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        HPLC-MS同時測定澤瀉中兩種澤瀉醇的含量

        2017-06-28 15:09:33池雨鋒王小明張玲林莎莎蔣海強周洪雷
        山東科學(xué) 2017年3期
        關(guān)鍵詞:澤瀉乙酰藥材

        池雨鋒 ,王小明 ,張玲 ,林莎莎 ,蔣海強,周洪雷*

        (1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟南 250355;2山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心,山東 濟南 250355)

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        【中藥與天然活性產(chǎn)物】

        HPLC-MS同時測定澤瀉中兩種澤瀉醇的含量

        池雨鋒1,王小明1,張玲1,林莎莎1,蔣海強2*,周洪雷1*

        (1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟南 250355;2山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心,山東 濟南 250355)

        為提高澤瀉藥材的質(zhì)量控制水平,建立了澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A的高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用含量測定方法。色譜條件為Halo C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm),體積分數(shù)0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動相,梯度洗脫,流速0.3 mL·min-1,柱溫30 ℃;質(zhì)譜條件為ESI離子源, 正離子檢測方式,MRM模式,干燥氣溫度350 ℃,干燥氣流速9 L·min-1,霧化器壓力241.3 kPa,毛細管電壓4 000 V。 測得藥材中23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A含量分別為11.459 5 μg·g-1,321.823 9 μg·g-1。該方法結(jié)果準確,重現(xiàn)性好,可用于測定澤瀉中兩種成分的含量。

        澤瀉;澤瀉醇;高效液相-質(zhì)譜法;含量測定

        澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzap 的干燥塊莖。澤瀉為常用中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并將其列為上品。澤瀉為臨床常用利水滲濕藥,味甘、淡,性寒,歸腎、膀胱經(jīng),能夠泄熱,利水滲濕、化濁降脂,臨床上用于小便不利、水腫、高脂血癥、熱淋澀痛[1]。

        澤瀉所含有的化學(xué)成分主要是萜類,包括倍半萜、二萜、三萜,還有谷甾醇、硬脂酸、大黃素等[2]。現(xiàn)代藥理研究表明,澤瀉具有利尿、降血糖、降血脂、抗結(jié)石、抗腎炎、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[3]。王立新等[4]發(fā)現(xiàn)澤瀉的利尿有效成分主要是24-乙酰澤瀉醇A,且澤瀉中含有的23-乙酰澤瀉醇B能夠明顯地降低血清中甘油三酯和總膽固醇含量[5-6]。許文等[7]對澤瀉具有降糖活性部位化學(xué)成分進行研究,得到了多種三萜類成分,其中9種成分能夠促進細胞對葡萄糖的攝取,推測三萜類物質(zhì)是澤瀉降糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。尹仁杰等[8]認為23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A是澤瀉利尿的有效成分,因此,這兩種成分含量的高低在一定程度上決定了藥材質(zhì)量。本實驗以這兩種成分為指標,建立了澤瀉的HPLC-MS測定方法,為科學(xué)評價澤瀉質(zhì)量提供依據(jù)。

        1 實驗部分

        1.1 藥材及試劑

        澤瀉藥材(澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzep. 的干燥塊莖,原產(chǎn)地福建;批號:120906),24-乙酰澤瀉醇A(批號18674-16-3)及23-乙酰澤瀉醇B(批號26575-95-1)購自北京寶賽希望生物科技有限公司,乙腈 (色譜純,F(xiàn)isher公司);水為Milli-Q超純水,其它試劑均為分析純。

        1.2 儀器及色譜-質(zhì)譜條件

        儀器:Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng),檢測器:6420 QQQ質(zhì)譜檢測器。色譜柱:Halo C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm);流動相: 0.1%甲酸水- 0.1%甲酸乙腈體系(均為體積分數(shù)),流速0.3 mL·min-1,柱溫:30 °C。梯度洗脫條件:0 min,90∶10(0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸乙腈溶液,下同);12 min,70∶30;45~55 min,48∶52;75 min,28∶72。質(zhì)譜條件:ESI離子源, 正離子檢測方式,MRM模式,干燥氣溫度350 °C,干燥氣流速 9 L·min-1,霧化器壓力 241.3 kPa(35 Psi),毛細管電壓 4 000 V。MRM參數(shù)見表1。

        表1 各離子對多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)參數(shù)

        1.3 對照品溶液的制備

        分別精密稱取24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B對照品粉末適量,乙腈超聲溶解、定容使制成1.693 4 mg·mL-1的24-乙酰澤瀉醇A儲備液,0.426 6 mg·mL-1的23-乙酰澤瀉醇B儲備液,置于冰箱4 °C保存。測定時每種儲備液分別取適量,制成混合對照品,混合對照品中24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B含量分別為0.423 3 mg·mL-1和0.106 6 mg·mL-1。

        1.4 供試品溶液的制備

        澤瀉藥材粉碎,精密稱取10 g,10倍量95%乙醇回流提取3次,每次1 h,藥渣再以10倍量水回流提取3次,每次1 h,過濾。醇提液60 ℃懸蒸回收乙醇,水提液60 ℃水浴蒸干,用甲醇轉(zhuǎn)移并合并水提物和醇提物,定容至10 mL。甲醇液加適量甲醇稀釋,超聲30 min,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶中,即得相當于原藥材濃度為50 mg·mL-1的澤瀉供試液。

        2 結(jié)果

        2.1 線性關(guān)系考察

        采用逐步稀釋法,至信噪比等于3時,濃度定為各成分檢測限,24-乙酰澤瀉醇A檢測限為4.233 2 ng·mL-1,23-乙酰澤瀉醇B檢測限為42.660 0 ng·mL-1,信噪比等于10時的濃度定為定量限,二者定量限分別為14.110 7 ng·mL-1和142.200 0 ng·mL-1。精密吸取一定量的混合對照品溶液,用乙腈分別稀釋至0、5、10、20、50、100倍?;旌蠈φ掌窛舛扔傻偷礁咭来芜B續(xù)進樣,以對照品溶液濃度(X,μg·mL-1)對峰面積(Y)進行線性回歸,得回歸方程:24-乙酰澤瀉醇A,Y=8.460 1X+11 529.766 7,R=0.999 2,線性范圍4.233 0~423.300 0 μg·mL-1;23-乙酰澤瀉醇B,Y=2.194 7X+0.464 1,R=0.999 9,線性范圍2.133 0~213.300 0 μg·mL-1。

        2.2 方法學(xué)考察

        精密度:以稀釋20倍混合標準品溶液為樣品,連續(xù)進樣6次,根據(jù)峰面積考察精密度,24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的相對標準偏差分別為1.56%和1.31%。

        重復(fù)性:按照前述步驟,重復(fù)制備6份澤瀉供試品溶液,根據(jù)兩種成分含量考察重現(xiàn)性,24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的相對標準偏差分別為1.59%和1.35%。

        穩(wěn)定性:按照前述方法制備一份供試品溶液,分別在 0、2、4、8、12、16、24 h 進樣,以峰面積為指標,24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的相對標準偏差分別為2.51%和1.89%,表明供試液在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

        加樣回收率:在已知成分含量的6份供試品溶液中分別定量加入兩種對照品,每份測定2次,24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的回收率分別為97.1%和98.6%。

        2.3 樣品測定結(jié)果

        按照前述步驟,平行制備3份供試品溶液,按前述色譜質(zhì)譜條件進行測定,色譜圖見圖1,結(jié)果見表2,1、2號色譜峰分別為24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B。

        圖1 澤瀉樣品MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of Rhizoma Alismatis samples

        序號23?乙酰澤瀉醇B/(μg·g-1)24?乙酰澤瀉醇A/(μg·g-1)樣品111.5195324.8919樣品211.3210318.8264樣品311.5380322.2534平均值11.4595321.8239

        3 討論

        澤瀉作為中藥在我國具有悠久的用藥歷史,歷代本草均有收錄,現(xiàn)今臨床常用于治療小便不利、水腫、高血脂癥。澤瀉中的三萜類成分不穩(wěn)定,容易發(fā)生轉(zhuǎn)化,文獻報道,在貯存和炮制過程中,23-乙酰澤瀉醇B會發(fā)生部分轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)變成24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇B,23-乙酰澤瀉醇B含量有所降低,24-乙酰澤瀉醇A含量明顯增加,澤瀉中的24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉的主要活性成分[8-11]。因此,24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的含量,在一定程度上決定了藥材質(zhì)量的高低,所以,僅以23-乙酰澤瀉醇B作為指標評價澤瀉藥材質(zhì)量是否合理,還需要進一步論證。

        MRM參數(shù)的優(yōu)化,通過全掃描獲得母離子豐度,根據(jù)其豐度優(yōu)化碎裂電壓。然后,通過子離子掃描施加不同的碰撞能量使母離子發(fā)生裂解,對碰撞能量進行優(yōu)化,以豐度最高的子離子為定量離子,豐度次之的子離子為定性離子,根據(jù)定量離子和定性離子的豐度優(yōu)化碰撞電壓,最終確定MRM參數(shù)。

        目前,澤瀉中萜類有效成分的含量測定方法,主要有紫外可見分光光度法和高效液相色譜法[12-14],用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定有效成分含量的文章鮮有報道。紫外可見分光光度法能在一定程度上反映藥材的質(zhì)量,但是測定結(jié)果準確性偏低。高效液相色譜法多用紫外檢測器,而澤瀉中的有效成分紫外吸收較弱,只能利用波長較短的末端吸收進行測定,干擾因素多,誤差相對較大。而高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法具有測定結(jié)果準確重現(xiàn)性好的優(yōu)點。本實驗建立的HPLC-MS方法,用以測定澤瀉中的24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B,為深入研究澤瀉的質(zhì)量標準提供了實驗依據(jù)。

        [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:229.

        [2]肖飛艷,馮育林,楊世林,等. 澤瀉化學(xué)成分的研究進展[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2009,20(5):491-495.

        [3] 禹建春,葉紅梅,林西西. 澤瀉的藥理研究概況[J]. 海峽藥學(xué),2011,23(2):92-93.

        [4] 王立新,吳啟南,張橋,等. 澤瀉中利尿活性物質(zhì)的研究[J]. 華西藥學(xué)雜志,2008,23(6):670-672.

        [5]黃珍,劉詠松. 澤瀉降血脂藥理作用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究進展[J]. 山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,9(5):55-56.

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        [7] 許文,羅奮熔,趙萬里,等. 澤瀉降糖活性提取物化學(xué)成分研究[J]. 中草藥,2014,45(22):3238-3245.

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        [10] 朱玉嵐,彭國平. 澤瀉的萜類化學(xué)成分研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18(2):348-351.

        [11]鄭云楓,朱玉嵐,彭國平. 澤瀉炮制過程中23-乙酰澤瀉醇B的轉(zhuǎn)化[J]. 中草藥,2006,37(10):1479-1482.

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        [14]吳秋云,陳艷紅,謝友良. 不同產(chǎn)地澤瀉有效成分的含量測定[J]. 臨床醫(yī)學(xué)工程,2010,17(10):60-61.

        Simultaneous determination of two alisols in Rhizoma Alismatis by HPLC-MS

        CHI Yu-feng1,WANG Xiao-ming1,ZHANG Ling1,LIN Sha-sha1,JIANG Hai-qiang2*,ZHOU Hong-lei1*

        (1.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;2.Experience Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China)

        ∶To improve the quality control of the Rhizoma Alismatis, a HPLC-MS method for determination of the contents of two alisols in Rhizoma Alismatis was established in this paper. Chromatographic conditions were as follows:Halo C18column(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm), the mobile phase was a mixture of 0.1% formic acid solution-0.1% formic acid in acetonitrile, gradient elution, the flow rate was 0.3 mL·min-1, the column temperature was 30 ℃. The conditions of MS included: ESI ion source, detection method with positive ions, mode by MRM, drying temperature was 350 ℃, the flow rate of drying gas was 9 L·min-1, pressure of nebulizer was 241.3 kPa, and the voltage of capillary was 4 000 V. The content of alisol B 23-acetate and alisol A 24-acetate in the samples was 11.459 5 μg·g-1and 321.823 9 μg·g-1, respectively. The method is accurate and reproducible to the determination of two alisols in Rhizoma Alismatis.

        ∶Rhizoma Alismatis; alisols; HPLC-MS; content determination

        10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.004

        2016-08-12

        山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HM080);山東省博士后創(chuàng)新項目專項資金(201403006);山東省科技計劃(2013GSF11903);山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新課題(XTCX2014C01-03)

        池雨鋒(1989—),男,碩士研究生,研究方向為天然藥物化學(xué)成分。E-mail:chongming0539@126.com

        *通信作者,蔣海強(1982—),男,博士,副教授,研究方向為天然藥物化學(xué)成分。E-mail: jhq12723@163.com; 周洪雷(1967—),男,教授,研究方向為中藥及復(fù)方活性成分與質(zhì)量控制。E-mail:zhouhongleitcm@163.com

        R284.1

        A

        1002-4026(2017)03-0017-04

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