孟赫禹,崔 蘭

(1.延邊大學醫(yī)學院 2013年級臨床醫(yī)學專業(yè)，吉林 延吉133000；2.延邊大學附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科)

*通訊作者

外周血CHD9基因低表達預示急性心肌梗死的風險增加

孟赫禹1,崔 蘭2*

(1.延邊大學醫(yī)學院 2013年級臨床醫(yī)學專業(yè)，吉林 延吉133000；2.延邊大學附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAD)是由環(huán)境因素與遺傳因素共同作用而導致的最常見心血管疾病。已知的危險因素，如高血壓、血脂異常、血糖升高、吸煙等長期積累，結(jié)合遺傳背景最終將導致急性心血管事件(如，急性心肌梗死，AMI)的發(fā)生，常常危及患者生命。因此，臨床上需要有效的風險預測方法，對高危人群給予有效識別，從而更早的干預，來降低急性心血管事件的發(fā)生，改善病人預后。

基因組中編碼的遺傳信息是穩(wěn)定的，大多數(shù)情況下是不可變的。然而研究表明，大約有25000個基因在RNA水平的表達是高度可變的，可以反應機體短期內(nèi)的生理和病例變化。外周全血或外周血單個核細胞基因表達的改變已被證實對CAD有顯著的預測價值[1]?；虮磉_分析可以為疾病近期風險預測提供新的生物標志物[2]。

本課題組前期進行的外周血急性心肌梗死差異基因表達譜分析結(jié)果顯示：在急性心肌梗死病人的外周血白細胞中存在著大量差異表達的基因[3]。其中，CHD9基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達。本研究將在前期研究成果的基礎之上，通過擴大樣本量，來進一步驗證CHD9基因在急性心肌梗死發(fā)病過程中的差異表達，并分析CHD9基因促進急性心肌梗死發(fā)病的可能機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

依據(jù)2012年公布的心肌梗死全球統(tǒng)一定義[4]。選取2014年11月-2016年3月于我院心血管內(nèi)科住院治療，明確診斷為急性心肌梗死的病人113例為急性心肌梗死組。非冠狀動脈粥樣硬化性心臟病者114例為對照組。并根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果，按照Gensini評分系統(tǒng)對研究對象的冠狀動脈血管病變嚴重程度進行評分，分值越高病變越嚴重[5]。

本研究排除標準：①因經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈旁路移植術(CABG)引發(fā)的心肌梗死。②繼發(fā)于供需失衡相關的心肌損傷：如冠脈內(nèi)皮功能障礙無明顯冠脈疾病、冠脈痙攣、冠脈栓塞、快速/緩慢型心律失常、嚴重貧血、重癥呼吸衰竭、主動脈夾層或嚴重主動脈瓣疾病、肥厚型心肌病等。③非心肌缺血相關的心肌損傷：心臟挫傷、手術、消融、起搏、或除顫儀除顫、伴心臟受累的橫紋肌溶解癥、心肌炎、心臟毒性藥物等。④多因素或不確定的心肌損傷：嚴重心力衰竭、應激性心肌病、嚴重肺栓塞或肺動脈高壓、敗血癥和危重病人、腎功能衰竭、嚴重的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血等。⑤合并有嚴重感染性疾病、惡性腫瘤。⑥正在患有的、慢性的或復發(fā)性的傳染性疾病史。⑦(活動性或潛伏性)結(jié)核感染史或證據(jù)。⑧患有免疫系統(tǒng)疾病和(或)正在服用激素。懷疑或證實處于免疫缺陷狀態(tài)的患者。⑨臨床資料或者冠脈造影資料不全者。

詳細記錄臨床資料，包括：用藥史、血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、冠狀動脈造影資料、冠心病家族史、吸煙史，以及合并其它臨床疾病情況(如高血壓、糖尿病)等。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集、總RNA提取及cDNA合成

留取各研究對象晨起空腹外周靜脈血4 ml，利用血液總RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit,天根生化科技有限公司，北京)，依據(jù)試劑盒說明書對已獲取的外周血進行總RNA提取，并利用1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(Nanodrop 2000)對RNA的質(zhì)量及濃度進行檢測。合格的RNA樣本A260/A280值在1.9和2.1之間，且A260/A230值大于2。瓊脂糖凝膠電泳可見明亮的28S和18S rRNA條帶，且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA的兩倍。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO Rever Tra Ace qPRC RT kit，上海)，取總量為1 μg合格的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA樣品保存于-20℃以便下一步進行實時熒光定量PCR。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測 利用SYBR熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM ，TaKaRa,大連)進行PCR擴增。采用20 μl反應體系，每個反應包括:10 μl SYBR Premix Ex Taq TM，上、下游引物各0.5 μl(濃度為10 μmol/L)，無核酸酶的雙蒸水8 μl，cDNA模板1 μl。應用Mx3005P實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Strata Gene)擴增。反應條件為95℃10 min；40個循環(huán)：95℃ 15 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s；95℃ 1 min，55℃ 30s,95℃ 30 s。以GAPDH基因為內(nèi)參基因，所有樣本至少重復測量3次，結(jié)果取均值。每個樣本所得循環(huán)閾值(Ct)以相對表達量2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)，并進行比較。急性心肌梗死組對于對照組的相對表達量以2-△△Ct法進行統(tǒng)計分析[6]，△△Ct=急性心肌跟死組△Ct-對照組△Ct。所用PCR引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的CHD9基因序列進行設計，并由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1，擴增片段長度為153 bp。收集實時熒光定量PCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析

研究對象的臨床資料分析結(jié)果表明：在年齡、性別、BMI、高血壓病史、冠心病家族史、收縮壓、舒張壓及高密度脂蛋白膽固醇水平(HDL-C)等方面，兩組未見明顯統(tǒng)計學差異。而與對照組相比，急性心肌梗死組吸煙史比例更高；合并糖尿病情況及空腹血糖水平明顯高于對照組；血總膽固醇水平(TC)、甘油三酯水平(TG)和低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)明顯高于對照組。差別均有統(tǒng)計學意義,見表1。

2.2 實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物鑒定

外周血RNA實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：CHD9基因擴增曲線為顯著平滑的“S型”。溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，擴增產(chǎn)物特異性較高。取10 μl擴增產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一明亮條帶，片段大小約153 bp，與預期片段大小一致。PCR擴增反應成功，產(chǎn)物特異性較好。

表1 急性心肌梗死組與對照組臨床資料比較

1：DL500 DNA ladder marker；2、3：RT-PCR products.圖1 CHD9基因RT-PCR擴增目的片段電泳圖

2.3 CHD9基因mRNA在急性心肌梗死組和對照組的表達量

RT-PCR所得每個樣本的ΔCt值均為單個樣本重復3次測量所得均值。CHD9基因的相對表達量統(tǒng)計采用2-ΔΔCt方法。結(jié)果顯示，急性心肌梗死組2-△Ct為0.03(0.02-0.05)，對照組2-△Ct為0.06(0.04-0.13)，兩組差別有顯著統(tǒng)計學差異(Z=-7.09，P=0.00)。在RNA水平急性心肌梗死組外周血中CHD9基因表達明顯低于對照組，其相對表達量為對照組的0.35±0.29倍，見圖2。

圖2 CHD9基因mRNA相對表達量 **P<0.01

2.4 采用Logistic回歸分析CHD9基因相對表達量及其他因素與急性心肌梗死的關系

按CHD9基因的相對表達量中位數(shù)將所有研究對象分為高表達組(2-△Ct>0.044)和低表達組(2-△Ct≤0.044)，進一步采用逐步二元Logistic回歸分析CHD9基因的相對表達量、年齡、性別、BMI、冠心病家族史、吸煙史、高血壓、糖尿病、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇等因素與急性心肌梗死的相關性。結(jié)果顯示：CHD9基因的低表達和吸煙、空腹血糖增高、血低密度脂蛋白膽固醇水平升高均是急性心肌梗死的獨立危險因素，CHD9基因低表達使急性心肌梗死的風險增高4倍，見表2。

表2 急性心肌梗死獨立危險因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 CHD9基因相對表達量與空腹血糖及血脂等指標的關系

將所有納入的研究對象分別按空腹血糖水平和血脂水平分為：血糖正常組和血糖升高組、TC正常組和TC升高組、TG正常組和TG升高組、LDL-C正常組和LDL-C升高組。分別比較組間CHD9基因的表達量。每個研究對象CHD9基因的相對表達量以2-△Ct表示。結(jié)果顯示：CHD9基因表達量在血糖正常組與血糖升高組之間差別有統(tǒng)計學意義(Z=-2.62，P=0.01)；CHD9基因表達量在TC正常組與TC升高組之間差別無統(tǒng)計學意義；CHD9基因表達量在TG正常組與TG升高組之間差別無統(tǒng)計學意義；CHD9基因表達量在LDL-C正常組與LDL-C升高組之間差別無統(tǒng)計學意，見表3。

表3 不同組別間CHD9基因相對表達量比較

a : 血糖正常組和血糖升高組比；b: TC正常組和TC升高組比；c：TG正常組和TG升高組比；d：LDL-C正常組和LDL-C升高組比

2.6 CHD9基因相對表達量與冠狀動脈病變嚴重程度的相關性

根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果，按照Gensini評分系統(tǒng)對急性心肌梗死組冠狀動脈病變嚴重程度進行評分。分值越高代表冠狀動脈狹窄越重。急性心肌梗死組Gensini評分結(jié)果為60.00(36.00-88.00)，對CHD9基因和Gensini分值進行雙變量相關分析，結(jié)果顯示：CHD9基因的相對表達量與Gensini分值呈顯著負相關(rs=-0.54，P=0.00)，即CHD9基因的相對表達量越低，Gensini分值越高，冠狀動脈狹窄則越重。

2.7 CHD9基因的相對表達量與心肌肌鈣蛋白I(TnI)的相關性

急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測結(jié)果為0.47(0.11-9.60)ng/ml。血清肌鈣蛋白I(TnI)濃度的高低反應了急性心肌梗死的范圍的大小。血清TnI和CHD9基因相對表達量的雙變量相關分析結(jié)果顯示：rs=-0.09(P=0.43)。外周血中CHD9基因表達量的高低與血清TnI濃度無關。這表明CHD9的低表達與心肌梗死的范圍無關。

2.8 CHD9基因相對表達量在急性心肌梗死中的ROC曲線和cut off值

根據(jù)急性心肌梗死組和對照組各樣本實時熒光定量PCR所得CHD9相對表達量2-△CT值繪制ROC曲線，見圖3。從圖3可知CHD9基因的相對表達量對急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價值，曲線下面積(AUC)為0.77±0.03(P=0.00)，以約登指數(shù)最大值確定的CHD9基因相對表達量cut off值為0.032，敏感度為55.8%，特異性為87.7%。

圖3 CHD9基因相對表達量的ROC曲線

3 討論

染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白(CHD)家族為屬于SNF2超家族ATP依賴的染色質(zhì)重塑酶。遺傳學和生物化學研究表明CHD家族是重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與著染色質(zhì)的重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復等細胞過程[7,8]。多種CHD家族成員已被發(fā)現(xiàn)其基因的突變或表達異常與人類的某些疾病相關，特別是在腫瘤研究領域[9-12]。但在心血管領域?qū)τ贑HD家族的研究較少。CHD9是由Shur I等首次發(fā)現(xiàn)的[13]，其屬于CHD家族的第三個亞族。因其發(fā)現(xiàn)較晚，對于CHD9基因與疾病的關系目前研究較少。本課題組前期的急性心肌梗死外周血差異基因表達分析發(fā)現(xiàn)，CHD9基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達[3]。本研究在前期工作基礎之上，進一步擴大樣本量驗證了外周血中CHD9基因在急性心肌梗死發(fā)病過程中表達量顯著降低。

本研究的臨床資料進行分析表明：急性心肌梗死組，吸煙者比例更高；合并糖尿病情況及空腹血糖水平明顯高于對照組；血總膽固醇水平(TC)、甘油三酯水平(TG)和低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)也明顯高于對照組，這與我們的臨床實踐相一致。Logistic回歸分析亦顯示：CHD9基因的低表達與吸煙、空腹血糖增高以及血低密度脂蛋白膽固醇水平升高一樣均是急性心肌梗死的獨立危險因素，CHD9基因低表達組急性心肌梗死的風險為高表達組的5倍。

本研究中，按正常及異常的TC、TG、LDL-C和空腹血糖水平將所有研究對象分組比較組間CHD9基因表達的差異，結(jié)果顯示：空腹血糖升高組CHD9基因的相對表達量明顯低于空腹血糖正常組。血糖的升高與CHD9基因的低表達相關，因此在急性心肌梗死發(fā)病過程中CHD9基因可能是通過影響糖代謝而影響到急性心肌梗死的發(fā)生。但在TC正常組與TC升高組之間、TG正常組與TG升高組之間、LDL-C正常組與LDL-C升高組之間，CHD9基因的表達量無明顯差異。

Gensini評分反應了冠狀動脈病變狹窄的嚴重程度，Gensini分值越高代表冠狀動脈粥樣硬化程度越重，病變狹窄越嚴重。CHD9基因相對表達量與Gensini評分的相關性分析表明：CHD9基因表達量與Gensini評分結(jié)果呈顯著負相關，即CHD9基因的表達量越低，冠狀動脈粥樣硬化程度越重。

然而，本研究中，并未觀察到CHD9基因的mRNA表達量與血清TnI的水平具有相關性。心肌肌鈣蛋白是目前公認的能夠高特異性、高敏感性的反映心肌細胞損傷壞死的標記物。血液中肌鈣蛋白濃度越高表明心肌因缺血缺氧導致的心肌壞死范圍越大[14]。CHD9基因的mRNA表達量與心肌梗死的程度沒有相關性。

綜合以上研究結(jié)果，我們可以合理地推測：CHD9基因低表達通過影響糖代謝，促進冠狀動脈粥樣硬化，從而促進了急性心肌梗死的發(fā)生。

本研究不足：通路分析顯示，CHD9基因廣泛參與著膽固醇的合成調(diào)節(jié)，甘油三酯、脂肪酸和酮體的代謝(from REACTOME)。但在我們的研究中CHD9基因的表達量在不同血脂水平間未顯示出差異。而外周血中CHD9基因的表達量與血糖水平卻有相關性。在后續(xù)研究中，我們將進一步對CHD9基因的生物學功能進行驗證。

ROC曲線結(jié)果表明CHD9基因相對表達量對于急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價值。CHD9基因的相對表達量用于急性心肌梗死診斷的特異性較高但是敏感度不高。以該基因的低表達單一因素作為急性心肌梗死診斷的指標尚不夠敏感，但其可以作為急性心肌梗死鑒別診斷的重要參考指標。急性心肌梗死是由多因素聯(lián)合作用導致的多基因遺傳病，參與該病形成的基因眾多且相互影響較為復雜，隨著更多風險基因的發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合多個風險基因的檢測結(jié)果將提高對心肌梗死診斷的敏感度。

CHD9基因在急性心肌梗死病人外周血中表達顯著降低；CHD9基因表達量降低是急性心肌梗死的獨立危險因素；CHD9基因低表達使急性心肌梗死的風險增加4倍。外周血中CHD9基因的低表達反映了冠狀動脈病變的嚴重程度；CHD9基因可能是通過影響血糖代謝，促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，最終導致AMI的發(fā)生。

致謝：感謝吉林大學畜牧獸醫(yī)學院趙志輝教授及其團隊對本研究提供的技術指導。

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1007-4287(2017)06-1009-06

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