劉 普，鄧瑞雪，高嘉嶼，孫鮮明，尹衛(wèi)平

（河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽 471023）

·實驗教學·

高效液相色譜法測定多組分樣品的實驗教學探討

劉 普，鄧瑞雪，高嘉嶼，孫鮮明，尹衛(wèi)平

（河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽 471023）

高效液相色譜法是天然有機化合物定性定量分析測試的重要手段。該文探討建立一種采用RP－HPLC同時測定丹皮中幾種單萜苷類化合物含量的方法。研究確定了HPLC法分離和測定的色譜條件，包括色譜柱、流動相、流速、檢測波長等。該實驗為課題組實際研究過程中多組分樣品的分析，實驗過程中采用流動相梯度洗脫和測試波長變換測試的方法，實驗方案的設計涵蓋了高效液相色譜法測試中的主要知識點。實踐表明，通過實驗提高了學生的學習興趣，鍛煉了動手能力。

高效液相色譜；實驗教學；波長變換；外標法

高效液相色譜法（high performance liquid chro matography，HPLC）是現代研究中一種重要的分離分析手段。高效液相色譜是有機化合物快速高效分離分析的重要手段，具有其他方法所不具備的優(yōu)點［1－5］。目前，高效液相色譜已在食品檢驗、中藥質量控制、環(huán)境監(jiān)測、生物工業(yè)、制藥工業(yè)等科學領域得到廣泛應用，成為現代自然科學研究中必不可少的常規(guī)儀器［6－7］。作為一種常見的分析測試手段，高效液相色譜法是儀器分析課程和現代分析測試技術課程中一個非常重要的教學內容，掌握高效液相色譜的儀器工作原理及基本操作方法是很多專業(yè)學生必須掌握的基本技能［8－9］。

高效液相色譜法測定多組分樣品實驗為我?；瘜W工程與工藝專業(yè)、有機化學專業(yè)和藥理學專業(yè)研究生課程現代分析測試技術中的一個綜合設計性實驗。該實驗的主要目的是訓練學生進一步掌握高效液相色譜基本工作原理及操作方法，掌握采用梯度洗脫、波長變換及外標法測定多組分有機化合物含量的方法。我校的研究生在本科階段時已經學習了分析化學、儀器分析和天然產物化工等課程，對采用HPLC測試單組分天然產物樣品的方法已經有了掌握。

由于科研工作的需要，作者所在的研究團隊對一些天然植物進行了化學成分的研究，并探索了采用HPLC測試多組分化合物的方法，并將其整理為研究生現代分析測試技術綜合設計性實驗［10－12］。本實驗擬在本科階段分析化學和儀器分析課程實驗的基礎上，借助研究生的現代分析測試技術課程和學院分析測試中心實驗教學平臺，在前期科研積累的基礎上，設計了采用高效液相色譜測試多組分樣品的綜合設計性實驗，指導學生進一步掌握復雜樣品的處理方法、波長變換、梯度洗脫及采用外標法計算多組分含量等方法。

1 實驗內容

1.1 實驗目的

熟練掌握利用高效液相色譜儀的波長變換和梯度洗脫的方法來進行定性和定量分析的原理及方法；熟悉外標法測試多組分樣品含量的原理及方法。

1.2 高效液相色譜原理

高效液相色譜分析原理是基于待測組分在固定相和流動相中的吸附能力、分配系數或其他親和作用的差異進行分離，進而進行定性和定量分析測定。高效液相色譜儀器主要由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數據處理系統(tǒng)等組成［1］。

外標法是以待測成分的標準對照品作為對照物質，相對比較以求得供試品中相對應化合物含量的方法。外標法首先用待測組分的標準樣品通過高效液相色譜分析，測出已知不同含量的標樣系列中各峰所對應的峰高或峰面積，然后根據響應信號與含量之間的關系，繪制出標準曲線。定量分析樣品時，在與標準曲線相同條件下進同等樣量的待測樣品，從高效液相色譜圖上測出峰高或峰面積，再從標準曲線查出待分析組分所對應的濃度，進而根據待測樣品的質量和濃度計算待測組分的含量［1－5］。

1.3 儀器和試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（配備：四元泵、二極管陣列檢測器（G1313A）、在線脫氣機、柱溫箱、自動進樣器和Agilent1100色譜工作站）：安捷倫科技公司；FA2004型電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司；UV－2600紫外光譜儀：島津儀器（蘇州）有限公司。

4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、paeonidanin和白芍苷R1等標準品由河南科技大學天然產物研究室自制，每個對照品的結構均經NMR和ESI－MS波譜數據對比鑒定，化合物的純度經HPLC測定均大于98。丹皮購置于洛陽寶神鹿大藥房有限公司九都路店。

配置流動相所用的乙腈和磷酸二氫鉀均為色譜純，水為實驗室自制的高純水，其他研究所用到的有機試劑均為分析純。

1.4 實驗步驟

1.4.1 對照品溶液的制備

用分析天平分別精密稱取一定質量的對照品，加適量甲醇溶解，轉移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。所稱取的對照品的質量及配置的標準溶液濃度如表1所示。

表1 6種單萜苷對照品的質量及在配置對照品濃度

1.4.2 吸收波長的選擇

稱取一定量的各個對照品，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中。采用可見紫外可見光譜儀對制備的各個對照品在200～400 nm進行全波長掃描，用甲醇作空白對照，記錄各個化合物的最大吸收波長。

1.4.3 流動相的選擇

分析文獻［13－15］報道發(fā)現在分離分析芍藥苷等單萜苷類化合物所采用的一般為乙腈的磷酸水流動相體系。本實驗根據參考文獻并進行初步嘗試的基礎上也選擇乙腈－水流動相體系來分析，并對流動相體系進行了優(yōu)化。在研究中發(fā)現，僅僅乙腈－磷酸水體系難以實現對4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩種單萜苷的分離。在課題組前期糖苷類分離分析方法［16］的基礎上，在乙腈－水流動相體系中引入了磷酸二氫鉀緩沖鹽，并對該分離流動相體系進行了優(yōu)化，最終選擇了pH＝3.0的磷酸二氫鉀緩沖鹽與乙腈混合作為本研究的流動相體系。

1.4.4 供試品溶液的制備

將購買的待測樣品丹皮放置在溫度為100℃干燥箱中干燥3小時。將烘干后的丹皮置于干燥器中冷卻至室溫，用高速粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

精密稱取丹皮樣品3份，每份10.00 g。將樣品分別用濾紙包好，置于索氏提取器中，各加入100 mL溶劑，回流提取4小時?；厥崭魈崛∫?，冷卻，用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液定容于100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

在實驗實施過程中，提供學生選擇的甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等作為提取溶劑。選擇的提取方法有：索氏提取器、超聲提取器、回流提取和冷浸提取等多種不同的提取方式。在實驗過程中學生可以自由選擇提取溶劑和方法。

1.4.5 線性關系的考查

精密吸取步驟（1）中配置混合對照品溶液1 mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇定容。然后精密吸取0.75、1.5、3、6、12μL混合對照品注入高效液相色譜儀，按照實驗優(yōu)化的色譜條件進行測定，記錄保留時間和峰面積。以每一個對照品的進樣量x為橫坐標，色譜峰的峰面積y為縱坐標進行線性回歸，繪制每個對照品的標準曲線。

2 實驗結果

2.1 色譜條件

2.1.1 吸收波長

采用紫外可見光譜儀在波長200～400 nm間進行全波長掃描，以確定各個單萜苷的最大吸收波長，從而確定合適的檢測器檢測波長。在對各個單萜苷類化合物對照品進行全波長掃描中發(fā)現，4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩個單萜苷在260 nm波長處有最大吸收，而單萜苷白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin、白芍苷R1等在232 nm波長處有最大吸收。所以在測定4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩個單萜苷時選擇260 nm波長，在測試白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin、白芍苷R1等4個單萜苷時選擇232 nm的測定波長。所以本實驗采用變波長的測定方法，根據在實驗中確定的各個單萜苷類化合物的保留時間，本實驗在0～7.5 min時間段內的檢測波長為260 nm，在7.5～22 min時間段內的檢測波長為232 nm。

2.1.2 流動相

在實驗過程中對單萜苷類化合物的分離流動相體系進行了優(yōu)化，最終選擇pH＝3.0磷酸二氫鉀緩沖鹽－乙腈體系為本實驗的流動相體系。流動相的洗脫條件為：采用梯度洗脫，梯度為0 min（乙腈，15）→10 min（乙腈，15）→22 min（乙腈，25）。在優(yōu)化的條件下，每個單萜苷類化合物都得到很好的分離，并且縮短了分析時間（22 min），節(jié)約了流動相的用量。

2.1.3 色譜條件

通過一系列的優(yōu)化實驗，得到分析丹皮中單萜苷類化合物的色譜條件為：Agilent1100高效液相色譜儀；Zorbax SB－Aq C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）色譜柱；乙腈－磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH＝3.0）為分析流動相體系；流動相洗脫梯度為：0 min（乙腈，15）→10 min（乙腈15）→22 min（乙腈，25）；檢測波長為：（0～7.5 min）260 nm，（7.5～22 min）232 nm；體積流量為1.0 mL·min－1；柱溫為30℃；進樣量為10μL。

2.2 色譜圖

取混合對照品溶液和供試樣品溶液稀釋到適當濃度進行HPLC分析，對照品色譜圖（A）和供試品色譜圖（B）如圖1所示。測試結果表明，當流動相為乙腈－磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH＝3.0），洗脫梯度為0 min（A，15）→10 min（A，15）→22 min（A，25），流速為1.0 mL／min時，6種單萜苷類化合物對照品的分離效果較好。從峰形可以看出，得到的峰形尖銳、對稱，無前伸或拖尾現象，基線平穩(wěn)，屬于大信噪比的窄峰，這樣的峰形有利于保證定性、定量的準確性和重現性。從保留時間看，所有樣品在20分鐘內均實現較好的分離，6種單萜苷的保留時間分別為：4″－羥基白芍苷5.289 min，氧化芍藥苷5.637 min，白芍苷8.699 min，芍藥苷9.766 min，Paeonidanin17.794 min，白芍苷R1為19.113 min，分析時間短，有利于樣品的快速檢測。從分離度上看，所有的樣品均實現了很好的分離。供試品和對照品色譜圖比較可以看出，供試品色譜圖中具有和對照品保留時間一致的色譜峰，雖然由于供試品成分復雜，其中含有多個色譜峰，但從圖1中可以看出其他成分色譜峰與待測成分之間分離效果良好，待測成分沒有明顯地受到其他樣品峰的干擾。說明該條件可以實現對6種單萜苷類化合物的分析。在采用HPLC分析測試樣品時，待測組分之間的良好分離度、峰形和較短的保留時間，以及其他成分對待測組分的干擾都是必須要考慮的問題，這些問題也決定了流動相，洗脫梯度和洗脫流速等色譜條件的選擇。

2.3 標準曲線繪制

精密吸取混合對照品溶液1mL，加入到10mL容量瓶中，加入甲醇定容。然后用自動進樣器吸取0.75、1.5、3、6、12μL對照品溶液注入高效液相色譜儀，按照2.1.3節(jié)的色譜條件進行分析，記錄保留時間和峰面積。以樣品的進樣量x為橫坐標，以每個標準對照品的峰面積y為縱坐標進行線性回歸，得到6種單萜苷類化合物的線性回歸方程（如表2所示）。4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等6個單萜苷樣品線性回歸方程的R值在0.999 64～1.000 00之間，表明試驗數據與擬合函數之間的吻合程度非常好，6個單萜苷樣品在各自的線性范圍內顯示了很好的線性關系。說明在該范圍內可以準確地測定這6種單萜苷類化合物的含量。

圖1 對照品（A）和樣品的色譜圖（B）

表2 6種單萜苷對照品的線性關系

2.4 方法學考查

2.4.1 精密度試驗

按上述優(yōu)化的色譜條件，將對照品混合物溶液連續(xù)進樣6次，記錄每次的峰面積，分別計算6種單萜苷類化合物4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等峰面積的RSD值。測試結果表明峰面積的RSD值均小于1，表明實驗精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，配制后分別放置0、2、4、8、12、24、48 h后進樣，記錄每次進樣測定的峰面積。研究結果發(fā)現4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等6個單萜苷類化合物峰面積的RSD值均小于1.5，表明本實驗測試的供試品溶液在48 h內具有較好的穩(wěn)定性。

2.4.3 重復性試驗

精密稱取丹皮粉末5份，每份10 g，按照1.4.4節(jié)方法操作，制備所需供試品溶液，測定4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1的含量，計算各組分含量平均值分別為0.013，0.32，0.21，1.05，0.000 4，0.008 5；RSD分別為1.05，1.12，1.07，0.87，0.96，1.56。

2.4.4 加樣回收率實驗

精密稱取已經準確測得含量的丹皮樣品粉末9份，每份10.00 g，3份為一組，分別精密加入一定量的4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1對照品（加入量約相當于樣品中各對照品樣品含量的80，100，120），加入10 mL乙醇，按照1.4項下供試品的制備方法操作，制備所需供試品溶液。然后往高效液相色譜中注入10 mL供試品進行分析，根據峰面積測定供試品中6種單萜苷類組分的含量并計算每個單萜苷對照樣品的加樣回收率。測試結果發(fā)現4″－羥基白芍苷、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等單萜苷的平均加樣回收率在97.1～101.3之間，RSD在0.15～1.3之間。

2.5 丹皮中主要單萜苷類化合物的含量

按上述方法將經過烘干的丹皮高速粉碎機粉碎，過60目篩。按照1.4.4節(jié)供試品溶液制備方法進行提取并配置溶液，然后精密吸取供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀中，按照優(yōu)化的色譜條件分別測定，根據每個對照品的線性回歸方程，采用外標法計算丹皮中6種單萜苷類化合物的含量，測試結果如表3所示。

表3 樣品含量測定結果／（n＝5，x±s）

表3 樣品含量測定結果／（n＝5，x±s）

成分4″－羥基白芍苷芍藥R1含量氧化芍藥苷白芍苷苷Paeonidanin白芍苷0.013 0.21 0.35 1.05 0.000 4 0.008 5

3 實驗效果與討論

1）該實驗是我校化學工藝與技術專業(yè)、有機化學專業(yè)和藥理學專業(yè)研究生學位課程現代分析測試技術中開設的綜合性設計性實驗。通過該實驗的實施，使研究生對采用高效液相色譜進行定性和定量分析有了更為深刻的認識和掌握，分析測試的結果可以作為天然產物提取及純化工藝是否合適的一個判斷標準。

2）不同結構類型的化合物的性質不同，在進行提取時選擇的提取溶劑及提取方式可能有所不同。在本實驗中特意設置了不同的溶劑及不同的提取方法供學生在實驗中選擇。由老師事先提取并計算出原料丹皮中這幾種單萜苷類化合物的含量，然后讓同學們比較不同提取方法的收率及主要成分的含量，并計算主要單萜苷類化合物的提取率。實驗完成后，可以指導學生通過檢索文獻資料，分析討論不同的提取方法和不同的溶劑對單萜苷提取率影響的原因。

3）同樣是單萜苷類化合物，不同的結構特點其紫外光譜的最大吸收波長不同。在本實驗中4″－羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩個化合物在260 nm波長處吸收最強，白芍苷、芍藥苷、Paeonidanin和白芍苷R1等4個單萜苷類化合物在測定波長為232 nm處有最大吸收。指導學生根據紫外測試結果，結合現代分析測試技術課程中的知識分析單萜苷類化合物的結構與紫外光譜最大吸收波長的關系。由于母核結構的微小差異及取代基的不同，在色譜系統(tǒng)中表現出不同的吸附性能，在高效液相色譜上會有不同的保留時間。梯度洗脫是天然產物分析測試中常用的一種洗脫方法。本實驗在實施過程中為了節(jié)省時間，進行了梯度洗脫，達到了較好的分離效果，使學生認識到采用梯度洗脫，不僅可以獲得較好的分析效果，還可以節(jié)省實驗時間和洗脫溶劑的用量。

4）丹皮為牡丹干燥根皮，秋季采挖根部，除去細根，剝取根皮，曬干。丹皮中含有單萜苷類化合物，如芍藥甙等，這些單萜苷主要為芍藥苷元及其類似物與葡萄糖縮合而成的化合物，具有非常廣泛的生物活性。我們將本實驗科研內容引入到研究生高效液相色譜實驗教學中，制定了外標法測定丹皮中6種單萜苷類化合物含量的實驗項目。該實驗HPLC檢測過程中，6種單萜苷類成分分離度好，保留時間相對較短。在實驗中采用波長變換和梯度洗脫，知識點多，適合于研究生實驗教學。通過該實驗的學習，學生可以進一步深入掌握HPLC測試的原理和方法。

4 結束語

現代分析儀器和計算機的聯用極大提高了儀器的智能化、自動化的程度，工作站的功能越來越強大，高效液相色譜的應用領域愈來愈廣泛。對于采用高效液相色譜進行多組分樣品的分析測試，選擇合適的分析測試條件，建立完整的分析測試方法是一件比較困難的事情，需要經過不斷地實驗探索來完成［3］。

對于研究生來說，由于接觸到的知識比本科生要更多一些，動手能力和自學能力要更強一些。一些相對簡單的實驗設計已經不能調動學生的學習積極性，需要設計一些更具挑戰(zhàn)性的綜合設計性實驗。本實驗由科研成果轉化而來，屬于教學與科研相結合、理論與應用相結合的綜合設計性實驗，實驗信息量大，涵蓋了高效液相色譜法中多個知識點。通過本實驗的實施，激發(fā)了學生的學習興趣，提高了學生的動手能力、分析問題和解決問題的能力。

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Experimental Teaching of HPLC w ith UV Sw itch Simultaneous Determ ination of M ulticom ponent Contents

LIU Pu，DENG Ruixue，GAO Jiayu，SUN Xianming，YINWeiping
（Chemical Engineering＆pharmaceutical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）method is one of the importantmethods for native compounds analy sis.This paper establishes an HPLC method for simultaneous determination of six monoterpene glycosides.Chromatographic condition was optimized，which included column，mobile phase，flow rate，detection wavelength.The experiment is amulticomponent analysis in the actual research process of the research group.The research process includes the gradient elusion and the various wavelength test.The design of the experimental scheme covers the main knowledge points of high performance liquid chromatographic test.The practice shows the students interest in learning and the ability of practicing are all improved through the experiment.

HPLC；experimental teaching；wavelength conversion；external standard method

O 657.7＋2；G 642.423

A

10.3969／j．issn．1672－4550.2017.03.011

2015－09－13；修改日期：2017－04－17

河南科技大學研究生精品課程建設項目（2015YJG－025）；河南省教育技術裝備和實踐教育研究立項課題（GZS357）；河南省化學工程與工藝特色專業(yè)建設項目（201015218）。

劉普（1978－），男，博士，副教授，主要從事天然產物分離分析的研究教學工作。

鄧瑞雪（1978－），副教授，dengliu20022002＠163.com