陳 偉， 柏正武

(武漢工程大學(xué) 環(huán)境與化工清潔生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 湖北，武漢 430073)

纖維素型手性固定相制備及手性分離綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

陳 偉， 柏正武

(武漢工程大學(xué) 環(huán)境與化工清潔生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 湖北，武漢 430073)

以微晶纖維素為原料，合成了纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯)，再將其涂覆于氨丙基硅膠表面，制備成手性固定相。利用傅里葉變換紅外光譜儀、元素分析儀、掃描電鏡等方法對纖維素衍生物及固定相進(jìn)行了表征。將該固定相填充于空的色譜柱中，制備成手性色譜柱，用高效液相色譜檢測了所制備色譜柱對幾種手性樣品的對映體分離性能。本實(shí)驗(yàn)涉及有機(jī)合成和表征的相關(guān)知識(shí)，并結(jié)合手性藥物色譜分析等應(yīng)用性問題，綜合性較強(qiáng)，可作為大學(xué)本科綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。

綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)； 手性固定相； 對映體分離； 高效液相色譜

手性藥物對映體的拆分是分離、分析領(lǐng)域中的重要研究內(nèi)容之一[1-5]。以手性固定相(chiral stationary phase,CSP)為基礎(chǔ)的高效液相色譜法因其高效、快速等優(yōu)點(diǎn),已成為對映體分離和檢測的最佳方法[6-7]。多糖類CSP的制備和應(yīng)用是近年來色譜手性分離領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-11]。本文設(shè)計(jì)了以色譜固定相的制備、表征和性能測試為主的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)，用傅里葉變換紅外光譜、元素分析和掃描電鏡等方法對纖維素衍生物進(jìn)行表征,用高效液相色譜考察所制備固定相的手性分離性能。本綜合實(shí)驗(yàn)既包括了有機(jī)高分子的合成與表征、色譜固定相的制備,又涵蓋液相色譜柱的填充、柱效的測定和用液相色譜法進(jìn)行手性分離性能的評(píng)價(jià),有利于學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ奶岣吆蛣?chuàng)新能力的培養(yǎng),所以,本實(shí)驗(yàn)可適用于應(yīng)用化學(xué)和制藥工程專業(yè)的本科生綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑:微晶纖維素、1-萘異氰酸酯、甲苯、丙酮、正己烷、乙醇、甲醇、乙腈和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)均為分析純；吡啶為分析純,依次用KOH和CaH2回流干燥,重蒸；硅膠(7 μm,100 nm)購自日本Daiso公司；手性藥物及中間體的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 手性化合物的結(jié)構(gòu)

儀器:分析天平(萬分之一)；不銹鋼空色譜柱(250 mm×4.6 mm)；Nicolet IR 200型紅外光譜儀；Waters 高效液相色譜儀系統(tǒng)包括600E泵,717+自動(dòng)進(jìn)樣器,996二極管陣列檢測器,Empower I 色譜工作站；Alltech 1666型色譜柱填充泵；Hypersil(250 mm×4.6 mm)空色譜柱；VarioEL III CHNOS型元素分析儀(配有百萬分之一電子天平)；掃描電子顯微鏡(SEM,JSM-5510LV)。

1.2 纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯)的制備

稱取2.01 g干燥的微晶纖維素于250 mL三口燒瓶中,再加入70 mL干燥的吡啶,于110 ℃下攪拌溶脹12 h;加入13 mL 1-萘異氰酸酯后,升溫至120 ℃反應(yīng)24 h,反應(yīng)完畢后冷卻至室溫;將反應(yīng)液滴加到400 mL乙醇中,產(chǎn)生沉淀,減壓抽濾;用二甲基甲酰胺溶解所得固狀物,將溶液滴入乙醇中,進(jìn)行重沉淀,如此反復(fù)3次；最終濾餅用乙醇洗滌數(shù)次,先在常壓、60 ℃下干燥12 h,再于常溫、真空下干燥12 h,得到7.45 g纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯)，即纖維素衍生物灰色粉末,產(chǎn)率90%。

1.3 纖維素衍生物的涂覆——手性固定相的制備

參照文獻(xiàn)[12]制備氨丙基硅膠。稱取干燥至恒重的硅膠10.0 g于100 mL三口瓶中,加入25 mL甲苯、10 mL APTES和催化量干燥的三乙胺,磁力攪拌,于95 ℃下反應(yīng)24 h,過濾,用丙酮抽提24 h,干燥至恒重,得到10.3 g氨丙基硅膠。

稱取0.51 g纖維素衍生物溶解在30 mL的DMF中,加入2.81 g氨丙基硅膠,充分?jǐn)嚢?；在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸除DMF得到CSP。固定相中纖維素衍生物的涂覆量約為15.4%。圖2為手性固定相的制備示意圖。

圖2 手性固定相的制備示意圖

1.4 纖維素衍生物及固定相的表征

(1) 傅里葉紅外(FTIR)測試。采用KBr壓片法對實(shí)驗(yàn)中得到的纖維素衍生物進(jìn)行紅外光譜掃描,掃描范圍為4 000～400 cm-1。

(2) 元素分析。用元素分析儀在CHN模式下對氨丙基硅膠及纖維素衍生物進(jìn)行元素分析,樣品用百萬分之一天平稱取,取樣量為約為3 mg左右,測試前樣品需要干燥。

(3) 固定相形貌觀察。用SEM觀察氨丙基硅膠和相應(yīng)固定相的表觀形貌特征。

1.5 色譜柱的填充及柱效的測定

采用均漿法裝柱：將固定相均勻分散在異丙醇/正己烷(體積比為10∶90)勻漿液中,以正己烷為頂替液,用填充泵將CSP在34 M～44 MPa(5 000～6 500 psi)壓力下壓入空的不銹鋼色譜柱管中。

柱效的測定:以聯(lián)苯為分析物,以正己烷/異丙醇(體積比為90∶10)為流動(dòng)相,流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃,二極管陣列檢測器(DAD)檢測。

固定相分離性能的測定：用乙醇配制手性樣品溶液(1.0 g/L),進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,進(jìn)樣量為10 μL。所有流動(dòng)相在使用前過濾。流動(dòng)相的流速均為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃。測定死時(shí)間時(shí),以1,3,5-三叔丁基苯為分析物,其他參數(shù)同柱效測定方法一樣。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 纖維素衍生物紅外譜圖

圖3為纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯) 的FT-IR譜圖。在3307 cm-1處為氨基甲酸酯中的N—H伸縮振動(dòng)吸收峰,在3 049 cm-1和2 957 cm-1處有芳香環(huán)和纖維素骨架上C—H吸收峰,在1 743 cm-1處有—CO特征吸收峰,1 656～1 538 cm-1處出現(xiàn)—NHCO吸收峰,這些特征吸收峰的出現(xiàn)表明纖維素被氨基甲酸酯化。

圖3 纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯)的FT-IR譜圖

2.2 元素分析

元素分析結(jié)果:在3-氨丙基硅膠中,C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76%,H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60%,N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.05%,C、H和N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為2.41%,與3-氨丙基硅膠制備時(shí)增重比例基本相符合。在纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯)中元素分析的測定值:C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.73%,H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.80%,N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.28%；元素分析的理論計(jì)算值:C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.11%,H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.84%,N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.11%。纖維素-三(1-萘基氨基甲酸酯)中C、H和N的實(shí)測值和計(jì)算值基本相符。結(jié)合紅外光譜和元素分析的結(jié)果可知,所合成的產(chǎn)物即是實(shí)驗(yàn)中所需要的目標(biāo)產(chǎn)物。

2.3 SEM圖

圖4為3-氨丙基硅膠和固定相的掃描電鏡圖,(a)圖呈現(xiàn)的是3-氨基硅膠表面粗糙多孔形貌,(b)圖表明CSP的表面比(a)中3-氨基硅膠表面略平滑,甚至在部分區(qū)域可以觀察到片狀的薄膜覆蓋在3-氨基硅膠表面。

圖4 掃描電鏡譜圖

2.4 柱效的測定和手性識(shí)別能力評(píng)價(jià)

在正己烷/異丙醇(體積比為90∶10)條件下,測得柱效為2.91萬理論塔板數(shù),對稱因子為1.15,色譜柱柱效圖如圖5所示。該色譜柱的柱效和對稱因子均達(dá)到了高效液相色譜色譜柱的分離基本要求。有多種因素會(huì)影響色譜柱的柱效,一般來說,硅膠的粒徑越小,相應(yīng)色譜柱的理論塔板數(shù)越高；填充越均勻,柱效越高；硅膠上涂覆的高分子衍生物越均勻,柱效越高。此外,柱效還與裝柱操作有較大關(guān)系。

在正、反相條件下,用高效液相色譜檢測了色譜柱對6種手性藥物或者藥物中間體的分離性能。正相條件下以正己烷為流動(dòng)相,用乙醇或乙醇/甲醇混合物作為改性劑；反相條件下以用乙腈和水為流動(dòng)相。測試過程中,適當(dāng)改變流動(dòng)相的組成和比例來調(diào)節(jié)樣品的分離度。分離結(jié)果見表1(表中k1為保留因子，α為選擇性因子，Rs為分離度，分析物(a)—(f)見圖1)。由表1可以看出,6個(gè)化合物在CSP上均被分離,其中5號(hào)化合物在乙腈和水為流動(dòng)相中分離度高達(dá)3.16(見圖5),6號(hào)化合物在正相和反相中k1均較大,說明它與固定相作用力較強(qiáng),洗脫時(shí)間偏長。而沙利度胺在正相條件下無法識(shí)別。

表1 在正相和反相條件下CSP對映體分離

流動(dòng)相:A為乙腈/水(體積比為30∶70),B為乙腈/水(體積比為40∶60),C為乙醇/甲醇/正己烷(體積比為15∶15∶70),D為乙醇/正己烷(體積比為10∶90),E為乙醇/正己烷(體積比為5∶95), 流速為1 mL/min。

圖5 色譜柱柱效圖(A)和化合物5色譜分離圖(B)流動(dòng)相:A為正己烷/異丙醇(體積比為90∶10) ；B為乙腈/水(體積比為30∶70)

3 教學(xué)要求

3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本實(shí)驗(yàn)按照“合成、制備—分析、表征—實(shí)際應(yīng)用”這樣“一條龍”式的思路設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),突出應(yīng)用化學(xué)學(xué)科優(yōu)勢和特色。實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜缦?

(1) 鞏固有機(jī)合成中無水反應(yīng)操作,并能夠?qū)Ξa(chǎn)品進(jìn)行純化。使用紅外光譜、元素分析和SEM等分析方法對產(chǎn)品進(jìn)行表征。

(2) 學(xué)習(xí)色譜柱的裝填操作,了解細(xì)顆粒、高效率的固定相均勻填充技術(shù)，掌握色譜柱的柱效測定,結(jié)合理論和實(shí)際,分析影響色譜柱的分離性能的因素。

(3) 掌握液相色譜中的流動(dòng)相換相操作,探討改變流動(dòng)相條件對色譜分離性能影響。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理

(1) 根據(jù)色譜流出曲線,計(jì)算理論塔板數(shù)、保留因子、相對保留值和分離度。

(2) 根據(jù)元素分析結(jié)果,比較化合物的所含C、H和N的理論值和實(shí)測值。

(3) 根據(jù)傅里葉轉(zhuǎn)變紅外光譜分析纖維素衍生物所含的特征官能團(tuán)。

4 結(jié)語

纖維素的衍生化反應(yīng)需要在無水條件下進(jìn)行,相對于基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)來說,本實(shí)驗(yàn)的合成部份提高了實(shí)驗(yàn)操作的難度,有利于學(xué)生貫通知識(shí)、提高能力。手性色譜柱的制備和裝填及其手性分離應(yīng)用結(jié)合了有機(jī)合成和儀器分析兩門課程實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,本實(shí)驗(yàn)涵蓋的知識(shí)點(diǎn)較多,涉及到產(chǎn)品合成與表征、色譜柱的制備及手性藥物的分離等,有利于提高學(xué)生的科研興趣,鍛煉學(xué)生的科研能力,開拓學(xué)生的視野,培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力。同時(shí),在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中吸取優(yōu)秀的科研成果,使之滲入本科教學(xué),實(shí)現(xiàn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)化。

References)

[1] 邵保海, 徐秀珠, 傅小蕓, 等. 外消旋萘普生酯類在四種纖維素衍生物手性柱上分離及手性識(shí)別機(jī)理研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2001,59(11):1982-1988.

[2] Tang M, Zhang J, Zhuang S L, et al. Development of chiral stationary phases for high-performance liquid chromatographic separation[J]. Trends in Anal Chem, 2012,39:180-194.

[3] 王秧年, 陸大東, 奚忠華, 等. 高效液相色譜法快速分析手性聯(lián)萘酚的教學(xué)實(shí)踐[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理, 2015, 32(6):168-171.

[4] 陳國文, 高學(xué)平, 王成國. 新型硅膠鍵合固定相合成實(shí)驗(yàn)[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理, 2007, 24(11):39-42.

[5] 武志花, 趙杰, 李珅, 等. 新型環(huán)糊精手性色譜拆分材料的點(diǎn)擊化學(xué)調(diào)控及拆分性能研究[J]. 分析化學(xué), 2016，44(1):95-102.

[6] Chankvetadze B. Recent developments on polysaccharide-based chiral stationary phases for liquid-phase separation of enantiomers[J]. J Chromatogr A, 2012, 1269:26-51.

[7] 沈軍, 李庚, 李平, 等. 新型直鏈淀粉類手性固定相的制備與手性拆分性能[J]. 色譜, 2016，34(1):50-56.

[8] 李麗群, 范軍, 張晶, 等. 手性固定相AD、AS和OD的拆分性能[J]. 色譜, 2016，34(1):108-112.

[9] Zhang T, Francotte E. Chromatographic properties of composite chiral stationary phases based on cellulose derivatives[J]. Chirality, 1995，7(6):425-433.

[10] Chen X M, Zou H F, Ni J Y, et al. Synthesis and characteristics of composite chiral stationary phases based on cellulose derivatives[J]. J Sep Sci, 2003, 26(1/2):29-36.

[11] 潘富友, 李曉芳, 劉貴花, 等. 復(fù)合型多糖類手性固定相的制備及其手性識(shí)別能力[J]. 分析化學(xué), 2011,39(1):7-11.

[12] Ihara T, Sugimoto Y, Asada M,et al. Influence of the method of preparation of chiral stationary phases on enantiomer separations in high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr, 1995,694(1):49-56.

Design on comprehensive experiment for preparation and enantioseparation of chiral stationary phase derived from cellulose

Chen Wei, Bai Zhengwu

(Experimental Teaching Center of Environmental and Chemical Engineering Clean Production, Wuhan Institute of Technology, Wuhan 430073, China)

By using microcrystalline cellulose as raw material, the cellulose-three (1-naphthylcarbamate) is synthesized and then it is coated on the surface of the silica gel to prepare the chiral stationary phase. The cellulose derivatives and stationary phases are characterized by using the Fourier transform infrared spectroscopy, the elemental analyzer, the scanning electron microscopy, etc. The stationary phase is filled in an empty column to prepare the chiral chromatographic column, and the enantioseparation properties of the prepared column on the several chiral samples are tested by the high performance liquid chromatography. This experiment involves the knowledge related to the organic synthesis and characterization, and deals with the practical problems of chromatographic analysis of chiral drugs, etc. It is highly comprehensive and can be used as the comprehensive experimental teaching content for undergraduate students.

comprehensive chemical experiment; chiral stationary phase; enantioseparation; high performance liquid chromatography

10.16791/j.cnki.sjg.2017.05.012

2016-11-01 修改日期：2017-01-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51373127)；全國教育信息技術(shù)研究“十二五”規(guī)劃2015年度專項(xiàng)課題(153432679)；2015年武漢工程大學(xué)校級(jí)教學(xué)研究項(xiàng)目(X2015024)

陳偉(1975—)，男，湖北黃岡，博士，副教授，從事色譜分離材料的研究和分析化學(xué)教學(xué)工作.

E-mail：wchen@wit.edu.cn

G642.423；O657.7

A

1002-4956(2017)5-0044-04