋制成細(xì)胞蠟塊。

非血性胸腔積液細(xì)胞塊的制作方法：按以上制作步驟的(1)、(2)、(6)、(7)、(8)。

1.3 胸膜病理檢查

入選病例均行內(nèi)科胸腔鏡獲得胸膜組織病理證實(shí)。所用內(nèi)科胸腔鏡為日本Olympus LTF240。

檢查前半小時(shí)經(jīng)留置的引流管緩慢注入約300～500 mL空氣制成人工氣胸，行胸片或肺CT檢查人工氣胸的部位及效果。一些粘連較重?zé)o法進(jìn)行人工氣胸的，可使用尿激酶1萬(wàn)U溶于20 mL生理鹽水經(jīng)留置的引流管注入，約10 h(一夜)后放開(kāi)引流管引出積液及藥物，再行人工氣胸。胸腔鏡檢查時(shí)對(duì)患者行心電、血壓、脈搏、血氧飽和度監(jiān)測(cè)，予2 L/min氧氣吸入?；颊呷〗?cè)臥位，常規(guī)選腋前線至腋后線間第5～7 肋間為進(jìn)鏡部位，胸膜粘連的可根據(jù)胸片或肺CT顯示的包裹性氣胸所在部位適當(dāng)調(diào)整。常規(guī)消毒敷單，2 %利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉達(dá)胸膜，切開(kāi)皮膚約1.5～2.0 cm，鈍性分離皮下組織到胸膜腔，插入Trocar拔出內(nèi)芯后送入胸腔鏡檢查。按順序觀察肋、膈、縱膈、臟層胸膜及肺表面等。直視下多次、多部位取材可疑病變8～12塊送病理檢查。檢查結(jié)束退出胸腔鏡，拔除Trocar，縫合手術(shù)切口。經(jīng)預(yù)置的引流管抽盡胸腔積氣再夾閉導(dǎo)管。次日若無(wú)氣體引出，則復(fù)查胸片觀察肺復(fù)張情況[4]。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)

以細(xì)胞塊或/和胸膜病理陽(yáng)性結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，如兩者結(jié)果不一致以胸膜病理為準(zhǔn)，如兩者均陰性而積液仍考慮為惡性的，以近期其他組織病理(如肺活檢等)獲得陽(yáng)性結(jié)果為準(zhǔn)。

1.5 切片質(zhì)量評(píng)估

細(xì)胞退變?cè)u(píng)估：每個(gè)細(xì)胞塊切3張切片行HE染色。每張切片由2名病理科醫(yī)師分別觀察切片中非紅細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)是否完整，可否用于病理診斷，記錄每個(gè)細(xì)胞塊中不能用于診斷的切片個(gè)數(shù)，觀察組間的差異。

去紅細(xì)胞效果評(píng)估：觀察上述HE染色的切片中紅細(xì)胞及細(xì)胞碎片背景是否干擾診斷，記錄每個(gè)病例不可用于診斷的切片個(gè)數(shù)，觀察各組的差異。

1.6 免疫組化一致性評(píng)估

入選病例中選擇細(xì)胞塊和胸膜病理均陽(yáng)性的，將細(xì)胞塊和胸膜組織塊重新切片進(jìn)行免疫組化染色。為避免染色條件導(dǎo)致的誤差將同一病例的細(xì)胞塊和胸膜切片配對(duì)置于一個(gè)玻片上進(jìn)行固定、脫蠟、免疫組化染色。染色超過(guò)10%的切片為陽(yáng)性。將淺棕、棕色、深棕色定義為+(1分)、++(2分)、+++(3分)；將染色細(xì)胞的百分比分為10%～25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)、超過(guò)75%(4分)；將兩者分?jǐn)?shù)的乘積作為免疫組化染色的最終分?jǐn)?shù)，1～3分為+，4～6分為++，7～9分為+++，10～12分為++++。對(duì)比去血細(xì)胞塊與配對(duì)胸膜、細(xì)胞塊與配對(duì)胸膜切片免疫組化染色陽(yáng)性的一致性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件的McNemar檢驗(yàn)方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞塊與胸膜病理檢出率差異作顯著性檢驗(yàn)，Chi-square檢驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組檢查率差異的顯著性，兩配對(duì)樣本的Wilcoxon檢驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞塊和胸膜免疫組化染色的吻合程度。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞塊病理的檢出率

血性、非血性積液細(xì)胞塊及胸膜病理的檢出率分別為64.71%(11/17)、78.95%(15/19)和88.89%(32/36)，細(xì)胞塊與胸膜病理的檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。血性與非血性積液細(xì)胞塊比較，檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074)；深血色積液(使用兩次去血?jiǎng)?細(xì)胞塊與非血性比較，檢出率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)。細(xì)胞塊聯(lián)合胸膜病理檢出率在非血性、淡血色及深血色胸腔積液中可達(dá)94.74%、100%及100%。

表1 細(xì)胞塊與胸膜病理的檢出率比較

非血性積液組陰性病例包括2例細(xì)胞塊病理陰性但胸膜病理陽(yáng)性的肺腺癌；1例細(xì)胞塊病理為腺癌但胸膜病理為間皮細(xì)胞增生，又經(jīng)肺活檢證實(shí)為肺腺癌；1例細(xì)胞塊病理為腺癌，胸膜病理為惡性胸膜間皮瘤最終診斷為惡性胸膜間皮瘤；1例胸腔積液CEA升高，但細(xì)胞塊及胸膜病理均陰性，支氣管鏡病理證實(shí)為肺腺癌。

淡血色胸腔積液陰性病例包括1例細(xì)胞塊病理為間皮細(xì)胞增生，胸膜病理為惡性胸膜間皮瘤；1例細(xì)胞塊病理陰性，胸膜病理為肺腺癌。

深血色胸腔積液陰性病例包括2例細(xì)胞塊病理為炎性，胸膜病理為肺腺癌；2例細(xì)胞塊病理為間皮細(xì)胞增生，胸膜病理為惡性胸膜間皮瘤，其中1例并發(fā)前列腺癌；1例細(xì)胞塊病理為腺癌，胸膜病理陰性，最終經(jīng)肺活檢證實(shí)為肺腺癌；1例細(xì)胞塊病理為小B細(xì)胞淋巴瘤，胸膜病理為炎癥，最終診斷為B細(xì)胞淋巴瘤。

2.2 細(xì)胞退變?cè)u(píng)估

比較非血性、淡血色與深血色積液細(xì)胞塊切片中不能用于診斷切片的檢出率分別為10.53%(9/51)，9.52%(2/21)，20.00%(6/30)，兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

2.3 去紅細(xì)胞效果評(píng)估

因紅細(xì)胞背景干擾影響診斷的切片檢出率在非血性、淡血色與深血色積液細(xì)胞塊中分別為0、0、7.84%(4/30)，深血色積液組與非血性、淡血色積液組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即切片中大量紅細(xì)胞背景可干擾診斷的陽(yáng)性結(jié)果(圖1)。

圖1 深血色胸腔積液未去血制成細(xì)胞塊與去血制成的細(xì)胞塊病理切片比較(HE染色×10)Fig 1 Comparison of the cell blocks with or without RBC removal in the dark bloody effusion (HE stained×10)

2.4 細(xì)胞塊病理與胸膜病理免疫組化一致性評(píng)估

選擇細(xì)胞塊及胸膜病理均陽(yáng)性病例20例，包括肺腺癌胸膜轉(zhuǎn)移15例，乳腺癌胸膜轉(zhuǎn)移2例，淋巴瘤3例。所有病例均進(jìn)行TTF-1、CK染色，2例乳腺癌再行GATA3、ER、PR染色，3例淋巴瘤行CD3、CD20染色。兩組免疫組化結(jié)果對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.315)。

其中去血細(xì)胞塊6例，包括肺腺癌胸膜轉(zhuǎn)移3例，乳腺癌胸膜轉(zhuǎn)移2例，淋巴瘤1例。去血細(xì)胞塊與胸膜免疫組化染色配對(duì)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.531)，即50%酒精作為去血?jiǎng)┎荒茱@著干擾細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，去血細(xì)胞塊與胸膜免疫組化結(jié)果一致(圖2)。

a與b為肺腺癌胸膜轉(zhuǎn)移的細(xì)胞塊、胸膜病理TTF-1染色結(jié)果(×20)，c-f為乳腺癌胸膜轉(zhuǎn)移的細(xì)胞塊、胸膜病理ER(c、d)和GATA3(e、f)染色結(jié)果(×20)圖2 細(xì)胞塊與胸膜病理免疫組化染色對(duì)照Fig 2 Comparison of immunohistochemical stains between cell blocks and pleural biopsy

3 討 論

全身的惡性疾病晚期均可發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移，成為惡性胸腔積液的病因。細(xì)胞涂片雖然是診斷的重要技術(shù)，但陽(yáng)性率不高，診斷也常出現(xiàn)誤差。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞涂片考慮為良性的病例有0.2%經(jīng)細(xì)胞塊證實(shí)為惡性，考慮為惡性的有0.6%經(jīng)細(xì)胞塊證實(shí)為良性，可疑為惡性的有42%經(jīng)細(xì)胞塊證實(shí)為良性[5]。因此，細(xì)胞涂片的敏感性為50%，特異性為90%，而細(xì)胞塊的敏感性、特異性均為100%。細(xì)胞塊的制作方法有許多。Jing等[6]比較了血凝酶、組織膠、CTC等方法制作的細(xì)胞塊，顯示3種方法均可以保持細(xì)胞的完整性，血凝酶方法更好地保留了細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。Kruger等[7]比較了CellientTM自動(dòng)系統(tǒng)與凝膠法制作的細(xì)胞塊，提出CellientTM雖然提高了細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的顯示但在細(xì)胞分類(lèi)、PASD染色、免疫組織化學(xué)染色的強(qiáng)度和清晰度方面無(wú)差異。K?ksal等[8]也報(bào)道細(xì)胞塊病理能夠顯著提高檢出率。本文收集36例胸腔積液均為細(xì)胞涂片陰性病例，細(xì)胞塊病理檢出率分別為64.71%(血性)、78.95%(非血性)，提高了檢出率，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本文中細(xì)胞塊聯(lián)合胸膜病理診斷的陽(yáng)性率在非血性、淡血色及深血色胸腔積液中可達(dá)94.74%、100%及100%。但是，5例惡性胸膜間皮瘤患者中細(xì)胞塊病理只有1例陽(yáng)性，1例診為腺癌與胸膜病理診斷不一致，3例為陰性，顯示了細(xì)胞塊病理在診斷胸膜間皮瘤方面的局限性，證實(shí)胸膜病理仍是診斷胸膜間皮瘤的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。

惡性胸腔積液常為血性的，本文中血性積液占47.22%，深血色的占27.78%。細(xì)胞塊切片中過(guò)多的紅細(xì)胞會(huì)掩蓋腫瘤細(xì)胞，給癌細(xì)胞查找造成一定的困難。多篇文獻(xiàn)報(bào)道在制作細(xì)胞涂片時(shí)去除紅細(xì)胞能夠顯著提高陽(yáng)性檢出率[1-2]。趙俊軍等[9]使用50%酒精作為去血?jiǎng)┨幚砩钛e液再制成細(xì)胞塊，使異常的腫瘤細(xì)胞聚集、更易于被發(fā)現(xiàn)，而且細(xì)胞塊中沒(méi)有血性成分的干擾使異常細(xì)胞顯示的比傳統(tǒng)細(xì)胞涂片更清楚。深血色積液使用了2次去血?jiǎng)衅幸蚣?xì)胞退變而無(wú)法診斷的數(shù)量無(wú)明顯增加，但部分切片仍有紅細(xì)胞殘留。但殘留的紅細(xì)胞背景對(duì)診斷結(jié)果無(wú)顯著干擾，深血色細(xì)胞塊病理檢出率為60%，與胸膜病理和非血性細(xì)胞塊病理的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

醫(yī)學(xué)的發(fā)展使臨床對(duì)腫瘤病理的要求不再局限于組織類(lèi)型的診斷，分子生物學(xué)信息為精準(zhǔn)治療提供了有效的靶點(diǎn)。細(xì)胞塊不但可以用于免疫組織化學(xué)染色，也可以用于原位雜交(FISH)、細(xì)胞芯片等分子信息的檢測(cè)[10-11]。文獻(xiàn)報(bào)道紅細(xì)胞及血漿蛋白在免疫組化染色時(shí)極易非特異著色，不利于陽(yáng)性結(jié)果的觀察[2]。本文觀察了去血細(xì)胞塊與配對(duì)的胸膜病理免疫組化染色結(jié)果的一致性，顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示去血?jiǎng)┎粫?huì)改變腫瘤細(xì)胞表面抗原的性質(zhì)，也避免了紅細(xì)胞對(duì)診斷結(jié)果的干擾。

總之，紅細(xì)胞背景顯著干擾診斷陽(yáng)性結(jié)果的檢出，去血?jiǎng)┠軌蛉コ糠旨t細(xì)胞，保留切片中非紅細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，滿足病理診斷需要。去血?jiǎng)┎粫?huì)干擾細(xì)胞表面抗原表達(dá)，改變免疫組化染色結(jié)果。因此，細(xì)胞塊病理作為一種創(chuàng)傷比內(nèi)科胸腔鏡、胸膜活檢更小的檢查方法，能夠成為胸膜病理的補(bǔ)充。

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Clinical diagnostic value of cell block post RBC removal in malignant pleural effusion

XU Jian1，HAN Xue1，LIU Chunfang1,ZHAO Junjun2,LI Ping2，REN Lina1，JIANG Ling1,WANG Nini1

(1.DepartmentofRespiratory,DalianMunicipalCentralHospitalAffiliatedDalianMedicalUniversity,Dalian116033,China; 2.DepartmentofPathology,DalianMunicipalCentralHospitalAffiliatedDalianMedicalUniversity,Dalian116033,China)

Objective To investigate the diagnostic value of cell block through comparison with paired pleural biopsy. Methods Pleural effusions were collected from patients with suspected malignancy in Dalian Municipal Central Hospital from 2015 Jan to 2016 June. Cell blocks were prepared and red blood cells (RBCs) were removed using 50% ethyl alcohol if the effusion was bloody. Thoracoscopy was then performed to obtain pleural biopsy. The detection rate and the quality of pathological slices and immunohistochemical stains were compared between cell block and pleural biopsy. Results Malignant pleural effusions were finally collected from 36 patients, including 47.22% bloody effusion and 27.78% dark bloody effusion. The detection rates were 64.71%, 78.95% and 88.89%, respectively in bloody cell block post RBC removal, non-bloody cell block and pleural biopsy. There weren't statistical differences among groups. The detective rates reached 94.74%, 100% and 100%, respectively in the cell block post RBC removal, non-bloody cell block and pleural biopsy if the cell block came with pleural biopsy. The slices that couldn' t be use for diagnosis were 10.53%，9.52% and 20.00%, respectively in non-bloody, light bloody and dark bloody group. There weren't statistical differences among groups. The slices that couldn' t be use for diagnosis due to too much erythrocyte in background were 0, 0 and 7.84%, respectively in the above-mentioned group. There were statistical significant in dark bloody group compared with the other two groups. Thus, too many RBCs in background would disturb diagnosis. The immunohistochemical stains were consistent in the cell block post RBC removal compared to the paired pleural biopsy. Conclusion Pathological diagnosis using cell block has smaller wound and is a supplemental to pleural biopsy.

pleural effusion; pleural diseases; malignant pleural effusion; cell block; pleural pathology

徐 健(1967-)，女，主任醫(yī)師，教授。E-mail：karlinee@163.com

10.11724/jdmu.2017.03.10

R561.3；R734.2

A

1671-7295(2017)03-0252-05

徐健，韓雪，劉春芳，等.惡性胸腔積液去血細(xì)胞塊臨床應(yīng)用價(jià)值研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(3)：252-256.

2016-12-30；

2017-05-17)