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        高效毛細(xì)管電泳—二極管陣列檢測法測定微生物代謝產(chǎn)物中的植物激素含量

        2017-06-30 10:11:27馬曉穎楊鎮(zhèn)宋艷雨祝永剛楊濤
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年8期
        關(guān)鍵詞:植物激素

        馬曉穎+楊鎮(zhèn)++宋艷雨++祝永剛+楊濤

        摘要:建立同時分離測定微生物代謝產(chǎn)物中吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫離酸的毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測器新方法。研究檢測波長、緩沖體系、緩沖體系的pH值及濃度、分離電壓、進(jìn)樣時間等因素。結(jié)果表明,在運(yùn)行緩沖液75 mmol/L硼砂緩沖液(pH值為9.0)、75 mmol/L硼酸緩沖液、檢測波長218 nm、分離電壓20 kV、溫度 25 ℃的條件下,吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫離酸在0.1~5.0 mg/mL內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。測得微生物代謝產(chǎn)物中含有細(xì)胞分裂素和脫離酸,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得回歸方程測得含量為60.93、22.62 μg/mL。細(xì)胞分裂素和脫落酸遷移時間的相對偏差RSD分別為0.13%、0.126%;遷移峰面積RSD(%)分別為1.01%、1.92%,回收率分別為 90.1%~948%、95.8%~96.2%。因此,該方法適用于微生物代謝產(chǎn)物中植物激素的測定。

        關(guān)鍵詞:高效毛細(xì)管電泳;二極管陣列檢測;植物激素;微生物代謝產(chǎn)物

        中圖分類號: S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2017)08-0169-03

        為了實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)部在扎實(shí)推進(jìn)的“到2020年化肥使用量零增長行動”和“到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動”,重點(diǎn)研發(fā)高效緩釋肥料、高效低毒低殘留農(nóng)藥、生物肥料農(nóng)藥等新型產(chǎn)品是十分必要的,而植物激素是被公認(rèn)的用量少、效果好的植物生長調(diào)節(jié)劑。微生物天然代謝產(chǎn)物擁有來源安全、對土地環(huán)境友好等特點(diǎn),在未來具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

        傳統(tǒng)的生物鑒定法對植物激素的測定難以滿足準(zhǔn)確定量分析的要求,文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法等雖可獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果,但存在操作繁瑣、靈敏度差、費(fèi)用較高的缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳技術(shù)(HPCE)源自傳統(tǒng)電泳技術(shù),具有微量、準(zhǔn)確、成本低、污染少、分析時間快、自動化程度高的優(yōu)點(diǎn)[1]。二極管陣列檢測器可以同時檢測在190~300 nm波長下樣品的出峰情況,并帶有3D效果的檢測峰形,可以更加直觀地判斷樣品的真實(shí)情況,判斷出是否為非正常樣品的出峰情況。本研究以微生物代謝產(chǎn)物為測定目標(biāo),利用高效毛細(xì)管-二極管陣列同時測定其中的4種植物激素,并建立了高效快速的植物激素含量測定方法。該方法簡單可靠、重復(fù)性好,不僅可用于微生物代謝產(chǎn)物中植物激素含量的測定,對其他樣品中的植物激素的定性、定量檢測都有一定的參考價值。

        1材料與方法

        1.1儀器與試劑

        儀器:P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀 (美國貝克曼公司);未涂層石英毛細(xì)管 (75 μm×57 cm,有效檢測長度48 cm)(美國貝克曼公司);精密pH計(jì)(北京泰亞賽福科技發(fā)展有限責(zé)任公司);高速臺式冷凍型離心機(jī)(德國Sigma公司);超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司];HZQ-QX 全溫振蕩器(黑龍江省哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);干熱消毒箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DOA-P504-BN 真空泵(IDEX公司);ETS-D5 磁力攪拌器、A11 高速粉碎機(jī)(德國IKA集團(tuán))。CascadaTM實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(Pall corporation)。

        試劑:微生物菌種來源于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心;吲哚乙酸(IAA)標(biāo)樣,赤霉素(GA),細(xì)胞分裂素(6BA),脫落酸(ABA)(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);試驗(yàn)過程用的試劑均為分析純和色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

        1.2試驗(yàn)方法

        新毛細(xì)管用甲醇沖洗3 min,1 mol/L的HCl沖洗2 min,0.1 mol/LNaOH沖洗1 min,去離子水沖洗0.5 min?;罨玫拿?xì)管使用前用0.1 mol/L的NaOH、水、電泳緩沖液分別沖洗1、2、3min;每次進(jìn)樣之間,用緩沖液沖洗2 min,沖洗壓力為20 psi。所有溶液在進(jìn)入毛細(xì)管前,均用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾。

        樣品處理:將發(fā)酵后的微生物用雙層紗布過濾,用蒸餾水沖洗3次后60 ℃下烘干,稱質(zhì)量。然后采用高速粉碎機(jī)粉碎,用10倍體積乙醇浸提24 h,用磁力攪拌器將其混勻,超聲波振蕩1 h,真空抽濾,用以上方法再提取2次,收集3次濾液備用。將處理好的微生物代謝產(chǎn)物1 mg/mL用0.22 μm孔徑的有機(jī)濾膜過濾,收集續(xù)濾液加同體積的運(yùn)行緩沖液作為樣品溶液。

        對照品的配制:將吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸分別配成1 mg/mL的母液,用甲醇溶解。上述溶液均用 0.22 μm 孔徑的有機(jī)濾膜過濾,超聲除氣,置于冰箱4 ℃保存。

        1.3電泳條件

        未涂層石英毛細(xì)管(75 μm×57 cm,有效檢測長度 48 cm);運(yùn)行緩沖液為75 mmol/L硼砂緩沖液(pH值為90);75 mmol/L硼酸緩沖液;檢測波長218 nm;分離電壓 20 kV;溫度 25 ℃;壓力0.5 psi進(jìn)樣10 s,樣品運(yùn)行時間為 20 min,4種植物激素運(yùn)行時間為15 min。

        2結(jié)果與分析

        2.1高效毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測法條件的優(yōu)化

        選用pH值為9.0的75 mmol/L硼砂沖液、75 mmol/L硼酸緩沖液作為運(yùn)行緩沖及分離緩沖。壓力0.5 psi進(jìn)樣10 s,并在此條件下進(jìn)行波長優(yōu)化及電壓優(yōu)化。為選取適當(dāng)?shù)臋z測波長,采用PDA檢測器對4種激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長為 190~300 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)4種植物激素具有不同的最適分離波長,但在218 nm處能夠達(dá)到同時出峰且分離效果較好,故選取此波長作為檢測波長。

        在確定進(jìn)樣時間方面,進(jìn)行5、10、20 s進(jìn)樣時間的測定,結(jié)果表明,進(jìn)樣5 s峰形不完整,20 s濃度太高,連峰情況增多,故選用10 s為樣品的進(jìn)樣時間。

        在優(yōu)化分離電壓時,比較分析15、20、30 kV 3個不同電壓下4種植物激素遷移與分離情況。發(fā)現(xiàn)在15 kV時,基線不好;30 kV時出峰延遲,峰形拖尾,故最終選擇20 kV作為電泳測定的運(yùn)行電壓。

        試驗(yàn)常用磷酸鹽、硼砂等緩沖體系對4種植物激素的分離進(jìn)行考察,以選取合適的緩沖體系。通過磷酸鹽緩沖液不同的pH值,確定分離樣品的最適分離pH值,通過試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn),用pH值為9.0的磷鹽溶液分離時,樣品的分離效果較好,故選擇堿性緩沖液硼砂溶液進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。

        選擇10、20、50、75 mmol/mL硼砂緩沖液對4種植物激素進(jìn)行分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)硼砂緩沖液濃度達(dá)到75 mmol/mL時,樣品和對照品的分離效果最佳,分離度和峰形都達(dá)到了相對最好的情況,故選擇75 mmol/mL及pH值為9.0的硼砂,75 mmol/L硼酸緩沖液緩沖體系作為最終運(yùn)行緩沖液。

        2.2高效毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測法對微生物代謝產(chǎn)物中4種激素的測定

        2.2.1定性測定根據(jù)圖1、圖2可知,微生物代謝產(chǎn)物指紋圖譜中含有與細(xì)胞分裂素(6-BA)和脫落酸(ABA)保留時間相同的物質(zhì),與赤霉素(GA)和吲哚乙酸(IAA)的圖譜沒有重合峰,說明微生物代謝產(chǎn)物中含有細(xì)胞分裂素和脫落酸,不含有吲哚乙酸和赤霉素。

        2.2.2定量測定根據(jù)定性試驗(yàn)的結(jié)果,對細(xì)胞分裂素和脫落酸在微生物代謝產(chǎn)物中的含量進(jìn)行定量計(jì)算。

        2.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸分別配成10 mg/mL的母液,用甲醇溶解。根據(jù)毛細(xì)管電泳中的定量計(jì)算方法,將植物激素標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為01、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL,分別進(jìn)行進(jìn)樣,見圖3(由于5.0 mg/mL濃度進(jìn)樣時第2、3個峰濃度較大出現(xiàn)連峰,因此圖譜未放到圖中)。

        根據(jù)毛細(xì)管電泳中的定量計(jì)算方法,將植物激素標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為0.1、1.0、2.0、5.0 mg/mL,分別進(jìn)行進(jìn)樣,以濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(圖 4、圖5)。

        毛細(xì)管電泳儀最佳條件下,細(xì)胞分裂素電泳峰面積與濃度在0.1~5.0 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=715 236.440 4x-22 680,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 23,最低檢測限(LOD)為0.14 μg/mL。脫落酸回歸方程為y=391 391.409 4x+21 489,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 02,最低檢測限(LOD)為0.28 μg/mL。將目的峰的峰面積帶入方程,得細(xì)胞分裂素的含量為60.93 μg/mL,脫落酸含量為 22.62 μg/mL。

        2.2.2.2重復(fù)性和精密性試驗(yàn)取同一濃度的細(xì)胞分裂素標(biāo)準(zhǔn)樣品和脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣5次。測細(xì)胞分裂素遷移時間的相對偏差RSD為0.13%,遷移峰面積RSD為1.01%。脫落酸遷移時間的相對偏差RSD為0.126%,遷移峰面積RSD為1.92%。準(zhǔn)確度驗(yàn)證采用回收率法進(jìn)行試驗(yàn)。量取3份樣品,分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,實(shí)測添加量與標(biāo)準(zhǔn)添加量之比為回收率。通過試驗(yàn),測得細(xì)胞分裂素的回收率在90.1%~94.8%(表1),脫落酸的回收率為95.8%~96.2%。

        3討論

        測定植物激素前該微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行過玉米種子的催芽,稀釋10 000倍的效果顯著,而500倍的提取物對玉米生長起到了抑制作用,這與植物激素的作用相一致,利用高效毛細(xì)管電泳對其中的植物激素進(jìn)行測定,測得其含有細(xì)胞分裂素和脫落酸。但細(xì)胞分裂素和脫落酸在植物體內(nèi)的作用機(jī)理尚不明確,產(chǎn)生的植物促生長是聯(lián)合作用還是有某一單獨(dú)成分起作用還有待深入研究。

        傳統(tǒng)的生物鑒定法對植物激素的測定難以滿足準(zhǔn)確定量分析的要求,文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法等雖可獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果,但存在操作繁瑣、靈敏度差、費(fèi)用較高的缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳技術(shù)(HPCE)源自傳統(tǒng)電泳技術(shù),具有微量、準(zhǔn)確、成本低、污染少、分析時間快、自動化程度高的優(yōu)點(diǎn)。本研究以人參內(nèi)生真菌菌絲為測定目標(biāo),利用高效毛細(xì)管法來測定其中的植物激素,通過不同種、不同pH值緩沖液、不同分離電壓及不同進(jìn)樣時間等條件優(yōu)化后,確定了本試驗(yàn)的電泳條件,在建立分離效果較好的真菌代謝產(chǎn)物的指紋圖譜的同時,也將各種激素的出峰時間控制在15 min以內(nèi),節(jié)省了工作時間和成本,可以實(shí)現(xiàn)替代高效液相法測定植物激素,避免有機(jī)溶劑對人和環(huán)境的傷害,為植物激素的測定方法提供了一定的參考價值。

        參考文獻(xiàn):

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