劉 普，鄧瑞雪，高嘉嶼，孫鮮明，尹衛(wèi)平

（河南科技大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

·實(shí)驗(yàn)教學(xué)·

高效液相色譜法測(cè)定多組分樣品的實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討

劉 普，鄧瑞雪，高嘉嶼，孫鮮明，尹衛(wèi)平

（河南科技大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

高效液相色譜法是天然有機(jī)化合物定性定量分析測(cè)試的重要手段。該文探討建立一種采用RP－HPLC同時(shí)測(cè)定丹皮中幾種單萜苷類(lèi)化合物含量的方法。研究確定了HPLC法分離和測(cè)定的色譜條件，包括色譜柱、流動(dòng)相、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等。該實(shí)驗(yàn)為課題組實(shí)際研究過(guò)程中多組分樣品的分析，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用流動(dòng)相梯度洗脫和測(cè)試波長(zhǎng)變換測(cè)試的方法，實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)涵蓋了高效液相色譜法測(cè)試中的主要知識(shí)點(diǎn)。實(shí)踐表明，通過(guò)實(shí)驗(yàn)提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，鍛煉了動(dòng)手能力。

高效液相色譜；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；波長(zhǎng)變換；外標(biāo)法

高效液相色譜法（high performance liquid chro matography，HPLC）是現(xiàn)代研究中一種重要的分離分析手段。高效液相色譜是有機(jī)化合物快速高效分離分析的重要手段，具有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)［1－5］。目前，高效液相色譜已在食品檢驗(yàn)、中藥質(zhì)量控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物工業(yè)、制藥工業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為現(xiàn)代自然科學(xué)研究中必不可少的常規(guī)儀器［6－7］。作為一種常見(jiàn)的分析測(cè)試手段，高效液相色譜法是儀器分析課程和現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)課程中一個(gè)非常重要的教學(xué)內(nèi)容，掌握高效液相色譜的儀器工作原理及基本操作方法是很多專(zhuān)業(yè)學(xué)生必須掌握的基本技能［8－9］。

高效液相色譜法測(cè)定多組分樣品實(shí)驗(yàn)為我?；瘜W(xué)工程與工藝專(zhuān)業(yè)、有機(jī)化學(xué)專(zhuān)業(yè)和藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)研究生課程現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)中的一個(gè)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)的主要目的是訓(xùn)練學(xué)生進(jìn)一步掌握高效液相色譜基本工作原理及操作方法，掌握采用梯度洗脫、波長(zhǎng)變換及外標(biāo)法測(cè)定多組分有機(jī)化合物含量的方法。我校的研究生在本科階段時(shí)已經(jīng)學(xué)習(xí)了分析化學(xué)、儀器分析和天然產(chǎn)物化工等課程，對(duì)采用HPLC測(cè)試單組分天然產(chǎn)物樣品的方法已經(jīng)有了掌握。

由于科研工作的需要，作者所在的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)一些天然植物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，并探索了采用HPLC測(cè)試多組分化合物的方法，并將其整理為研究生現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)［10－12］。本實(shí)驗(yàn)擬在本科階段分析化學(xué)和儀器分析課程實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，借助研究生的現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)課程和學(xué)院分析測(cè)試中心實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)，在前期科研積累的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了采用高效液相色譜測(cè)試多組分樣品的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)一步掌握復(fù)雜樣品的處理方法、波長(zhǎng)變換、梯度洗脫及采用外標(biāo)法計(jì)算多組分含量等方法。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

熟練掌握利用高效液相色譜儀的波長(zhǎng)變換和梯度洗脫的方法來(lái)進(jìn)行定性和定量分析的原理及方法；熟悉外標(biāo)法測(cè)試多組分樣品含量的原理及方法。

1.2 高效液相色譜原理

高效液相色譜分析原理是基于待測(cè)組分在固定相和流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)或其他親和作用的差異進(jìn)行分離，進(jìn)而進(jìn)行定性和定量分析測(cè)定。高效液相色譜儀器主要由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成［1］。

外標(biāo)法是以待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品作為對(duì)照物質(zhì)，相對(duì)比較以求得供試品中相對(duì)應(yīng)化合物含量的方法。外標(biāo)法首先用待測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品通過(guò)高效液相色譜分析，測(cè)出已知不同含量的標(biāo)樣系列中各峰所對(duì)應(yīng)的峰高或峰面積，然后根據(jù)響應(yīng)信號(hào)與含量之間的關(guān)系，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量分析樣品時(shí)，在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下進(jìn)同等樣量的待測(cè)樣品，從高效液相色譜圖上測(cè)出峰高或峰面積，再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線查出待分析組分所對(duì)應(yīng)的濃度，進(jìn)而根據(jù)待測(cè)樣品的質(zhì)量和濃度計(jì)算待測(cè)組分的含量［1－5］。

1.3 儀器和試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（配備：四元泵、二極管陣列檢測(cè)器（G1313A）、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和Agilent1100色譜工作站）：安捷倫科技公司；FA2004型電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；UV－2600紫外光譜儀：島津儀器（蘇州）有限公司。

4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、paeonidanin和白芍苷R1等標(biāo)準(zhǔn)品由河南科技大學(xué)天然產(chǎn)物研究室自制，每個(gè)對(duì)照品的結(jié)構(gòu)均經(jīng)NMR和ESI－MS波譜數(shù)據(jù)對(duì)比鑒定，化合物的純度經(jīng)HPLC測(cè)定均大于98。丹皮購(gòu)置于洛陽(yáng)寶神鹿大藥房有限公司九都路店。

配置流動(dòng)相所用的乙腈和磷酸二氫鉀均為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制的高純水，其他研究所用到的有機(jī)試劑均為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備

用分析天平分別精密稱(chēng)取一定質(zhì)量的對(duì)照品，加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。所稱(chēng)取的對(duì)照品的質(zhì)量及配置的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度如表1所示。

表1 6種單萜苷對(duì)照品的質(zhì)量及在配置對(duì)照品濃度

1.4.2 吸收波長(zhǎng)的選擇

稱(chēng)取一定量的各個(gè)對(duì)照品，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中。采用可見(jiàn)紫外可見(jiàn)光譜儀對(duì)制備的各個(gè)對(duì)照品在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，用甲醇作空白對(duì)照，記錄各個(gè)化合物的最大吸收波長(zhǎng)。

1.4.3 流動(dòng)相的選擇

分析文獻(xiàn)［13－15］報(bào)道發(fā)現(xiàn)在分離分析芍藥苷等單萜苷類(lèi)化合物所采用的一般為乙腈的磷酸水流動(dòng)相體系。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)并進(jìn)行初步嘗試的基礎(chǔ)上也選擇乙腈－水流動(dòng)相體系來(lái)分析，并對(duì)流動(dòng)相體系進(jìn)行了優(yōu)化。在研究中發(fā)現(xiàn)，僅僅乙腈－磷酸水體系難以實(shí)現(xiàn)對(duì)4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩種單萜苷的分離。在課題組前期糖苷類(lèi)分離分析方法［16］的基礎(chǔ)上，在乙腈－水流動(dòng)相體系中引入了磷酸二氫鉀緩沖鹽，并對(duì)該分離流動(dòng)相體系進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇了pH＝3.0的磷酸二氫鉀緩沖鹽與乙腈混合作為本研究的流動(dòng)相體系。

1.4.4 供試品溶液的制備

將購(gòu)買(mǎi)的待測(cè)樣品丹皮放置在溫度為100℃干燥箱中干燥3小時(shí)。將烘干后的丹皮置于干燥器中冷卻至室溫，用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，備用。

精密稱(chēng)取丹皮樣品3份，每份10.00 g。將樣品分別用濾紙包好，置于索氏提取器中，各加入100 mL溶劑，回流提取4小時(shí)?；厥崭魈崛∫?，冷卻，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，濾液定容于100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

在實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程中，提供學(xué)生選擇的甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等作為提取溶劑。選擇的提取方法有：索氏提取器、超聲提取器、回流提取和冷浸提取等多種不同的提取方式。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中學(xué)生可以自由選擇提取溶劑和方法。

1.4.5 線性關(guān)系的考查

精密吸取步驟（1）中配置混合對(duì)照品溶液1 mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇定容。然后精密吸取0.75、1.5、3、6、12μL混合對(duì)照品注入高效液相色譜儀，按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積。以每一個(gè)對(duì)照品的進(jìn)樣量x為橫坐標(biāo)，色譜峰的峰面積y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制每個(gè)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 吸收波長(zhǎng)

采用紫外可見(jiàn)光譜儀在波長(zhǎng)200～400 nm間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以確定各個(gè)單萜苷的最大吸收波長(zhǎng)，從而確定合適的檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)。在對(duì)各個(gè)單萜苷類(lèi)化合物對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描中發(fā)現(xiàn)，4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩個(gè)單萜苷在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，而單萜苷白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin、白芍苷R1等在232 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。所以在測(cè)定4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩個(gè)單萜苷時(shí)選擇260 nm波長(zhǎng)，在測(cè)試白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin、白芍苷R1等4個(gè)單萜苷時(shí)選擇232 nm的測(cè)定波長(zhǎng)。所以本實(shí)驗(yàn)采用變波長(zhǎng)的測(cè)定方法，根據(jù)在實(shí)驗(yàn)中確定的各個(gè)單萜苷類(lèi)化合物的保留時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)在0～7.5 min時(shí)間段內(nèi)的檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，在7.5～22 min時(shí)間段內(nèi)的檢測(cè)波長(zhǎng)為232 nm。

2.1.2 流動(dòng)相

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)單萜苷類(lèi)化合物的分離流動(dòng)相體系進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇pH＝3.0磷酸二氫鉀緩沖鹽－乙腈體系為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相體系。流動(dòng)相的洗脫條件為：采用梯度洗脫，梯度為0 min（乙腈，15）→10 min（乙腈，15）→22 min（乙腈，25）。在優(yōu)化的條件下，每個(gè)單萜苷類(lèi)化合物都得到很好的分離，并且縮短了分析時(shí)間（22 min），節(jié)約了流動(dòng)相的用量。

2.1.3 色譜條件

通過(guò)一系列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到分析丹皮中單萜苷類(lèi)化合物的色譜條件為：Agilent1100高效液相色譜儀；Zorbax SB－Aq C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）色譜柱；乙腈－磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH＝3.0）為分析流動(dòng)相體系；流動(dòng)相洗脫梯度為：0 min（乙腈，15）→10 min（乙腈15）→22 min（乙腈，25）；檢測(cè)波長(zhǎng)為：（0～7.5 min）260 nm，（7.5～22 min）232 nm；體積流量為1.0 mL·min－1；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL。

2.2 色譜圖

取混合對(duì)照品溶液和供試樣品溶液稀釋到適當(dāng)濃度進(jìn)行HPLC分析，對(duì)照品色譜圖（A）和供試品色譜圖（B）如圖1所示。測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈－磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH＝3.0），洗脫梯度為0 min（A，15）→10 min（A，15）→22 min（A，25），流速為1.0 mL／min時(shí)，6種單萜苷類(lèi)化合物對(duì)照品的分離效果較好。從峰形可以看出，得到的峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，無(wú)前伸或拖尾現(xiàn)象，基線平穩(wěn)，屬于大信噪比的窄峰，這樣的峰形有利于保證定性、定量的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。從保留時(shí)間看，所有樣品在20分鐘內(nèi)均實(shí)現(xiàn)較好的分離，6種單萜苷的保留時(shí)間分別為：4″－羥基白芍苷5.289 min，氧化芍藥苷5.637 min，白芍苷8.699 min，芍藥苷9.766 min，Paeonidanin17.794 min，白芍苷R1為19.113 min，分析時(shí)間短，有利于樣品的快速檢測(cè)。從分離度上看，所有的樣品均實(shí)現(xiàn)了很好的分離。供試品和對(duì)照品色譜圖比較可以看出，供試品色譜圖中具有和對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，雖然由于供試品成分復(fù)雜，其中含有多個(gè)色譜峰，但從圖1中可以看出其他成分色譜峰與待測(cè)成分之間分離效果良好，待測(cè)成分沒(méi)有明顯地受到其他樣品峰的干擾。說(shuō)明該條件可以實(shí)現(xiàn)對(duì)6種單萜苷類(lèi)化合物的分析。在采用HPLC分析測(cè)試樣品時(shí)，待測(cè)組分之間的良好分離度、峰形和較短的保留時(shí)間，以及其他成分對(duì)待測(cè)組分的干擾都是必須要考慮的問(wèn)題，這些問(wèn)題也決定了流動(dòng)相，洗脫梯度和洗脫流速等色譜條件的選擇。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取混合對(duì)照品溶液1mL，加入到10mL容量瓶中，加入甲醇定容。然后用自動(dòng)進(jìn)樣器吸取0.75、1.5、3、6、12μL對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，按照2.1.3節(jié)的色譜條件進(jìn)行分析，記錄保留時(shí)間和峰面積。以樣品的進(jìn)樣量x為橫坐標(biāo)，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的峰面積y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到6種單萜苷類(lèi)化合物的線性回歸方程（如表2所示）。4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等6個(gè)單萜苷樣品線性回歸方程的R值在0.999 64～1.000 00之間，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合函數(shù)之間的吻合程度非常好，6個(gè)單萜苷樣品在各自的線性范圍內(nèi)顯示了很好的線性關(guān)系。說(shuō)明在該范圍內(nèi)可以準(zhǔn)確地測(cè)定這6種單萜苷類(lèi)化合物的含量。

圖1 對(duì)照品（A）和樣品的色譜圖（B）

表2 6種單萜苷對(duì)照品的線性關(guān)系

2.4 方法學(xué)考查

2.4.1 精密度試驗(yàn)

按上述優(yōu)化的色譜條件，將對(duì)照品混合物溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次的峰面積，分別計(jì)算6種單萜苷類(lèi)化合物4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等峰面積的RSD值。測(cè)試結(jié)果表明峰面積的RSD值均小于1，表明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，配制后分別放置0、2、4、8、12、24、48 h后進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣測(cè)定的峰面積。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等6個(gè)單萜苷類(lèi)化合物峰面積的RSD值均小于1.5，表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)試的供試品溶液在48 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取丹皮粉末5份，每份10 g，按照1.4.4節(jié)方法操作，制備所需供試品溶液，測(cè)定4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1的含量，計(jì)算各組分含量平均值分別為0.013，0.32，0.21，1.05，0.000 4，0.008 5；RSD分別為1.05，1.12，1.07，0.87，0.96，1.56。

2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已經(jīng)準(zhǔn)確測(cè)得含量的丹皮樣品粉末9份，每份10.00 g，3份為一組，分別精密加入一定量的4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1對(duì)照品（加入量約相當(dāng)于樣品中各對(duì)照品樣品含量的80，100，120），加入10 mL乙醇，按照1.4項(xiàng)下供試品的制備方法操作，制備所需供試品溶液。然后往高效液相色譜中注入10 mL供試品進(jìn)行分析，根據(jù)峰面積測(cè)定供試品中6種單萜苷類(lèi)組分的含量并計(jì)算每個(gè)單萜苷對(duì)照樣品的加樣回收率。測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等單萜苷的平均加樣回收率在97.1～101.3之間，RSD在0.15～1.3之間。

2.5 丹皮中主要單萜苷類(lèi)化合物的含量

按上述方法將經(jīng)過(guò)烘干的丹皮高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩。按照1.4.4節(jié)供試品溶液制備方法進(jìn)行提取并配置溶液，然后精密吸取供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀中，按照優(yōu)化的色譜條件分別測(cè)定，根據(jù)每個(gè)對(duì)照品的線性回歸方程，采用外標(biāo)法計(jì)算丹皮中6種單萜苷類(lèi)化合物的含量，測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果／（n＝5，x±s）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果／（n＝5，x±s）

成分4″－羥基白芍苷芍藥R1含量氧化芍藥苷白芍苷苷Paeonidanin白芍苷0.013 0.21 0.35 1.05 0.000 4 0.008 5

3 實(shí)驗(yàn)效果與討論

1）該實(shí)驗(yàn)是我?；瘜W(xué)工藝與技術(shù)專(zhuān)業(yè)、有機(jī)化學(xué)專(zhuān)業(yè)和藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)研究生學(xué)位課程現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)中開(kāi)設(shè)的綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)的實(shí)施，使研究生對(duì)采用高效液相色譜進(jìn)行定性和定量分析有了更為深刻的認(rèn)識(shí)和掌握，分析測(cè)試的結(jié)果可以作為天然產(chǎn)物提取及純化工藝是否合適的一個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2）不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的化合物的性質(zhì)不同，在進(jìn)行提取時(shí)選擇的提取溶劑及提取方式可能有所不同。在本實(shí)驗(yàn)中特意設(shè)置了不同的溶劑及不同的提取方法供學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中選擇。由老師事先提取并計(jì)算出原料丹皮中這幾種單萜苷類(lèi)化合物的含量，然后讓同學(xué)們比較不同提取方法的收率及主要成分的含量，并計(jì)算主要單萜苷類(lèi)化合物的提取率。實(shí)驗(yàn)完成后，可以指導(dǎo)學(xué)生通過(guò)檢索文獻(xiàn)資料，分析討論不同的提取方法和不同的溶劑對(duì)單萜苷提取率影響的原因。

3）同樣是單萜苷類(lèi)化合物，不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)其紫外光譜的最大吸收波長(zhǎng)不同。在本實(shí)驗(yàn)中4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩個(gè)化合物在260 nm波長(zhǎng)處吸收最強(qiáng)，白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等4個(gè)單萜苷類(lèi)化合物在測(cè)定波長(zhǎng)為232 nm處有最大吸收。指導(dǎo)學(xué)生根據(jù)紫外測(cè)試結(jié)果，結(jié)合現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)課程中的知識(shí)分析單萜苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)與紫外光譜最大吸收波長(zhǎng)的關(guān)系。由于母核結(jié)構(gòu)的微小差異及取代基的不同，在色譜系統(tǒng)中表現(xiàn)出不同的吸附性能，在高效液相色譜上會(huì)有不同的保留時(shí)間。梯度洗脫是天然產(chǎn)物分析測(cè)試中常用的一種洗脫方法。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)施過(guò)程中為了節(jié)省時(shí)間，進(jìn)行了梯度洗脫，達(dá)到了較好的分離效果，使學(xué)生認(rèn)識(shí)到采用梯度洗脫，不僅可以獲得較好的分析效果，還可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和洗脫溶劑的用量。

4）丹皮為牡丹干燥根皮，秋季采挖根部，除去細(xì)根，剝?nèi)「?，曬干。丹皮中含有單萜苷?lèi)化合物，如芍藥甙等，這些單萜苷主要為芍藥苷元及其類(lèi)似物與葡萄糖縮合而成的化合物，具有非常廣泛的生物活性。我們將本實(shí)驗(yàn)科研內(nèi)容引入到研究生高效液相色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，制定了外標(biāo)法測(cè)定丹皮中6種單萜苷類(lèi)化合物含量的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。該實(shí)驗(yàn)HPLC檢測(cè)過(guò)程中，6種單萜苷類(lèi)成分分離度好，保留時(shí)間相對(duì)較短。在實(shí)驗(yàn)中采用波長(zhǎng)變換和梯度洗脫，知識(shí)點(diǎn)多，適合于研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，學(xué)生可以進(jìn)一步深入掌握HPLC測(cè)試的原理和方法。

4 結(jié)束語(yǔ)

現(xiàn)代分析儀器和計(jì)算機(jī)的聯(lián)用極大提高了儀器的智能化、自動(dòng)化的程度，工作站的功能越來(lái)越強(qiáng)大，高效液相色譜的應(yīng)用領(lǐng)域愈來(lái)愈廣泛。對(duì)于采用高效液相色譜進(jìn)行多組分樣品的分析測(cè)試，選擇合適的分析測(cè)試條件，建立完整的分析測(cè)試方法是一件比較困難的事情，需要經(jīng)過(guò)不斷地實(shí)驗(yàn)探索來(lái)完成［3］。

對(duì)于研究生來(lái)說(shuō)，由于接觸到的知識(shí)比本科生要更多一些，動(dòng)手能力和自學(xué)能力要更強(qiáng)一些。一些相對(duì)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已經(jīng)不能調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，需要設(shè)計(jì)一些更具挑戰(zhàn)性的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)由科研成果轉(zhuǎn)化而來(lái)，屬于教學(xué)與科研相結(jié)合、理論與應(yīng)用相結(jié)合的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)信息量大，涵蓋了高效液相色譜法中多個(gè)知識(shí)點(diǎn)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高了學(xué)生的動(dòng)手能力、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

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Experimental Teaching of HPLC w ith UV Sw itch Simultaneous Determ ination of M ulticom ponent Contents

LIU Pu，DENG Ruixue，GAO Jiayu，SUN Xianming，YINWeiping
（Chemical Engineering＆pharmaceutical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）method is one of the importantmethods for native compounds analy sis.This paper establishes an HPLC method for simultaneous determination of six monoterpene glycosides.Chromatographic condition was optimized，which included column，mobile phase，flow rate，detection wavelength.The experiment is amulticomponent analysis in the actual research process of the research group.The research process includes the gradient elusion and the various wavelength test.The design of the experimental scheme covers the main knowledge points of high performance liquid chromatographic test.The practice shows the students interest in learning and the ability of practicing are all improved through the experiment.

HPLC；experimental teaching；wavelength conversion；external standard method

O 657.7＋2；G 642.423

A

10.3969／j．issn．1672－4550.2017.03.011

2015－09－13；修改日期：2017－04－17

河南科技大學(xué)研究生精品課程建設(shè)項(xiàng)目（2015YJG－025）；河南省教育技術(shù)裝備和實(shí)踐教育研究立項(xiàng)課題（GZS357）；河南省化學(xué)工程與工藝特色專(zhuān)業(yè)建設(shè)項(xiàng)目（201015218）。

劉普（1978－），男，博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物分離分析的研究教學(xué)工作。

鄧瑞雪（1978－），副教授，dengliu20022002＠163.com