王濤 ,王曉輝 ,陳衍男,楊帆,張沖,王曉

(1 .山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

白及粉末飲片質(zhì)量評價方法初步研究

王濤1,王曉輝1,陳衍男2,楊帆1,張沖1,王曉1

(1 .山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

為建立白及粉末飲片的質(zhì)量評價方法，以不同產(chǎn)地的10批次白及粉末飲片為研究對象，建立并改進了其薄層色譜鑒別方法，并采用蒽酮-硫酸法測定白及粉末飲片中的白及多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時對其顯微鑒別以及水分、總灰分和酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定進行了研究和歸納。本實驗建立的方法簡單快速、重復(fù)性好，能夠?qū)Π准胺勰╋嬈|(zhì)量進行有效、科學(xué)的評價。

白及；粉末飲片；質(zhì)量評價；多糖

中藥材白及為蘭科珍稀植物白及Bletillastriata(Thunb. ) Reiehb. f. 的干燥塊莖，廣泛分布于我國中南和西南地區(qū)，貴州產(chǎn)量最大[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白及不但具有生肌與止血等傳統(tǒng)功效[2-4]，而且在抗菌、抗癌和抗氧化等方面顯示出新的活性[5-8]。白及不只是藥用植物資源，近年來也逐漸成為生物醫(yī)學(xué)和天然食品增稠劑的重要原材料，其經(jīng)濟價值和市場前景不容忽視[9-10]。常規(guī)中藥飲片或中藥材經(jīng)粉碎制成粉末型飲片(新型中藥飲片)，提高了生物利用度以及有效成分溶出度，減小了用藥劑量，克服了傳統(tǒng)飲片煎煮、服用不便等缺點，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用[11]。

近十年來，白及的需求量增加，價格呈上升趨勢，白及中藥材以次充好、以假亂真的現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。目前相關(guān)質(zhì)量監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)的缺乏，導(dǎo)致白及粉末飲片的安全性與有效性達不到要求。為使白及粉末飲片更好地在臨床使用和推廣，建立具有針對性、可行性的質(zhì)量評價體系勢在必行。2015年版《中國藥典》[3]對白及的質(zhì)量控制僅有性狀、檢查和薄層鑒別，沒有對白及中具有藥理活性的白及多糖進行質(zhì)量控制，相關(guān)報道也較少。本研究考察了中藥白及粉末飲片的性狀、顯微特征、薄層色譜(TLC)鑒別以及水分、灰分和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定，為其地方質(zhì)量評價方法的建立以及質(zhì)量的系統(tǒng)評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

XDS-1B倒置生物顯微鏡(重慶光電有限公司)；GENESYS 10S UV-Vis紫外/可見分光光度計(賽默飛世爾科技公司)；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子爐(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；SX2-4-13馬弗爐(山東省龍口市先科儀器公司)；BSA124S型萬分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；GF254型硅膠板(青島海浪硅膠干燥劑有限公司、青島海洋化工有限公司、煙臺江友生產(chǎn)有限公司)。

白及藥材樣品來自貴州、湖南、四川、安徽4個產(chǎn)地，共10批次，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為蘭科珍稀植物白及Bletillastriata(Thunb. ) Reiehb. f.的塊莖，見表1。根據(jù)《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范(2010版)》[12]，所有樣品經(jīng)粉碎后過120目標(biāo)準(zhǔn)藥篩得到白及粉末飲片備用。

試劑：香草醛為化學(xué)純；蒽酮、D-無水葡萄糖、硫酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、甲酸乙酯、環(huán)己烷等試劑為分析純；水為蒸餾水。

表1 白及藥材樣品編號及產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微特征鑒別

本品粉末為淡黃白色；氣微，味苦，濕潤顯黏性。取少量白及粉末于載玻片上，滴加水合氯醛(取水合氯醛5.0 g，加水15.0 mL、甘油10.0 mL，溶解即得)，均勻后置酒精燈上加熱透化，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察，顯微特征如圖1。從圖1可以看出表皮細胞形狀不規(guī)則，垂周壁微波狀彎曲。草酸鈣針晶束隨處散在或成束存在于橢圓形黏液細胞中。導(dǎo)管多為螺紋，視野中清晰可見。纖維成束，硅質(zhì)塊細胞位于纖維周圍。梯紋導(dǎo)管明顯，多見。糊化淀粉粒團塊無色[13]。

1表皮細胞；2 草酸鈣針晶束；3 糊化淀粉粒團塊；4～5 纖維及含硅質(zhì)塊細胞；6 導(dǎo)管。圖1 白及粉末的顯微特征Fig.1 Microscopic characteristics of Bletilla striata powder

2.2 水分檢測

參照《中國藥典》[3]水分含量的檢測方法，制訂了白及粉末飲片水分的檢測方法和限量。稱取本品粉末約2.0 g，于105 ℃下干燥至恒重。根據(jù)減失的質(zhì)量，計算白及粉末飲片樣品中的含水量。本文對10批次白及粉末飲片水分進行了檢測，結(jié)果見表2。由表2可見，10批次白及粉末飲片中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7.7%～9.1%，平均值為8.4%，因此，以平均數(shù)上浮20%為限度，建議暫定白及粉末飲片水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過10.0%。

2.3 灰分和酸不溶性灰分檢測

參照《中國藥典》[3]灰分和酸不溶性灰分的檢測方法，制訂了白及粉末飲片總灰分與酸不溶性灰分的檢測方法和限量。由表2可見，10批次白及粉末飲片的總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%～6.5%，平均值為3.7%，因此，以平均數(shù)上浮20%為限度，建議暫定白及粉末飲片總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過5.0%。酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～1.6%，平均值為0.6%，因此，以平均數(shù)上浮20%為限度，建議暫定白及粉末飲片酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過1.0%。

表2 白及粉末飲片中水分、灰分和酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制指標(biāo)

2.4 薄層色譜(TLC)鑒別

2.4.1 薄層色譜條件

選用硅膠GF254型薄層板，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶3∶1，V/V)為展開劑，噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%香草醛硫酸乙醇溶液，110oC下加熱至斑點顯色清晰[14-15]。

2.4.2 樣品制備

取樣品粉末1.0 g，加20 mL甲醇超聲30 min，放冷，抽濾，續(xù)濾液至蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解，離心，取上層液體作為樣品溶液。

2.4.2 鑒別與結(jié)果

吸取樣品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶3∶1，V/V)為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%香草醛硫酸乙醇溶液，在110oC下加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果樣品色譜中，除4號樣品外，其他產(chǎn)地和批次的樣品在相應(yīng)的位置顯相同的斑點，斑點的大小和顏色有所差異，鑒別結(jié)果如圖2所示。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%香草醛硫酸乙醇溶液顯色圖2 白及粉末TLC圖Fig.2 TLC of Bletilla striata powder

圖2中，1～10表示10批次樣品，批號分別為140912、141115、130801、150303235、131010、160101、150215、150301、150823、130901。

3 白及粉末飲片中多糖含量測定

采用蒽酮-硫酸紫外顯色法對白及粉末飲片中的粗多糖進行含量測定[16-19]。

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品12.2 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得對照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

精密稱取白及粉末飲片0.5 g，置圓底燒瓶中，加水150 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，殘渣及燒瓶熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液和洗液，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，取溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、1.0、1.2 mL于試管中，加水至2 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL，冰水浴中加入5 mL硫酸，混勻，沸水浴中加熱10 min，取出置冰水浴中冷卻10 min，在625 nm處測量其吸收值。以吸光度為縱坐標(biāo)，多糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.007 62x+0.006 64，R2= 0.999。多糖濃度在12.2～73.2 μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系，見圖3。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

3.4 多糖的含量測定

分別取白及粉末飲片，精密稱定，按3.2項下方法制備供試品溶液。取供試品溶液2 mL置試管中，按3.3項下條件測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表3 白及粉末飲片中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 ( n = 3)

4 討論

4.1 顯微特征鑒別

白及粉末飲片顯微特征明顯，表皮細胞、草酸鈣針晶、纖維及含硅質(zhì)塊細胞、導(dǎo)管和糊化淀粉粒塊清晰可見，與白及藥材的顯微特征相符合，鑒別結(jié)果為建立地方標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠的依據(jù)。

4.2 水分、灰分和酸不溶性灰分檢測

由表2可知，10批白及粉末飲片的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7.7%～9.1%，平均值為8.4%，產(chǎn)地差異和藥材存放時間并未引起白及粉末飲片含水量的巨大變化，因此，擬定白及粉末飲片水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過10.0%。10批白及粉末飲片的總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%～6.5%，平均值為3.7%。藥典規(guī)定白及藥材總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%，第10批白及粉末飲片的總灰分為6.5%，這可能與藥材的凈制有關(guān)。因此，擬定白及粉末飲片總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過5.0%。10批白及粉末飲片的酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～1.6%，平均值為0.6%。藥典并未規(guī)定白及藥材酸不溶性灰分的含量，因此，作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，本研究初步擬定白及粉末飲片酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過1.0%。

4.3 TLC鑒別

首先，對不同的展開系統(tǒng)分別進行比較：(1)三氯甲烷-甲醇-水(6∶0.5∶0.05，V/V)； (2)石油醚-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1，V/V)；(3)環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶5∶1，V/V)；(4)乙酸乙酯-甲醇-水(6∶0.5∶0.05，V/V)等。在此基礎(chǔ)上進行溶劑比例篩選，由圖2可知，環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶3∶1，V/V)作為展開劑斑點相對位置和重現(xiàn)性好，不會出現(xiàn)脫混的現(xiàn)象。其次，考察了不同溫度、濕度以及3種不同品牌硅膠預(yù)制板下薄層鑒別的影響。結(jié)果表明，在室溫(20～25oC)及低溫(4～10oC)展開，顯示溫度影響相對較小，斑點清晰，濕度在31%和76%時也均能獲得較好的分離效果。3種不同品牌薄層板中，煙臺江友GF254型硅膠板效果最佳。從結(jié)果中可以看出，溶劑前沿以下兩個粉紅色斑點清晰可見，分離度好，可以作為白及粉末質(zhì)量評價指標(biāo)性評定。樣品測定中，樣品150303235的TLC鑒別未見其對應(yīng)指標(biāo)性斑點，但溶劑前沿以下三個青色斑點與其他樣品、標(biāo)準(zhǔn)藥材相對應(yīng)，并且此樣品的多糖含量豐富。由此推測，該樣品可能為白及屬的其他品種。樣品160101的TLC圖中對應(yīng)斑點顏色減弱，其他批號樣品則無明顯差異，斑點分離效果好。

4.4 多糖含量測定

白及塊莖中含有萜類、菲類、聯(lián)芐類等化合物，但含量較低不適合作為質(zhì)量評價指標(biāo)。2015年版《中國藥典》并未收錄其含量測定標(biāo)準(zhǔn)。白及含有含量較高的多糖物質(zhì)并且具有顯著的生物活性，因此以多糖含量作為白及粉末質(zhì)量評價的依據(jù)之一。白及藥材多糖含量測定通常是蒽酮-硫酸和苯酚-硫酸兩種方法，苯酚易氧化并對某些多糖可能誘導(dǎo)發(fā)生副反應(yīng)，因此，本研究采用較為經(jīng)典有效和常用的蒽酮-硫酸法。從測定結(jié)果得出，10批白及粉末飲片多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.4%～31.5%，樣品131010和130901中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，160101樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，平均為28.4%，以平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)下浮20%為依據(jù)，故擬定白及粉末飲片多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于22.7%。不同產(chǎn)地和批次白及粉末飲片多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異，來自產(chǎn)地貴州的樣品中，白及的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對最高且較為穩(wěn)定，表明地域差異與生長環(huán)境、采收期等因素影響其內(nèi)在質(zhì)量[20]。此方法為今后白及粉末飲片的質(zhì)量評價提供了科學(xué)依據(jù)。

5 小結(jié)

白及粉末飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系是由每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)共同組成的，通過系統(tǒng)的研究，上述結(jié)果各限量控制指標(biāo)較2015年版《中國藥典》白及藥材的標(biāo)準(zhǔn)有所提高，同時增加了酸不溶性灰分、多糖含量測定等檢測指標(biāo)，為白及粉末飲片的質(zhì)量評價提供了較為全面的實踐方法和理論支持，彌補了白及粉末飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的不足，為白及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進一步提高奠定了基礎(chǔ)。總之，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個復(fù)雜、艱巨的體系[21]，但其重要性激勵著科研工作者不斷的探索、完善和創(chuàng)新。

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Preliminary study on the quality evaluation ofBletillastriatapowder

WANG Tao1, WANG Xiao-hui1, CHEN Yan-nan2, YANG Fan1, ZHANG Chong1, WANG Xiao1

(1.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014,China; 2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China)

∶To establish the quality evaluation method ofBletillastriatapowder, ten batches of samples from different areas were adapted to analysis. The identification method based on thin layer chromatogram (TLC) was improved, while the method with anthrone-sulfuric acid coloration was established to determine the polysaccharide inBletillastriatapowder. Meanwhile, the contents of microscopic, moisture, total ash, and acid insoluble ash inBletillastriatapowder had been studied and summarized. This method is convenient and stable so that it can be effectively and scientifically used for the quality evaluation ofBletillastriatapowder.

∶Bletillastriata; powder; quality evaluation; polysaccharide

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.006

2016-10-08

山東省分析測試中心科技發(fā)展基金(山分基合字2015第6號)；山東省科學(xué)院先導(dǎo)項目

王濤(1987—)，男，博士，助理研究員，研究方向為中藥質(zhì)量控制及評價體系。E-mail： taowang_xmu@163.com

R284. 1

A

1002-4026(2017)03-0026-07