張佳峰+吳娥嬌+羅桂火++祝雯++詹家綏

摘要：致病疫霉（Phytophthora infestans）是馬鈴薯晚疫病的病原菌，對(duì)世界馬鈴薯的生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。ATP6編碼ATP合酶α亞基的第6個(gè)亞單位，對(duì)ATP合酶的功能及生物的生存生殖至關(guān)重要。本研究對(duì)來自我國(guó)7個(gè)群體140株馬鈴薯晚疫病菌的ATP6基因進(jìn)行核苷酸序列及其遺傳結(jié)構(gòu)和地理因素（海拔、經(jīng)度和年平均氣溫）的相關(guān)分析。結(jié)果表明：7個(gè)群體中只有2種單倍型Hapl-1和Hapl-2，其中Hapl-1在群體中所占比例與當(dāng)?shù)氐暮０纬曙@著正相關(guān)，與年平均氣溫和經(jīng)度呈顯著負(fù)相關(guān)，而Hapl-2在群體中的比例與當(dāng)?shù)氐暮０?、年平均氣溫和?jīng)度的相關(guān)正好與Hapl-1相反。群體間的遺傳分化度（FST）與群體間直線距離呈顯著正相關(guān)（r=0.659，P=0.001）。本研究表明，馬鈴薯致病疫霉ATP6基因單倍型分布和群體地理因素之間具有顯著相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果為了解致病疫霉的進(jìn)化趨勢(shì)和致病疫霉的防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯晚疫病菌；ATP6基因；單倍型多樣性；地理因素；核苷酸序列

中圖分類號(hào)： S435.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0075-04

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans de Bary）引起的毀滅性病害，可侵染馬鈴薯和番茄等茄科植物[1-2]，每年造成直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)百億美元[3-4]。21世紀(jì)以來，隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴(kuò)大，我國(guó)馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量已居世界第一，馬鈴薯已經(jīng)成為全球性食物，是水稻、小麥和玉米之后的全球第四大糧食作物[5-6]。

線粒體基因組的突變率低，單親遺傳，常被用于研究生物的進(jìn)化模式[7-10]。目前為止，已有超過150個(gè)植物、動(dòng)物、真菌、原生生物的線粒體基因組被測(cè)序[11]。因此，通過了解線粒體基因遺傳多樣性有助于了解致病疫霉群體結(jié)構(gòu)和變異特點(diǎn)，進(jìn)而探究不同地理區(qū)域下的群體遺傳結(jié)構(gòu)。

馬鈴薯生產(chǎn)具有較強(qiáng)的地域性，在全國(guó)不同地區(qū)形成各具特色的栽培方式和栽培類型，從生產(chǎn)上來看，中國(guó)馬鈴薯的生產(chǎn)栽培區(qū)域?yàn)?個(gè)，分別是北方一季作區(qū)、中原二季作區(qū)、南方冬作區(qū)、西南混作區(qū)[12]，各地理區(qū)域氣候特征差異較大。胡珍珠等對(duì)我國(guó)北方馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)致病疫霉群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，我國(guó)北方馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)致病疫霉群體存在較為豐富的遺傳多樣性，且其遺傳多樣性與地理來源密切相關(guān)[13]；云南馬鈴薯晚疫病群體遺傳多樣性在地理分布上也存在差異顯著[14]；氣候變暖對(duì)馬鈴薯晚疫病發(fā)生發(fā)展的影響研究表明馬鈴薯晚疫病的發(fā)生發(fā)展與流行的適應(yīng)氣象條件，單因子作用并不顯著[15]；短暫的溫度起伏也會(huì)導(dǎo)致個(gè)體產(chǎn)生不同的表型[16]；同時(shí)，隨著地區(qū)年均溫的改變加劇會(huì)導(dǎo)致更多的遺傳變異[17-18]；經(jīng)緯度、海拔、年平均氣溫、降水量以及紫外強(qiáng)度對(duì)當(dāng)?shù)伛R鈴薯晚疫病菌的發(fā)生造成很大的影響[19-21]。本研究對(duì)我國(guó)7個(gè)不同地理環(huán)境的致病疫霉菌群體的ATP6基因進(jìn)行遺傳多樣性分析，以探究致病疫霉遺傳多樣性的空間分布以及遺傳結(jié)構(gòu)與地理因素（海拔、經(jīng)度和年均溫）的相關(guān)性，以期為晚疫病的防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

根據(jù)SSR基因型的不同從源自我國(guó)云南曲靖（2010年）、廣西南寧（2010年）、貴州安順（2011年）、福建福州（2010年）、福建霞浦（2011年）、甘肅定西（2010年）和寧夏渭源（2010年）7個(gè)馬鈴薯栽培地區(qū)，共計(jì)815株致病疫霉菌中選取140株無性系，寄主均為馬鈴薯。

1.2方法

1.2.1樣本的采集與純化在發(fā)病區(qū)選1塊田地，病株間隔2 m以上，每個(gè)病株上選擇具有典型癥狀的單個(gè)病斑的病葉，在水瓊脂培養(yǎng)基上保濕培養(yǎng)12～24 h，用接菌針挑取單根菌絲，接種于含抗生素（利福平10 mg/L、氨芐青霉素100 mg/L）的選擇性黑麥培養(yǎng)基上[22]。

1.2.2培養(yǎng)基的制備黑麥培養(yǎng)基的配置：將50 g黑麥浸泡12 h，勻漿機(jī)粉碎，60 ℃水浴浸泡2 h，4層紗布過濾，定容至1 L并且加入12 g瓊脂糖加熱溶化，于121 ℃高壓滅菌 20 min。冷卻到60 ℃左右倒平板，接菌后在18 ℃避光培養(yǎng) 7～10 d。將純化的菌株接種到黑麥凍存管或者黑麥培養(yǎng)基斜面上，13 ℃避光長(zhǎng)期保存菌種[23]。

1.2.3致病疫霉DNA的提取和線粒體ATP6基因的擴(kuò)增收集在黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的致病疫霉菌絲，冷凍干燥并且粉碎后使用BIOMIGA試劑公司訂購(gòu)的Bio MIGA Plant g DNA Kit（GD2611-02 250 poeps）試劑盒提取DNA，將提取的基因組DNA保存于-40 ℃?zhèn)溆?。利用DNAMAN以及Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)并在上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成引物（F，5′-GAAGCTGCTGCATGGTATTGG-3′；R，5′-GCGACCTATAGCGTCACAAGC-3′），對(duì)致病疫霉7個(gè)群體的ATP6基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR采用Blend Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在Life Pro Themeral Cycler PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為25 μL，包括1 μL模板DNA、0.25 μL Taq DNA聚合酶、2.5 μL dNTP、2.5 μL 10×buffer，加無菌水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用G：BOX凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4測(cè)序和數(shù)據(jù)處理將瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果中條帶單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品送于上海鉑尚生物有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。將測(cè)序所獲得的序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，使用MEGA 5.05[24]軟件中的Muscle（Codons）子程序進(jìn)行多重比對(duì)。通過NCBI在線BLAST比對(duì)驗(yàn)證同源性，利用DnaSP 5.10.1[25]軟件分析致病疫霉遺傳多樣性參數(shù)來評(píng)估遺傳多樣性，包括單倍型數(shù)（number of haplotypes detected，H）、核苷酸多樣性（nucleoticide diversity，π）、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（number of segregeting site，S）等[26-27]。利用Arlequin v 3.4.1.3[28]軟件計(jì)算群體間FST，根據(jù)FST的值來判斷群體分化程度。采樣地點(diǎn)當(dāng)年的年平均氣溫、海拔以及經(jīng)度則通過World Climate（http：//www.world-climate.com）以及Google Earth（http：//www.earthol.com/）來查詢[29]，同時(shí)利用經(jīng)緯度距離計(jì)算器來計(jì)算采樣點(diǎn)之間的直線距離。

2結(jié)果與分析

全國(guó)7個(gè)群體中只出現(xiàn)2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（表1）。單倍型多樣性（Hd）在地區(qū)間存在差異，福州、霞浦、甘肅、寧夏、云南群體的單倍型多樣性（Hd）值均小于0.5，核苷酸多樣性（π）值均小于0.005，然而貴州、廣西群體的單倍型多樣性值大于0.5，但是核苷酸多樣性值仍然小于0.005。通過對(duì)7個(gè)群體的單倍型多樣性比較發(fā)現(xiàn)，貴州群體的單倍型多樣性平均值最高，為0.525，云南群體的單倍型多樣性平均值最低，為 0.111。貴州群體ATP6基因表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，云南群體ATP6基因表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性（表1）。

采樣地點(diǎn)地理因素因子（表4）以及不同地區(qū)單倍型分布比例（圖3）的相關(guān)性分析表明，Hapl-1比例與采樣地區(qū)海拔呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.951，P=0.001），Hapl-2比例和采樣地區(qū)海拔呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.951，P=0.001），說明隨著采樣地區(qū)海拔的升高，Hapl-1比例越高，Hapl-2比例越低；Hapl-1比例和采樣地區(qū)年平均氣溫呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.752，P=0.051），而Hapl-2比例和采樣地區(qū)年平均氣溫呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.752，P=0.051），說明Hapl-1比例隨著采樣地區(qū)年平均氣溫升高而降低，Hapl-2比例隨著年平均氣溫升高而升

高；Hapl-1比例與采樣地區(qū)經(jīng)度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.894，P=0.007），Hapl-2比例與采樣地區(qū)經(jīng)度呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0894，P=0.007），說明隨著采樣地區(qū)采樣地區(qū)經(jīng)度的升高，

3討論與結(jié)論

對(duì)我國(guó)7個(gè)不同群體采集篩選的共計(jì)140個(gè)致病疫霉ATP6基因進(jìn)行擴(kuò)增和核苷酸分析，同時(shí)進(jìn)行ATP6基因遺傳結(jié)構(gòu)和部分地理因素之間的相關(guān)性分析。結(jié)果表明，有2種單倍型Hapl-1和Hapl-2，其中Hapl-1與海拔呈正相關(guān)，與年平均氣溫和經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)，而Hapl-2與海拔呈負(fù)相關(guān)，與年平均氣溫和經(jīng)度呈正相關(guān)。群體間的FST與群體間水平距離成顯著相關(guān)關(guān)系。

有研究表明，地理環(huán)境因素是影響晚疫病流行的關(guān)鍵因素[30-32]，本研究結(jié)果也表明，ATP6基因單倍型比例與采樣地區(qū)海拔、經(jīng)度以及年平均氣溫具有相關(guān)性。同時(shí)ATP6基因與呼吸作用相關(guān)[33]，海拔、年均氣溫和經(jīng)度均可以影響生物的呼吸作用，本試驗(yàn)間接證明這些地理因素與晚疫病發(fā)生和致病疫霉群體分布具有相關(guān)性。

從生產(chǎn)上來看，中國(guó)馬鈴薯的生產(chǎn)栽培區(qū)域有各自特有的氣象因素和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，各生態(tài)區(qū)域氣候特征差異較大。地區(qū)間致病疫霉群體遺傳結(jié)構(gòu)各有不同。群體間FST和采樣點(diǎn)間垂直距離呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.659，P=0.001）。這一結(jié)果證實(shí)，進(jìn)化理論中提到的地區(qū)間隔是導(dǎo)致種群地區(qū)間遺傳分化的重要原因，地理位置越靠近分化程度越低[34-35]。

目前我國(guó)對(duì)致病疫霉遺傳分化的原因多處于對(duì)遺傳多樣性的了解，對(duì)地區(qū)間分化原因以及形成機(jī)制很少探討。本研究利用分子生物學(xué)和群體遺傳學(xué)原理，初步分析我國(guó)不同地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性及形成的可能機(jī)制，為馬鈴薯防治提供依據(jù)。但本研究選擇單個(gè)線粒體基因，在未來研究中，采取多個(gè)基因聯(lián)合方法來對(duì)此結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，為制定長(zhǎng)期、有效和環(huán)境友好型的致病疫霉防治方案提供科學(xué)依據(jù)。

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