郎曉輝，鐘進(jìn)義，孫曉虹，嚴(yán)吉峰，周佳靜

（1.山東省煙臺(tái)護(hù)士學(xué)校，山東 煙臺(tái) 264000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021；3.煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 265699）

海藻色素糖蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用的體內(nèi)外研究

郎曉輝1，鐘進(jìn)義2，孫曉虹1，嚴(yán)吉峰1，周佳靜3

（1.山東省煙臺(tái)護(hù)士學(xué)校，山東 煙臺(tái) 264000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021；3.煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 265699）

目的 觀(guān)察麒麟菜海藻色素糖蛋白（SPG）對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性的抑制作用。方法 將不同濃度SPG與人MGC803胃癌細(xì)胞共同培養(yǎng)，用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定胃癌細(xì)胞增殖活性。將SPG經(jīng)口給予皮下接種MFC細(xì)胞株的小鼠，10天后取胃癌組織，用MTT法測(cè)定不同劑量組小鼠胃癌細(xì)胞的增殖活性，免疫組化法檢測(cè)不同劑量組小鼠胃癌細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白的表達(dá)。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量SPG組與腫瘤對(duì)照組48h細(xì)胞增殖活性分別為0.531±0.008和0.857±0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量SPG組細(xì)胞增殖活性及PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.698±0.028和16.30%，腫瘤對(duì)照組分別為1.122±0.032和62.06%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 SPG對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性有抑制作用。

海藻色素糖蛋白（SPG）；胃癌細(xì)胞；增殖活性

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人MGC803胃癌細(xì)胞株、MFC細(xì)胞株購(gòu)自上海研域生物科技有限公司；昆明種健康小鼠由山東魯抗醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心提供，每只體重18～20 g，本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

SPG是從新鮮干燥麒麟菜中以乙醇浸提法制取，由本實(shí)驗(yàn)室自行制備，經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，純度＞90%。

1.3 試劑與儀器

PCNC多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）和胎牛血清為美國(guó)GiBco公司產(chǎn)品；Rosys Anthos2010自動(dòng)型酶標(biāo)儀是瑞典產(chǎn)；Olympus XDS-1B型倒置顯微鏡為日本產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 體外實(shí)驗(yàn)

用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803人胃癌細(xì)胞配成瘤細(xì)胞密度為5×105/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100 uL的量接種于96孔培養(yǎng)板上?？瞻讓?duì)照組加入等量雙蒸水，高、中、低劑量組分別加入濃度為50、100、200 mg/L的SPG，各組均設(shè)置3個(gè)平行樣本。放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT等試劑待其反應(yīng)，經(jīng)自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度（A）值，而后求取吸光度（A）的平均值，用平均A值表示各組細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞增殖抑制率=（空白對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/空白對(duì)照組A值×100%[3]。

1.4.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

用生理鹽水調(diào)整MFC細(xì)胞濃度為1×107/mL，于健康昆明種小鼠右側(cè)腋窩處進(jìn)行皮下接種，每只接種量為0.2 mL，共接種40只，于接種后24 h，將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半，分別為腫瘤對(duì)照組及高、中、低劑量SPG組。每日上午10時(shí)經(jīng)口灌胃一次，腫瘤對(duì)照組給予生理鹽水，高、中、低劑量SPG組則分別50、100、200 mg/kg的SPG溶液，連續(xù)10天，末次給藥24 h后脫頸椎處死小鼠，對(duì)小鼠瘤組織于無(wú)菌條件下進(jìn)行剝離，用1.4.1中方法測(cè)定培養(yǎng)24 h后的胃癌細(xì)胞增殖活性，用免疫組化法檢測(cè)小鼠瘤組織中PNCA蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

200和100 mg/L SPG組，培養(yǎng)48 h的細(xì)胞增殖活性分別為0.531±0.008和0.613±0.021，空白對(duì)照組為0.857±0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各組間差異具有顯著性。見(jiàn)表1。

表1 SPG對(duì)MGC803人胃癌細(xì)胞增殖活性影響的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表1 SPG對(duì)MGC803人胃癌細(xì)胞增殖活性影響的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：與空白對(duì)照組比較 α P＜0.05，與高劑量組比較β P＜0.05

38.04 28.47 7.58 -組別吸光度A值 抑制率（%）高劑量組中劑量組低劑量組空白對(duì)照組0.531±0.008α0.613±0.021α,β0.792±0.003α,β0.857±0.011

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠MFC胃癌細(xì)胞增殖活性

高劑量SPG組為0.698±0.028，腫瘤對(duì)照組為1.122±0.032，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 SPG對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞增殖活性影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表2 SPG對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞增殖活性影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：與腫瘤對(duì)照組比較α P＜0.05，與高劑量組比較βP＜0.05

37.79 27.54 7.13 -組別吸光度A值抑制率（%）高劑量組中劑量組低劑量組腫瘤對(duì)照組0.698±0.028α0.813±0.020β1.042±0.069 1.122±0.032

2.2.2 PNCA蛋白表達(dá)結(jié)果

增殖細(xì)胞核抗原PCNA，呈棕黃色顆粒，在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量SPG組的胃癌細(xì)胞內(nèi)PNCA蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)少，染色多淺淡；腫瘤對(duì)照組的胃癌細(xì)胞內(nèi)PNCA蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)多，染色大多濃重。高劑量SPG組和腫瘤對(duì)照組胃癌細(xì)胞內(nèi)PNCA則分別為16.48%和62.06%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩者差異具有顯著性。見(jiàn)表3。

表3 瘤細(xì)胞PNCA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率（%）

3 討 論

海藻色素糖蛋白（Seaweed pigment glycoprotein，SPG）是海藻中一種硫酸多糖與藻膽蛋白天然結(jié)合的色素糖蛋白。近年來(lái)有研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)活性。本研究采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，觀(guān)察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。

本研究用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定細(xì)胞增殖活性水平，其吸光度A值與細(xì)胞的代謝活性成正比。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示：SPG組吸光度A值較之腫瘤對(duì)照組低，統(tǒng)計(jì)分析差異有顯著性，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，高劑量組更低于中劑量組，說(shuō)明SPG對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性具有一定的抑制作用。

增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，是DNA合成過(guò)程中多聚酶的輔助蛋白，其表達(dá)狀況可以反映細(xì)胞增殖狀態(tài)[7]。PCNA表達(dá)的強(qiáng)弱與DNA合成活躍度呈正比關(guān)系，PCNA表達(dá)越強(qiáng)，說(shuō)明DNA合成越活躍，PCNA表達(dá)減弱，說(shuō)明DNA合成減弱。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPG組PCNA表達(dá)的陽(yáng)性率較之腫瘤對(duì)照組低，統(tǒng)計(jì)分析差異有顯著性，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，高劑量組低于中劑量組，中劑量組低于低劑量組，說(shuō)明SPG具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。

綜合本次研究的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SPG在降低胃癌細(xì)胞的增殖活性和PCNA蛋白表達(dá)水平方面有作用。本研究中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示的結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)藻膽蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

[1] 鐘進(jìn)義,等.海藻光敏色素糖蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的抑制作用及信號(hào)調(diào)控的研究[A].中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì).中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)第十屆年會(huì)21分會(huì)場(chǎng)論文匯編[C].中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì):2008:5.

[2] 楊 青,等.海藻色素糖蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)的影響(英文)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,(09):1771-1774.

[3] 郎曉輝,等.明日葉查爾酮對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞增殖活性的抑制作用[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2011,(03):261-264.

本文編輯：趙小龍

R735.7

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ISSN.2095-8242.2017.21.4021.02