郭全友，包海蓉，何 木，朱彥祺

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

不同溫度條件下養(yǎng)殖大菱鲆菌群變化和貨架期預測

郭全友1，包海蓉2，何 木3，朱彥祺3

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

對低溫（0～10 ℃）、室溫（25 ℃）和變溫貯藏條件下養(yǎng)殖大菱鲆的細菌種群變化進行研究，確定不同溫度條件下養(yǎng)殖大菱鲆的優(yōu)勢腐敗菌和貨架期，并采用Exponential、School-field和Square-root方程構建貨架期預測模型，并對貨架期預測模型的適用性進行評價和驗證。結果顯示，低溫貯藏大菱鲆貨架期為6.1～32.6 d，優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌（40.3%）和假單胞菌屬（27.4%），室溫時貨架期為1.3 d，優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌（47.1%）和腐敗希瓦氏菌（29.4%）；構建的Exponential、School-field和Square-root貨架期模型參數(shù)分別為溫度特征系數(shù)a=0.12，Tmin=－6.6 ℃，表觀活化能（Ea）為81.4 kJ/mol，采用均方根誤差、殘差平方和、偏差度、準確度對模型的擬合優(yōu)度進行比較，Square-root模型預測性能最優(yōu)，用恒溫和變溫對3 種貨架期預測模型進行驗證，顯示Square-root貨架期模型誤差最小，可有效預測恒溫和變溫條件下大菱鲆的貨架期。

養(yǎng)殖大菱鲆；細菌菌群；優(yōu)勢腐敗菌；貨架期預測

引文格式：

郭全友, 包海蓉, 何木, 等. 不同溫度條件下養(yǎng)殖大菱鲆菌群變化和貨架期預測[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 231-236. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711037. http://www.spkx.net.cn

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大菱鲆（Scophthalmus maximus）屬鰈形目鲆科魚類，1992年引自英國，在國內(nèi)外具有廣泛的市場，2012年產(chǎn)量約11.36萬t，是一種重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類，被譽為“一鲆二鏡三鰨”之首[1]。大菱鲆以鮮活流通為主，也包括咸干、烤制和熏制等產(chǎn)品形式。為了避免其運輸過程中的腐敗變質，冰鮮冷鏈流通逐漸成為其運輸?shù)闹饕绞健＿@是因為從大菱鲆的捕獲、處理、加工到消費終端，魚體溫度較高會加速酶解和細菌腐敗的速率，而低溫貯藏能夠有效地降低其鮮度損失。冰鮮冷鏈流通通常以加冰運輸?shù)男问?，以保證魚體溫度不大于2 ℃，在此過程中輔以快冷致死、離子照射及添加保鮮劑等可有效延長其貨架期（shelf life，SL）[2-3]。但低溫貯藏的代價相對昂貴，最高安全限值常設為8 ℃[4]。在實際冷鏈流通過程中，魚體常常脫離冷鏈，貯藏溫度并不固定，因此，建立不同溫度條件下貨架期預測模型對實時監(jiān)控鮮度狀況及采取有效措施具有重要意義。

研究者對養(yǎng)殖大菱鲆品質、腐敗菌群、貨架期、冷卻保鮮等進行了一定研究[5-6]。依據(jù)冷藏大菱鲆的特定腐敗菌構建的貨架期預測模型，可快速準確預測大菱鲆0～10 ℃貯藏過程中的鮮度變化和剩余貨架期[6]，若超出低溫范圍，導致鮮魚腐敗的細菌種群存在較大差異，貨架期預測模型亦無法做出預測。因此，本實驗通過對鮮活、低溫、常溫和變溫貯藏過程中的大菱鲆感官、理化和微生物學鮮度指標及細菌菌群的研究，確定低溫和室溫（25 ℃）條件下貨架期和優(yōu)勢腐敗菌，采用經(jīng)驗模型構建貨架期預測模型，用恒定和波動溫度條件下貨架期進行驗證，為有效克服微生物檢測的滯后性和溫度范圍限制，實現(xiàn)養(yǎng)殖大菱鲆恒定和波動溫度條件下貨架期的快速預測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

本實驗中所用鮮活大菱鲆購自上海市銅川路水產(chǎn)批發(fā)市場，加氧袋裝至實驗室，冰水致死，分別進行低溫（0、3、7 ℃和10 ℃）、室溫（25 ℃）和變溫（0 ℃→5 ℃→15 ℃→25 ℃→8 ℃）貯藏，用溫度-時間記錄儀記錄溫度變化，1 次/h，合適間隔取樣。

1.2 儀器與設備

IUL自動菌落計數(shù)儀 西班牙CounterMat Flash公司；MIR253培養(yǎng)箱 日本三洋公司；MIDI微生物鑒定系統(tǒng)美國Microbia公司；微生物鑒定系統(tǒng) 美國Biolog公司；175-T2時間溫度記錄儀 德國Test公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀、3730測序分析儀 美國Allied Business Intelligence公司；CFC培養(yǎng)基英國Oxoid公司；胰酶解大豆胨瓊脂 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 指標測定

1.3.1.1 揮發(fā)性鹽基氮值的測定

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的測定參照SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》。

1.3.1.2 三甲胺值的測定

三甲胺（trimethylamine，TMA）值的測定參照李學英等[7]的方法。

1.3.1.3 微生物計數(shù)

菌落總數(shù)（total viable counts，TVC）：參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，取3 個合適梯度的稀釋液，涂布于瓊膠培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)；產(chǎn)H2S菌數(shù)：用鐵瓊脂IA雙層平板上，25 ℃培養(yǎng)72 h，計數(shù)黑色菌落；假單胞菌數(shù)：涂布于CFC培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.1.4 細菌鑒別

選取菌數(shù)合適（30～100 CFU/g）且分散均勻的平板，依據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢有無和生理生化等特征，參照Brown推薦的微生物鑒定圖譜和《伯杰氏細菌鑒定手冊》等，運用雙歧分類法進行多相分類，采用Sherlock MIS系統(tǒng)對不同組別菌株進行鑒定。若同組出現(xiàn)相異結果，用Biolog GEN-Ⅲ板和16S rRNA測序進行確認。

1.3.2 大菱鲆貨架期預測模型構建、評價和驗證

1.3.2.1 貨架期模型構建

綜合TVB-N值、TMA值和TVC等指標確定貨架期終點；溫度對貨架期（SL）的影響用腐敗速率（rate of spoilage，RS），即貨架期的倒數(shù)（day－1）表示。溫度為T時的腐敗速率除以參考溫度Tref時的腐敗速率，即相對腐敗速率（relative rate of spoilage，RRS），為參考溫度條件下貨架期與實際溫度條件下貨架期的比值。擬合模型包括RRS的Exponential模型、School-field模型、Squareroot模型，分別見式（1）～（3）[3,8]。

式中：T為貯藏溫度/℃；R為氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；Ea為表觀活化能/（kJ/mol）；a為溫度特性系數(shù)；Tmin為理論最小溫度/℃；Tref為參考溫度/℃。

1.3.2.2 貨架期模型評價與驗證

模型評價：采用R2、準確度（Af）、偏差度（Bf）、殘差平方和（residual sum of squares，RSS）和均方根誤差（root mean square error，RMSE）等對模型擬合優(yōu)度進行評價，R2、Af和Bf值越接近于1，RMSE越接近于0，預測效果越好[3,8-9]。方程如下，其中Xcal和Xobs分別為預測值和實測值。模型驗證：用3 ℃和變溫時的貨架期對恒溫和變溫貨架期預測模型進行驗證。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件中One-way ANOVA和雙尾檢驗進行差異及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 大菱鲆鮮度品質和貨架期

由表1可知，大菱鲆冷藏初始TVB-N值和TMA值分別為（7.60±2.73）mg/100 g和（0.04±0.04）mg/100 g，符合鮮海水魚一級要求。大菱鲆初始菌數(shù)主要與養(yǎng)殖環(huán)境、季節(jié)及預處理等相關，其TVC、產(chǎn)H2S菌和假單胞菌數(shù)分別為（3.67±0.17）、（2.58±0.58） （lg（CFU/g））和（3.06±0.58）（lg（CFU/g）），在低溫條件下延滯期較長，室溫條件下延滯期極短，能夠迅速進入生長期。由于酶和腐敗菌的作用，其蛋白質分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮物質。這一類含氮物質，即TVB-N，具有較強的揮發(fā)性，嚴重影響大菱鲆的感官品質；其含量越高，說明腐敗的程度越大。此外，在腐敗過程中，氧化TMA（氧化態(tài)）會被還原為TMA（還原態(tài)）。因此，TVB-N和TMA值常作為海水魚腐敗的化學指標。

表1 不同溫度貯藏條件下養(yǎng)殖大菱鲆各指標的變化（n=3）Table 1 Change in biochemical parameters of farmed Scophthalmus maximus stored at different temperatures (n= 3)

大菱鲆低溫（10 ℃）貯藏貨架期終點TVC、產(chǎn)H2S菌數(shù)和假單胞菌數(shù)分別為（7.46±0.53）、（6.80±0.17） （lg（CFU/g））和（7.26±0.34）（lg（CFU/g）），TVB-N和TMA平均值分別為（34.38±0.65）mg/100 g和（11.06±0.41）mg/100 g，室溫貯藏大菱鲆貨架期終點時TVC、產(chǎn)H2S菌數(shù)和假單胞菌數(shù)為（7.06±0.06）、（6.89±0.09）（lg（CFU/g））和（7.03±0.10）（lg（CFU/g）），略高于低溫的貨架期終點值，且假單胞菌數(shù)高于產(chǎn)H2S菌數(shù)。TVB-N和TMA值分別為（35.05±0.12）mg/100 g和（9.11±0.09）mg/100 g。變溫貯藏大菱鲆貨架期終點時TVC、產(chǎn)H2S菌數(shù)和假單胞菌數(shù)分別為（6.97±0.65）、（5.75±0.21）（lg（CFU/g））和（6.35±0.10）（lg（CFU/g）），TVB-N和TMA值分別為（29.68±1.58）mg/100 g和（8.86±0.08）mg/100 g。大菱鲆貨架期終點時TVB-N值約為（29.12～35.05）mg/100 g，基本處在TVB-N值處在低溫貯藏魚可接受界限范圍（30～35 mg/100 g），TVC基本處在ICMS推薦的細菌限量值107CFU/g范圍內(nèi)[10-12]。綜合大菱鲆感官、化學和微生物等指標，確定低溫（0～10 ℃）和室溫的貨架期為6.1～32.6 d和1.3 d，4 ℃冷藏貨架期為12 d在所得范圍之內(nèi)[5]。

2.2 大菱鲆貯藏過程細菌菌相變化

表2和表3為大菱鲆初始和貨架期終點細菌相。檢出的14 種菌中革蘭氏陰性均占優(yōu)勢，約占75%～90%；革蘭氏陽性菌占5.0%～17.3%，主要包括假單胞菌、腸桿菌和腐敗希瓦氏菌，弧菌屬（Vibrio spp.）也是常見水生菌和魚類典型菌，綜合比例平均值比例達到17.9%。a

表2 大菱鲆初始細菌菌相組成Table 2 Initial bacterial flora composition of Scophthalmus maximus

表3 低溫和室溫貯藏大菱鲆貨架期終點菌相組成Table 3 Bacterial flora of farmed Scophthalmus maximus stored aerobically at low or ambient temperatures at the end of shelf life

低溫貯藏過程細菌相發(fā)生了較大變化，貨架期終點時細菌菌相包括腐敗希瓦氏菌（40.3%）、假單胞菌屬（27.4%）和不動桿菌（14.9%），并出現(xiàn)了少量的嗜麥芽窄食單胞菌和氣單胞菌等。分離的腐敗希瓦氏菌能產(chǎn)生H2S，還原氧化三甲胺產(chǎn)生TMA，對過氧化氫酶和氧化酶陽性，是一種非發(fā)酵、運動性的革蘭氏陰性桿菌，與低溫冷藏海水魚類的主要腐敗細菌為希瓦氏菌一致[3,13]，與0 ℃貯藏三文魚特定腐敗菌為熒光假單胞菌存在一定差異[14]。室溫（25 ℃）貯藏大菱鲆優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌（47.1%），并出現(xiàn)了一定比例的腐敗希瓦氏菌（29.4%）。低溫與室溫的菌相差異明顯，說明溫度和環(huán)境是影響細菌生長繁殖的關鍵因素。

2.3 大菱鲆RRS模型構建與評價

以0℃為參考溫度，0、7、10 ℃和25 ℃的RRS值分別為1.00、4.05、5.36和25.07，采用Exponential、School-field和Square-root方程對RRS值和溫度相關性進行擬合，得到RRS值模型（表4），可知溫度特征系數(shù)=0.12，Tmin=－6.6 ℃，表觀活化能（Ea）為81.4 kJ/mol。

采用Bf、Af、RSS和RMSE對3 種相對腐敗菌速率模型的擬合優(yōu)度進行評價[16]。Bf=1.0表示預測值與實測值間沒有誤差，偏差1.1和0.9分別表示預測值的上下偏差各為10%，0.75～1.25被認為是可靠的[8,15]。3 種模型的Bf為0.90～1.03（表5），表明3 種模型預測值是可靠的。

表4 大菱鲆3 種相對腐敗速率模型構建Table 4 Establishment of three predictive models for relative spoilage rate of farmed Scophthalmus maximus

表5 大菱鲆3 種RRS模型的預測性能評價Table 5 Evaluation of predictive performance of three RRS models for farmed Scophthalmus maximus

Af為1.0時表示實測值與預測值相同，Af＞1表示實測值與預測值之間存在差異性，1.1的準確度說明預計值和實際值之間的平均差異是10%[17-18]，Af＜1.30表示模型是可接受的，當Af＞1.3被認為實測值和預測值具有較大偏差。Bf中Square-root的值最低，表示其準確度相對更高，同時RSS與RMSE也均明顯小于其余的2 種模型。綜合Bf、Af、RSS和RMSE等評價參數(shù)，大菱鲆的Square-root模型評價參數(shù)值均最低，表明其預測性能最優(yōu)。

2.4 大菱鲆恒溫貨架期預測模型構建與驗證

常選取0 ℃作為新鮮魚類貨架期模型的參考溫度，把0 ℃大菱鲆貨架期（32.6 d）和溫度特性系數(shù)a、Ea及Tmin代入式（1）～（3），得到恒定溫度條件下的貨架期預測模型（式（8）～（10））。利用式（8）～（10）可計算出大菱鲆3 ℃貯藏時貨架期預測值，分別為22.7、22.1 d和15.6 d（表6），貨架期實測值與預測值之間的相對誤差為44.6%、40.8%和－0.6%，表明式（10）能較好預測恒溫條件下大菱鲆的貨架期。

表6 恒溫和變溫有氧貯藏大菱鲆貨架期預測模型驗證Table 6 Validation of shelf life predictive models for chilled cultured fish stored aerobically under isothermal and non-isothermal conditions

2.5 大菱鲆變溫貨架期預測模型構建與驗證

采用式（8）和式（10），把不同溫度條件下的所經(jīng)歷的貯藏時間（storage time，ST）轉化為參考溫度條件下的貯藏時間[19-20]，轉化值與參考溫度條件下的貨架期差值，即以推導一定溫度條件下的剩余貨架期預測方程（式（11）～（13））[21-22]。

式中：RSLT為溫度T時的剩余貨架期/d；STTn為溫度Tn時的貯藏時間/d。

由表6可見，大菱鲆經(jīng)波動溫度后，到達貨架期終點（8.6 d），得到波動溫度情況下貨架期的預測值分別為12.4、10.7 d和7.5 d，相對誤差分別為44.2%、24.4%和7.5%。通過比較3 種剩余貨架期預測模型的相對誤差，可知平方根剩余貨架期模型能很好地預測大菱鲆剩余貨架期。郭全友等[23]開發(fā)的大黃魚School-field及Exponential貨架期模型性能優(yōu)于Square-root貨架期模型，能快速有效預測0～25 ℃范圍的大黃魚品質；潘文龍等[24]證明了零級化學反應動力學更適合指示河鯽魚各指標品質變化規(guī)律；吳奇子等[25]構建了鮐魚貨架期預測模型，證明一級化學反應動力學模型更加適合，表明每種水產(chǎn)品預測模型的適用性具有差異性[26-30]。

3 結 論

大菱鲆初始細菌種群較復雜，共分離出14 種細菌；低溫貯藏優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，室溫優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌。低溫貯藏大菱鲆貨架期為6.1～32.6 d，室溫時貨架期為1.3 d；整個貨架期內(nèi)，大菱鲆的TVB-N、TMA值和TVC之間呈顯著相關（P＜0.01），終點時分別為29.12～35.05、8.86～11.30 mg/100 g和107CFU/g。采用了3 種模型，Exponential、School-field和Squareroot對相對腐敗速率進行擬合，并采用R2、Af、Bf、RSS和RMSE等對擬合優(yōu)度進行評價，結果顯示大菱鲆的Square-root模型預測性能和擬合度最好。構建了恒溫和變溫條件下貨架期和剩余貨架期預測模型，驗證結果顯示Square-root模型能很好預測大菱鲆貨架期和剩余貨架期。

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Shelf Life Prediction and Spoilage Bacteria Changes of Farmed Turbot (Scophthalmus maximus) at Different Storage Temperatures

GUO Quanyou1, BAO Hairong2, HE Mu3, ZHU Yanqi3
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Changes in physicochemical indicators and bacterial flora of farmed Scophthalmus maximus stored at low (0–10 ℃), ambient and fluctuating temperatures were determined. Meanwhile, the predominant spoilage organisms and shelf life under the three storage conditions were also studied, and shelf-life predictive models were fitted by means of Exponential, School-field and Square-root equations, respectively and their goodness of fit was evaluated. The results showed that the shelf life of farmed Scophthalmus maximus was 6.1–32.6 days at low temperature, and the predominant spoilage bacteria were Shewanella putrefaciens (40.3%) and Pseudomonas spp. (27.4%); the shelf life was 1.3 days at room temperature, and the predominant spoilage bacteria were Aeromonas spp. (47.1%) and Shewanella putrefaciens (29.4%). The temperature characteristic coefficient a, theoretical minimum temperature Tminand activation energy Eafrom the Exponential, Schoolfield and Square-root models were 0.12, –6.6 ℃ and 81.4 kJ/mol, respectively. The goodness of fit of the three models was compared by accuracy factor (Af), bias factor (Bf), root mean square error (RMSE) and mean residual error (MRE), and the predictive ability of the Square-root model was better than that of other models. The model predictions were experimentally validated under isothermal and non-isothermal conditions, and the relative error of the Square-root model was lower than that of the other models, suggesting that it could be used as a reliable to accurately predict the shelf life of farmed Scophthalmus maximus under isothermal and non-isothermal conditions.

farmed Scophthalmus maximus; bacterial flora; predominant spoilage bacteria; shelf life prediction

10.7506/spkx1002-6630-201711037

S983

A

1002-6630（2017）11-0231-06

2016-07-21

國家自然科學基金面上項目（31371867）；上海市自然科學基金項目（16ZR1444900）；中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務費專項（2011M04；2014G02）

郭全友（1974—），男，副研究員，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工與安全保障。E-mail：dhsguoqy@163.com