高錦錦，郭宇星,*，潘道東,2

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

Caco-2細(xì)胞模型用于乳源ACE抑制肽LL、LPEW的小腸吸收研究

高錦錦1，郭宇星1,*，潘道東1,2

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

通過(guò)建立并驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞模型，分析血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE）抑制肽LL、LPEW在小腸中的轉(zhuǎn)運(yùn)量，研究LL、LPEW的小腸吸收機(jī)制。從細(xì)胞形態(tài)、跨膜電阻和堿性磷酸酶活性3 個(gè)方面驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞模型可用性。分析ACE抑制肽LL、LPEW的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)量，LL的表觀滲透系數(shù)（Papp）為（275.17±8.28）×10－7cm/s，腸道吸收良好；LPEW的Papp為（5.13±1.49）×10－7cm/s，相比于LL，腸道吸收量較低。加入旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑去氧膽酸鈉、內(nèi)吞抑制劑渥曼青霉素（Wortmannin）、肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑Gly-Pro，對(duì)比無(wú)抑制劑時(shí)LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量，分析得到LL的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能為內(nèi)吞途徑。加入ATP能量生成抑制劑疊氮化鈉、多藥耐藥蛋白抑制劑MK-571、P-糖蛋白抑制劑維拉帕米，對(duì)比無(wú)抑制劑時(shí)肽LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量，得出LL沒(méi)有外排作用，所以LL腸道吸收較好。

ACE抑制肽；Caco-2細(xì)胞模型；小腸吸收

高錦錦, 郭宇星, 潘道東. Caco-2細(xì)胞模型用于乳源ACE抑制肽LL、LPEW的小腸吸收研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(11): 214-219. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711034. http://www.spkx.net.cn

GAO Jinjin, GUO Yuxing, PAN Daodong. Intestinal absorption of milk-derived ACE inhibitory peptides LL and LPEW using Caco-2 cell model[J]. Food Science, 2017, 38(11): 214-219. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711034. http://www.spkx.net.cn

乳源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE）抑制肽來(lái)源于乳蛋白，氨基酸序列和肽鏈長(zhǎng)度各不相同，具有抗人體血壓升高功效。ACE是一種羧二肽酶，能使血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ具有血管收縮調(diào)節(jié)功能，使人體血壓升高；同時(shí)ACE能水解緩激肽，使之失去活性，使人體血壓升高[1]。乳源ACE抑制肽通過(guò)抑制ACE的活性來(lái)減少血管緊張素Ⅱ的生成和抑制緩激肽的水解，進(jìn)而抵抗人體血壓升高。近些年，在乳蛋白水解物和一些發(fā)酵乳制品中已發(fā)現(xiàn)了多種ACE抑制肽，如Nakamura[2]、yamamoto[3-4]等從乳中分離出2 種ACE抑制肽（VPP、IPP），VPP和IPP都有體外ACE抑制活性，并可降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓。

Caco-2細(xì)胞（human colon adenocarcinoma cell lines）首次于20世紀(jì)70年代從人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞中分離得到，在聚碳酸酯膜或聚酯膜上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)約21 d后Caco-2細(xì)胞可自發(fā)的分化為小腸單層上皮細(xì)胞，用來(lái)模擬體內(nèi)小腸上皮單層細(xì)胞[5]。目前Caco-2細(xì)胞模型已成為藥物吸收研究的一種快速篩選工具，與其他用于研究吸收的模型相比，重復(fù)性較好，穩(wěn)定并且應(yīng)用廣泛，可在細(xì)胞水平上提供受試物穿過(guò)小腸黏膜的吸收、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的綜合信息[6]。

乳源ACE抑制肽無(wú)副作用、安全可靠，有巨大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。然而，許多ACE抑制肽在體外生理活性驗(yàn)證時(shí)活性很強(qiáng)，而進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)活性很弱，甚至失去活性，這是因?yàn)槿樵碅CE抑制肽必須克服腸道黏膜、消化道酶系等一系列障礙，以活性形式轉(zhuǎn)運(yùn)至體液循環(huán)才有生理作用。小腸是物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，也是ACE抑制肽吸收的最大屏障，多肽的小腸吸收機(jī)制已有相關(guān)報(bào)道，已報(bào)道的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、胞飲作用轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)是多肽在小腸內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑主要的3 種形式[7]。另外有些報(bào)導(dǎo)顯示，氨基酸序列、多肽鏈長(zhǎng)度等因素會(huì)影響多肽的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，如成功克隆人和哺乳動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞刷狀緣側(cè)的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hPepT1），揭示出哺乳動(dòng)物的腸腔內(nèi)存在特殊轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)二肽三肽的吸收[8]。南京師范大學(xué)乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心從牛乳中分離提取得到了2 種乳源ACE抑制肽LL（Leu-Leu）[9]、LPEW（Leu-Pro-Glu-Trp）[10]，但二者的小腸吸收機(jī)制尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建Caco-2細(xì)胞模型研究LL，LPEW的小腸吸收機(jī)制，旨在為ACE抑制肽應(yīng)用于功能性食品市場(chǎng)和藥品市場(chǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LL、LPEW（來(lái)源于乳清蛋白的ACE抑制肽）由南京師范大學(xué)國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心分離純化并測(cè)序，由上海楚肽生物科技有限公司合成，純度為90%。

胎牛血清（特優(yōu)級(jí)Gibco）、不完全DMEM培養(yǎng)基（原裝Gibco干粉配制，含1%雙抗）、Caco-2細(xì)胞 南京凱基生物科技有限公司；非必需氨基酸、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化液、青霉素-鏈霉素混合液 南京丁貝生物科技有限公司；渥曼青霉素（Wortmannin）、去氧膽酸鈉、維拉帕米抑制劑、MK-571抑制劑 美國(guó)Sigma公司；Gly-Pro（純度＞95%） 上海楚肽生物科技有限公司；疊氮化鈉 浙江省東陽(yáng)市天宇化工有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

25 cm2卡式培養(yǎng)瓶 丹麥NUNC公司；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋電器集團(tuán)；Transwell培養(yǎng)板（孔徑0.4 μm，膜面積1.12 cm2、12 孔的聚酯膜）美國(guó)C o s t a r公司；M i l l i c e l l E R S-2電阻儀美國(guó)Millipore公司；XD-202型倒置生物顯微鏡南京江南永新光學(xué)有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm） 美國(guó)安捷倫科技公司；754紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Caco-2細(xì)胞模型的建立

細(xì)胞培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[7]，在25 cm2卡氏培養(yǎng)瓶中，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%的100 U/mL青霉素-鏈霉素配制DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養(yǎng)液中，然后放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)液1～2 d更換1 次，3～4 d傳代1 次。

[7]建立Caco-2細(xì)胞模型：當(dāng)細(xì)胞在卡氏培養(yǎng)瓶中達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，倒掉舊的培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度以2×105個(gè)/mL接種于12 孔Transwell板的濾膜上。在Transwell板的上室和下室分別加入0.5 mL的細(xì)胞懸液和1.5 mL的DMEM培養(yǎng)液。接種后第一周隔天換液，第二周和第三周每天換液，培養(yǎng)21～24 d待用。每天倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間的緊密度變化，同時(shí)2 d測(cè)一次Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻（trans epithelial electric resistance，TEER）。

1.3.2 Caco-2單層細(xì)胞模型完整性評(píng)價(jià)

1.3.2.1 Caco-2單層細(xì)胞模型完整性評(píng)價(jià)指標(biāo)

Caco-2單層細(xì)胞的完整性決定此Caco-2細(xì)胞模型能否用于研究待測(cè)樣的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，評(píng)價(jià)指標(biāo)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)、TEER和AKP活性[11]。

1.3.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

用倒置光學(xué)顯微鏡，按照低倍鏡到高倍鏡的順序觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及細(xì)胞間的緊密度并記錄。

1.3.2.3 細(xì)胞單層完整（緊密）性測(cè)定

Caco-2細(xì)胞的TEER隔天用細(xì)胞電阻儀測(cè)定，以記錄Caco-2單層細(xì)胞的完整性和緊密性的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程[12]。TEER按照式（1）計(jì)算。

式中：R1為實(shí)驗(yàn)組（接種Caco-2細(xì)胞）電阻測(cè)量值/Ω；R0為空白組（沒(méi)有接種細(xì)胞）電阻測(cè)量值/Ω；S為膜面積/cm2。

Caco-2細(xì)胞TEER＞500 Ω·cm2，說(shuō)明細(xì)胞已形成緊密的單層，可用于研究待測(cè)樣的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，TEER值介于200～1 000 Ω·cm2時(shí)，電阻值越大，單層細(xì)胞越致密[13]。

1.3.2.4 AKP活性檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[14]，在Caco-2細(xì)胞不同生長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)，按試劑盒要求測(cè)定Caco-2細(xì)胞頂側(cè)（apical side， AP側(cè)）和基底側(cè)（baso lateral side，BL側(cè)）的AKP活性。

1.3.3 LL、LPEW跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量的測(cè)定

采用反相高效液相色譜（reverse phase-HPLC，RP-HPLC）法在Transwell板進(jìn)行操作。HBSS（Hank’s balanced salt solution）緩沖液（pH 7.4）小心沖洗Caco-2細(xì)胞3 次，Caco-2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min后，輕輕吸去孔內(nèi)HBSS[13]。在Transwell板上室（AP側(cè)）分別加入含有ACE抑制肽（LL、LPEW）的HBSS 0.5 mL，兩種肽的濃度為1 mmol/L，在Transwell板下室（BL側(cè)）加入HBSS 1.5 mL，轉(zhuǎn)運(yùn)1 h后，用RPHPLC法測(cè)定下室的肽含量。

RP-HPLC檢測(cè)方法：樣品150 μL，經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾，取濾液20 μL進(jìn)樣。色譜條件[5]為：檢測(cè)波長(zhǎng)202 nm；流速1 mL/min；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（水）=22∶78，0.05%三氟乙酸；柱溫30 ℃。以表觀滲透系數(shù)Papp/（cm/s）表示ACE肽的轉(zhuǎn)運(yùn)量，計(jì)算公式見(jiàn)式（2）。

式中：dQ×dt－1為滲透速率/（μmol/s），根據(jù)樣品在不同時(shí)間轉(zhuǎn)運(yùn)至BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)時(shí)間回歸得到的直線斜率；A是Transwell膜表面積/cm2；C0為Caco-2細(xì)胞AP側(cè)初始質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.4 ACE抑制肽LL跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

1.3.4.1 LL的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

LL的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制實(shí)驗(yàn)方法同1.3.3節(jié)。在Transwell板的AP側(cè)分別加入100 μmol/L的旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑去氧膽酸鈉、500 nmol/L的內(nèi)吞抑制劑Wortmannin、10 mmol/L的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑Gly-Pro[15-16]， 轉(zhuǎn)運(yùn)1 h后，在BL側(cè)取樣，RP-HPLC分析肽濃度。

1.3.4.2 LL的外排機(jī)制

LL的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制實(shí)驗(yàn)方法同1.3.3節(jié)。在AP側(cè)分別加入10 mmol/L的ATP能量生成抑制劑疊氮化鈉、50 μmol/L多藥耐藥蛋白抑制劑MK-571、100 μmol/L的P-糖蛋白抑制劑維拉帕米[17]，轉(zhuǎn)運(yùn)1 h后，在BL側(cè)取樣，RP-HPLC分析肽濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 Caco-2單層細(xì)胞模型完整性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.1 Caco-2細(xì)胞形態(tài)觀察

圖1 Caco-2細(xì)胞的形態(tài)圖（×20）Fig. 1 Micrograph images of Caco-2 cells (× 20)

圖1 為倒置光學(xué)顯微鏡下觀察到的Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。培養(yǎng)1～2 d后，可清楚地辨認(rèn)出細(xì)胞的邊緣輪廓，第21天時(shí)觀察成熟的Caco-2細(xì)胞均勻、致密，邊界清晰，可見(jiàn)細(xì)胞間的致密接觸，表明Caco-2細(xì)胞形成了完整致密單細(xì)胞層。

2.1.2 細(xì)胞單層完整（緊密）性

圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)間Caco-2細(xì)胞的TEERFig. 2 Transepithelial electrical resistance of Caco-2 monolayers at different growth times

電阻值是由離子經(jīng)細(xì)胞旁間隔的流動(dòng)而形成的，而且一般在200～1 000 Ω·cm2范圍內(nèi)TEER與細(xì)胞單層的緊密度成呈相關(guān)。由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TEER逐漸變大，推知Caco-2細(xì)胞單層越來(lái)越緊密。第1周Caco-2細(xì)胞的TEER增加緩慢，但是第二周跨膜電阻快速增加，第14天時(shí)已增加到300 Ω·cm2左右。第三周TEER增長(zhǎng)速率逐漸變小， 20～24 d跨膜電阻開(kāi)始穩(wěn)定，基本維持在500 Ω·cm2，說(shuō)明細(xì)胞緊密連接，形成了致密的細(xì)胞單層。一般培養(yǎng)21 d后，TEER介于400～700 Ω·cm2的Caco-2細(xì)胞可用于吸收和代謝研究[18]。2.1.3 AKP的活性

AKP是Caco-2細(xì)胞極化的標(biāo)志性酶，主要表達(dá)在刷狀緣，可根據(jù)刷狀緣上堿性磷酸酶的活性來(lái)判斷細(xì)胞是否形成極性。經(jīng)檢測(cè)可知AKP活力比（AP/BL）隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，24 d后，兩側(cè)酶活性比擴(kuò)大為1.00∶1.84，說(shuō)明Caco-2細(xì)胞膜極化特征顯現(xiàn)。綜合Caco-2細(xì)胞形態(tài)、TEER和AKP活性3 個(gè)指標(biāo)來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)建立的Caco-2細(xì)胞模型可用于ACE抑制肽的腸道吸收研究。

2.2 ACE抑制LL、LPEW經(jīng)Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果

分析圖Fig. 3 RP-HPLC analysis of LL圖3 LL的RP-HPLC

圖3 中保留時(shí)間3.972 min為L(zhǎng)L的色譜峰。a、b兩圖比較得出Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后BL側(cè)LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量較大，LL的Papp為（275.17±8.28）×10－7cm/s。圖4中保留時(shí)間7.161 min為L(zhǎng)PEW的色譜峰，LPEW的Papp為（5.13±1.49）×10－7cm/s，轉(zhuǎn)運(yùn)量較少。以Caco-2細(xì)胞模型來(lái)判定藥物吸收難易程度的一般標(biāo)準(zhǔn)為：Papp＜1×10－7cm/s為吸收不良的藥物，吸收率在0%～20%；Papp在1×10－7～10×10－7cm/s范圍為吸收中等的藥物，吸收率在20%～70%；Papp＞10×10－7為吸收良好的藥物，吸收率在70%～100%[19]。參考此標(biāo)準(zhǔn)，LL的吸收較好，LPEW屬于吸收中等。

分析圖Fig. 4 RP-HPLC analysis of LPEW圖4 LPEW的RP-HPLC

ACE抑制肽的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)量可能與肽鏈長(zhǎng)度有關(guān)[20]。有報(bào)導(dǎo)顯示半徑大于11～15 ?的分子是不能透過(guò)腸道上皮細(xì)胞的緊密連接[21]。另一方面腸道中存在肽酶構(gòu)成的生化屏障，也影響著肽最終的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。Rieko等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肽在刷狀緣膜上可被肽酶酶解，肽鏈長(zhǎng)度與水解率相關(guān)，一般肽鏈越長(zhǎng)被酶解的可能性越大。例如，二肽酶解率只有10%，三肽酶解率達(dá)到10%～60% ，四肽或肽鏈更長(zhǎng)的肽酶解率超過(guò)90%。Quirós等[23]發(fā)現(xiàn)了LHLPLP可被細(xì)胞刷狀緣肽酶水解為HLPLP片段。另外，ACE抑制肽的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也可能與肽的疏水性有關(guān)。Rieko等[22]通過(guò)人工脂質(zhì)膜滲透通道模型研究肽的結(jié)構(gòu)和透過(guò)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)親水性越大，氫鍵越強(qiáng)，滲透量越小。本實(shí)驗(yàn)中，LL為二肽，LPEW為四肽，LL與LPEW的平均疏水性（grand average of hydropathy，GRAVy）分別為3.8和－0.55[24]，LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量要高于LPEW。另外，祝倩[24]報(bào)道了VPP和IPP的GRAVy分別為0.33、0.43，但由于存在C端脯氨酸，脯氨酸能抵御消化酶酶解，所以，VPP和IPP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量也較大。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究ACE抑制肽LL的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和外排機(jī)制。

2.3 LL的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

圖5 Gly-Pro、Wortmannin和去氧膽酸鈉對(duì)LL轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig. 5 Effect of Gly-Pro, Wortmannin and sodium deoxycholate on the transepithelial transport of LL across Caco-2 cell monolayer

物質(zhì)經(jīng)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)分為跨上皮細(xì)胞途徑（transcellular transport）和跨上皮細(xì)胞間隙途徑（paracellular transport）兩大類?？缟掀ぜ?xì)胞途徑又根據(jù)具體不同的吸收機(jī)制分為3 類：載體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需載體蛋白傳運(yùn)；內(nèi)吞作用：物質(zhì)被包在囊泡中并內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞；被動(dòng)擴(kuò)散：一般具有很強(qiáng)脂溶性和疏水性的物質(zhì)根據(jù)物質(zhì)的溶解性即可通過(guò)細(xì)胞膜[25]。跨上皮細(xì)胞間隙途徑主要指細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，肽類物質(zhì)經(jīng)過(guò)上皮細(xì)胞緊密連接的間隙被人體吸收[26]。實(shí)驗(yàn)選用肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑Gly-Pro、內(nèi)吞抑制劑Wortmannin和旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑去氧膽酸鈉研究ACE抑制肽LL的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，結(jié)果見(jiàn)圖5。Gly-Pro可極其顯著地促進(jìn)LL的小腸吸收（P＜0.01），PepT1是二肽和三肽的特定轉(zhuǎn)運(yùn)載體[27]，如果LL吸收受載體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，Gly-Pro會(huì)和LL競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體，從而減少LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相反，說(shuō)明LL的吸收機(jī)制不是PepT1載體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；去氧膽酸鈉屬于膽酸鹽類的吸收促進(jìn)劑，溶解磷脂的能力較高，具有增強(qiáng)旁路轉(zhuǎn)運(yùn)能力[28]。但去氧膽酸鈉對(duì)LL吸收作用不顯著（P＞0.05），表明LL吸收的主要方式不是旁路轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)吞抑制劑Wortmannin具有抑制藥物跨細(xì)胞過(guò)程中的內(nèi)吞作用，會(huì)抑制肽的吸收，本實(shí)驗(yàn)顯示肽吸收顯著減少，推測(cè)LL的吸收機(jī)制可能為內(nèi)吞作用。Shimizu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，肽的內(nèi)吞作用依賴肽的疏水性，肽的疏水性越強(qiáng)，越有可能通過(guò)內(nèi)吞作用被小腸吸收。祝倩[24]報(bào)道了ACE抑制肽VPP和IPP的GRAVY分別為0.33、0.43，VPP、IPP的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑為旁路轉(zhuǎn)運(yùn)。LL的GRAVY為3.8，疏水性很強(qiáng)，有可能通過(guò)內(nèi)吞作用被小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.4 LL的外排研究

圖6 維拉帕米、MK-571和疊氮化鈉對(duì)LL轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig. 6 Effect of verapamil , MK-571 and sodium azideon on the transepithelial transport of LL across Caco-2 cell monolayer

Caco-2細(xì)胞AP側(cè)存在兩種主要的外排蛋白，P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白（multi-drug resistant protein，MRP），其主要功能是把細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)排到細(xì)胞外，不利于細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，并且這兩種外排蛋白需要消耗能量[30]。維拉帕米是P-糖蛋白抑制劑，MK-571特異性抑制MRP的外排，實(shí)驗(yàn)中添加抑制劑，限制兩種外排蛋白的外排作用，會(huì)提高LL在BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)量。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，如圖6所示，加入MK-571和維拉帕米后，BL側(cè)LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量減少，說(shuō)明LL的外排與P-糖蛋白和MRP兩種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無(wú)關(guān)。疊氮化鈉是能量抑制劑，可以非特異性地抑制細(xì)胞能量代謝[31]，如果LL有能量依賴的外排蛋白參與外排作用，加入疊氮化鈉后，將增加BL側(cè)LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量，但圖6顯示加入疊氮化鈉后BL側(cè)LL的轉(zhuǎn)運(yùn)量極顯著減少（P＜0.01），說(shuō)明LL并沒(méi)有外排蛋白參與的外排作用，這也可以說(shuō)明為何LL的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)量較高。ACE抑制肽VPP的外排機(jī)制為P-糖蛋白介導(dǎo)，IPP可能存在外排作用[24]，但是具體機(jī)制還不了解，LL沒(méi)有外排作用的原因也還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了Caco-2細(xì)胞模型，對(duì)ACE抑制肽LL、LPEW小腸吸收機(jī)制進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽LL的Papp為（275.17±8.28）× 10－7cm/s，小腸吸收良好，ACE抑制肽LPEW的Papp為（5.13±1.49）×10－7cm/s，小腸吸收中等；不同的ACE抑制肽腸道轉(zhuǎn)運(yùn)量不同，可能與其肽鏈長(zhǎng)度及親疏水性有關(guān)，肽鏈長(zhǎng)度小，強(qiáng)疏水性多肽，如ACE抑制肽LL的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)量較高；對(duì)LL的腸道吸收機(jī)制和外排機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)LL的腸道吸收機(jī)制可能為內(nèi)吞機(jī)制，并且無(wú)外排作用。

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Intestinal Absorption of Milk-Derived ACE Inhibitory Peptides LL and LPEW Using Caco-2 Cell Model

GAO Jinjin1, GUO Yuxing1,*, PAN Daodong1,2
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Caco-2 cell model was established and verified to analyze the transport capacity of ACE inhibitory peptides LL and LPEW and to explore their transport mechanism across intestinal epithelial cells. Morphology, transepithelial electrical resistance and alkaline phosphatase activity were measured to verify the validity of the Caco-2 cell model. Apparent permeability coefficient (Papp) of LL and LPEW were (275.17 ± 8.28) × 10-7and (5.13 ± 1.49) × 10-7cm/s, respectively in Caco-2 transport experiments, suggesting that LL displayed much better intestinal absorption than LPEW. The transportation route of LL may be endocytosis, as demonstrated by comparing the transport capacity of LL with and without transport inhibitors including the paracellular transport accelerator sodium deoxycholate, the endocytosis inhibitor Wortmannin, and the competitive inhibitor of the peptide transports Gly-Pro. LL had no efflux activity, as suggested by comparing the transport capacity with and without efflux inhibitor including the P-glycoprotein inhibitor verapamil, the multidrug resistance protein inhibitor MK-571, and the ATPase inhibitor sodium azide. In conclusion, LL showed good intestinal absorption. Key words: angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides; Caco-2 cell model; intestinal absorption

10.7506/spkx1002-6630-201711034

TS252.1

A

1002-6630（2017）11-0214-06引文格式：

2016-04-27

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20151544；BK20141447）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571852；31471598）

高錦錦（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：1533140040@qq.com

*通信作者：郭宇星（1981—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：guoyuxing1981@163.com