池雨鋒 ,王小明 ,張玲 ,林莎莎 ,蔣海強(qiáng),周洪雷*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

HPLC-MS同時(shí)測(cè)定澤瀉中兩種澤瀉醇的含量

池雨鋒1,王小明1,張玲1,林莎莎1,蔣海強(qiáng)2*,周洪雷1*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

為提高澤瀉藥材的質(zhì)量控制水平，建立了澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A的高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用含量測(cè)定方法。色譜條件為Halo C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.3 mL·min-1，柱溫30 ℃；質(zhì)譜條件為ESI離子源, 正離子檢測(cè)方式，MRM模式，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速9 L·min-1，霧化器壓力241.3 kPa，毛細(xì)管電壓4 000 V。 測(cè)得藥材中23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A含量分別為11.459 5 μg·g-1，321.823 9 μg·g-1。該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于測(cè)定澤瀉中兩種成分的含量。

澤瀉；澤瀉醇；高效液相-質(zhì)譜法；含量測(cè)定

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzap 的干燥塊莖。澤瀉為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并將其列為上品。澤瀉為臨床常用利水滲濕藥，味甘、淡，性寒，歸腎、膀胱經(jīng)，能夠泄熱，利水滲濕、化濁降脂，臨床上用于小便不利、水腫、高脂血癥、熱淋澀痛[1]。

澤瀉所含有的化學(xué)成分主要是萜類，包括倍半萜、二萜、三萜，還有谷甾醇、硬脂酸、大黃素等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，澤瀉具有利尿、降血糖、降血脂、抗結(jié)石、抗腎炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[3]。王立新等[4]發(fā)現(xiàn)澤瀉的利尿有效成分主要是24-乙酰澤瀉醇A，且澤瀉中含有的23-乙酰澤瀉醇B能夠明顯地降低血清中甘油三酯和總膽固醇含量[5-6]。許文等[7]對(duì)澤瀉具有降糖活性部位化學(xué)成分進(jìn)行研究，得到了多種三萜類成分，其中9種成分能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，推測(cè)三萜類物質(zhì)是澤瀉降糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。尹仁杰等[8]認(rèn)為23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A是澤瀉利尿的有效成分，因此，這兩種成分含量的高低在一定程度上決定了藥材質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以這兩種成分為指標(biāo)，建立了澤瀉的HPLC-MS測(cè)定方法，為科學(xué)評(píng)價(jià)澤瀉質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥材及試劑

澤瀉藥材(澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzep. 的干燥塊莖，原產(chǎn)地福建；批號(hào)：120906)，24-乙酰澤瀉醇A(批號(hào)18674-16-3)及23-乙酰澤瀉醇B(批號(hào)26575-95-1)購(gòu)自北京寶賽希望生物科技有限公司，乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher公司)；水為Milli-Q超純水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器及色譜-質(zhì)譜條件

儀器：Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，檢測(cè)器：6420 QQQ質(zhì)譜檢測(cè)器。色譜柱：Halo C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)；流動(dòng)相： 0.1%甲酸水- 0.1%甲酸乙腈體系(均為體積分?jǐn)?shù))，流速0.3 mL·min-1，柱溫：30 °C。梯度洗脫條件：0 min，90∶10(0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸乙腈溶液，下同)；12 min，70∶30；45～55 min,48∶52；75 min，28∶72。質(zhì)譜條件：ESI離子源, 正離子檢測(cè)方式，MRM模式，干燥氣溫度350 °C，干燥氣流速 9 L·min-1，霧化器壓力 241.3 kPa(35 Psi)，毛細(xì)管電壓 4 000 V。MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各離子對(duì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)參數(shù)

1.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品粉末適量，乙腈超聲溶解、定容使制成1.693 4 mg·mL-1的24-乙酰澤瀉醇A儲(chǔ)備液，0.426 6 mg·mL-1的23-乙酰澤瀉醇B儲(chǔ)備液，置于冰箱4 °C保存。測(cè)定時(shí)每種儲(chǔ)備液分別取適量，制成混合對(duì)照品，混合對(duì)照品中24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B含量分別為0.423 3 mg·mL-1和0.106 6 mg·mL-1。

1.4 供試品溶液的制備

澤瀉藥材粉碎，精密稱取10 g，10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，藥渣再以10倍量水回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾。醇提液60 ℃懸蒸回收乙醇，水提液60 ℃水浴蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移并合并水提物和醇提物，定容至10 mL。甲醇液加適量甲醇稀釋，超聲30 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，即得相當(dāng)于原藥材濃度為50 mg·mL-1的澤瀉供試液。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

采用逐步稀釋法，至信噪比等于3時(shí)，濃度定為各成分檢測(cè)限，24-乙酰澤瀉醇A檢測(cè)限為4.233 2 ng·mL-1，23-乙酰澤瀉醇B檢測(cè)限為42.660 0 ng·mL-1，信噪比等于10時(shí)的濃度定為定量限，二者定量限分別為14.110 7 ng·mL-1和142.200 0 ng·mL-1。精密吸取一定量的混合對(duì)照品溶液，用乙腈分別稀釋至0、5、10、20、50、100倍?；旌蠈?duì)照品濃度由低到高依次連續(xù)進(jìn)樣，以對(duì)照品溶液濃度(X，μg·mL-1)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：24-乙酰澤瀉醇A，Y=8.460 1X+11 529.766 7，R=0.999 2，線性范圍4.233 0～423.300 0 μg·mL-1；23-乙酰澤瀉醇B，Y=2.194 7X+0.464 1，R=0.999 9，線性范圍2.133 0～213.300 0 μg·mL-1。

2.2 方法學(xué)考察

精密度：以稀釋20倍混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積考察精密度，24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.56%和1.31%。

重復(fù)性：按照前述步驟，重復(fù)制備6份澤瀉供試品溶液，根據(jù)兩種成分含量考察重現(xiàn)性，24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.59%和1.35%。

穩(wěn)定性：按照前述方法制備一份供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，以峰面積為指標(biāo)，24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.51%和1.89%，表明供試液在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率：在已知成分含量的6份供試品溶液中分別定量加入兩種對(duì)照品，每份測(cè)定2次，24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的回收率分別為97.1%和98.6%。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

按照前述步驟，平行制備3份供試品溶液，按前述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表2，1、2號(hào)色譜峰分別為24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B。

圖1 澤瀉樣品MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of Rhizoma Alismatis samples

序號(hào)23?乙酰澤瀉醇B/(μg·g-1)24?乙酰澤瀉醇A/(μg·g-1)樣品111．5195324．8919樣品211．3210318．8264樣品311．5380322．2534平均值11．4595321．8239

3 討論

澤瀉作為中藥在我國(guó)具有悠久的用藥歷史，歷代本草均有收錄，現(xiàn)今臨床常用于治療小便不利、水腫、高血脂癥。澤瀉中的三萜類成分不穩(wěn)定，容易發(fā)生轉(zhuǎn)化，文獻(xiàn)報(bào)道，在貯存和炮制過(guò)程中，23-乙酰澤瀉醇B會(huì)發(fā)生部分轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變成24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇B，23-乙酰澤瀉醇B含量有所降低，24-乙酰澤瀉醇A含量明顯增加，澤瀉中的24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉的主要活性成分[8-11]。因此，24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的含量，在一定程度上決定了藥材質(zhì)量的高低，所以，僅以23-乙酰澤瀉醇B作為指標(biāo)評(píng)價(jià)澤瀉藥材質(zhì)量是否合理，還需要進(jìn)一步論證。

MRM參數(shù)的優(yōu)化，通過(guò)全掃描獲得母離子豐度，根據(jù)其豐度優(yōu)化碎裂電壓。然后，通過(guò)子離子掃描施加不同的碰撞能量使母離子發(fā)生裂解，對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，以豐度最高的子離子為定量離子，豐度次之的子離子為定性離子，根據(jù)定量離子和定性離子的豐度優(yōu)化碰撞電壓，最終確定MRM參數(shù)。

目前，澤瀉中萜類有效成分的含量測(cè)定方法，主要有紫外可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法[12-14]，用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定有效成分含量的文章鮮有報(bào)道。紫外可見(jiàn)分光光度法能在一定程度上反映藥材的質(zhì)量，但是測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性偏低。高效液相色譜法多用紫外檢測(cè)器，而澤瀉中的有效成分紫外吸收較弱，只能利用波長(zhǎng)較短的末端吸收進(jìn)行測(cè)定，干擾因素多，誤差相對(duì)較大。而高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法具有測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-MS方法，用以測(cè)定澤瀉中的24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B，為深入研究澤瀉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Simultaneous determination of two alisols in Rhizoma Alismatis by HPLC-MS

CHI Yu-feng1,WANG Xiao-ming1,ZHANG Ling1,LIN Sha-sha1,JIANG Hai-qiang2*,ZHOU Hong-lei1*

(1.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China；2.Experience Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China)

∶To improve the quality control of the Rhizoma Alismatis, a HPLC-MS method for determination of the contents of two alisols in Rhizoma Alismatis was established in this paper. Chromatographic conditions were as follows：Halo C18column(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm), the mobile phase was a mixture of 0.1% formic acid solution-0.1% formic acid in acetonitrile, gradient elution, the flow rate was 0.3 mL·min-1, the column temperature was 30 ℃. The conditions of MS included: ESI ion source, detection method with positive ions, mode by MRM, drying temperature was 350 ℃, the flow rate of drying gas was 9 L·min-1, pressure of nebulizer was 241.3 kPa, and the voltage of capillary was 4 000 V. The content of alisol B 23-acetate and alisol A 24-acetate in the samples was 11.459 5 μg·g-1and 321.823 9 μg·g-1, respectively. The method is accurate and reproducible to the determination of two alisols in Rhizoma Alismatis.

∶Rhizoma Alismatis; alisols; HPLC-MS; content determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.004

2016-08-12

山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HM080)；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目專項(xiàng)資金(201403006)；山東省科技計(jì)劃(2013GSF11903)；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新課題(XTCX2014C01-03)

池雨鋒(1989—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)成分。E-mail:chongming0539@126.com

*通信作者,蔣海強(qiáng)(1982—)，男，博士，副教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)成分。E-mail: jhq12723@163.com； 周洪雷(1967—)，男，教授，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方活性成分與質(zhì)量控制。E-mail:zhouhongleitcm@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0017-04