徐 林，葉 川，潘汝南，李忠輝，李琦哲，王駿華，熊建斌，范建楠*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.四川省骨科醫(yī)院，四川 成都 610041）

兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架修復(fù)兔脛骨缺損實(shí)驗(yàn)研究

徐 林1，葉 川2，潘汝南3，李忠輝1，李琦哲1，王駿華1，熊建斌2，范建楠2*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.四川省骨科醫(yī)院，四川 成都 610041）

目的 對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）聯(lián)合無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架修復(fù)兔脛骨缺損進(jìn)行分析研究。方法 將36只新西蘭大白兔隨機(jī)分為三組，A組（空白組），B組（對(duì)照組）、C組（實(shí)驗(yàn)組），各12只。在兔雙側(cè)脛骨制備直徑為6 mm的骨缺損區(qū)域。A組不做任何處理，B組單純植入支架，C組植入支架與細(xì)胞的復(fù)合物。分別于4 w、8 w、12 w、16 w行一般情況、X線(xiàn)及骨密度檢查。結(jié)果 術(shù)后各組進(jìn)食均正常，切口愈合良好。術(shù)后A組第12 w無(wú)修復(fù)跡象；B組第4 w、8 w骨缺損部分修復(fù)，12 w骨缺損完全修復(fù)；C組各時(shí)間點(diǎn)骨缺損修復(fù)和骨痂生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于B組；C組術(shù)后4 w、8 w、12 w時(shí)各缺損區(qū)的骨密度顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組16 w骨密度比較無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。X線(xiàn)顯示，B組術(shù)后12 w缺損區(qū)基本修復(fù)。C組術(shù)后4 w缺損區(qū)可見(jiàn)骨痂生長(zhǎng)，8 w骨缺損基本修復(fù)。結(jié)論 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架體外復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損的能力較單純植入支架強(qiáng)且迅速。

骨缺損；兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架

近年來(lái)，組織工程骨技術(shù)取得了迅猛的發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被公認(rèn)為理想的種子細(xì)胞來(lái)源之一，其多向分化潛能和向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的優(yōu)勢(shì)已取得實(shí)驗(yàn)室的基本共識(shí)。骨缺損是臨床常見(jiàn)病癥，其治療一直是骨科難題，自體骨移植、異體骨移植以及人工骨移植均為骨缺損的常用治療方式，但它們均存在自身難以克服的缺點(diǎn)。目前，已有研究證實(shí)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人工合成骨復(fù)合成組織工程骨有助于促進(jìn)骨修復(fù)。本文對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架修復(fù)兔脛骨缺損進(jìn)行分析研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康清潔級(jí)新西蘭大白兔36只，4月齡，體重（2.5±0.3）kg，雌雄各半，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滇）k2015-0002，A組（空白組），B組（對(duì)照組）、C組（實(shí)驗(yàn)組），各12只。相同條件下分籠飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。材料：奧邦骨修復(fù)材料（江蘇陽(yáng)生生物工程有限公司）、全培養(yǎng)基（GIBCO公司）、胰蛋白酶。

1.2 方法

1.2.1 BMSC提取、分離及培養(yǎng)

無(wú)菌操作下將每只實(shí)驗(yàn)組兔子麻醉，用帶有骨穿針的注射器在每只兔子的脛骨結(jié)節(jié)下抽取骨髓液3～5 mL，添加300 U肝素抗凝。與淋巴細(xì)胞分離液混合，密度梯度離心，吸取上層細(xì)胞層，800 r/min離心6 min，棄上清后加入全培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞與支架復(fù)合

將無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，放置于全培養(yǎng)基中預(yù)濕24 h，PBS沖洗5次，5min/次，吸出多余液體，放入24孔板中備用。收集生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs，0.25%胰酶消化后，1500 r/min離心5 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×106/mL，將細(xì)胞懸液均勻接種在預(yù)處理的支架上，液面稍覆蓋支架材料表面，即形成細(xì)胞-支架復(fù)合物。接種后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，3 h后緩慢加入成骨誘導(dǎo)液，每?jī)商鞊Q液一次。一周后BMSCs即可與支架復(fù)合。

術(shù)后4 w、8 w、12 w、16 w周行骨密度及X光攝片。術(shù)后4 w、8 w、12 w、16 w每組各處死3只兔子取出標(biāo)本，觀察三組骨缺損修復(fù)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）、百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組兔術(shù)后一般情況

術(shù)后各組進(jìn)食均正常，術(shù)后1天可站立，有輕微跛行。術(shù)后2 w能自由活動(dòng)。愈合良好。術(shù)后空白組12 w無(wú)修復(fù)跡象；對(duì)照組8 w、12 w骨缺損部分修復(fù)，16 w骨缺損完全修復(fù)，實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨缺損修復(fù)和骨痂生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于對(duì)照組。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)兩組骨密度的對(duì)比

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4 w、8 w、12 w時(shí)各缺損區(qū)的骨密度顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組16 w骨密度比較無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組骨密度的對(duì)比（±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組骨密度的對(duì)比（±s）

組別術(shù)后4 w術(shù)后8 w術(shù)后12 w術(shù)后16 w實(shí)驗(yàn)組0.919±0.0421.241±0.0221.652±0.0691.712±0.081對(duì)照組0.569±0.0201.001±0.0311.149±0.0281.565±0.072

2.3 兩組X線(xiàn)片對(duì)比

空白組：術(shù)后12 w未見(jiàn)明顯骨痂形成。

對(duì)照組：術(shù)后4 w見(jiàn)少量骨痂形成；術(shù)后8 w見(jiàn)中等量骨痂形成，但缺損區(qū)仍明顯易分辨；術(shù)后可見(jiàn)12 w大量骨痂形成，缺損區(qū)表現(xiàn)為模糊骨痂影；術(shù)后16 w缺損區(qū)基本修復(fù)。

實(shí)驗(yàn)組：術(shù)后4 w缺損區(qū)見(jiàn)中等量骨痂。術(shù)后8 w可見(jiàn)密度增高的骨痂影充填，缺損區(qū)基本修復(fù)，12 w缺損區(qū)塑型良好，皮質(zhì)連續(xù)，缺損區(qū)不易分辨。

3 結(jié) 論

結(jié)論:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合無(wú)機(jī)誘導(dǎo)因子支架體外復(fù)合培養(yǎng)可用來(lái)構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)骨缺損的能力較單純植入支架強(qiáng)且迅速。

4 討 論

本組研究中對(duì)MSCs聯(lián)合無(wú)機(jī)因子支架修復(fù)兔脛骨缺損進(jìn)行分析研究。將植入支架與細(xì)胞復(fù)合物、單純植入支架與不植入支架的脛骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果顯示，術(shù)后空白組12 w無(wú)修復(fù)跡象；對(duì)照組8 w、12 w骨缺損部分修復(fù)，16 w骨缺損完全修復(fù)，說(shuō)明無(wú)機(jī)因子支架材料對(duì)骨缺損的修復(fù)具有促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4 w、8 w、12 w時(shí)各缺損區(qū)的骨密度顯著高于對(duì)照組，兩組16 w骨密度比較無(wú)明顯差異，說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架修復(fù)骨缺損效果比單純植入支架明顯。X線(xiàn)顯示，空白組術(shù)后12 w骨缺損區(qū)無(wú)修復(fù)跡象；對(duì)照組術(shù)后12 w缺損區(qū)基本修復(fù)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4 w缺損區(qū)可見(jiàn)骨痂生長(zhǎng)，8 w骨缺損基本修復(fù)。因而我們認(rèn)為，兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合無(wú)機(jī)因子支架體外復(fù)合培養(yǎng)可用來(lái)構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)骨缺損的能力優(yōu)于單純植入支架。

[1] 王之允,董長(zhǎng)和,楊敏云,等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物衍生骨修復(fù)脛骨缺損[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(13):76-78.

[2] 孫 勇,肖建德.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在骨組織工程中的應(yīng)用[J].國(guó)際骨科學(xué)雜志,2007,28(6):393-397.

[3] 劉順振,侯玉東.骨組織工程支架材料的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(42):7911-7914.

[4] 李東亞,鄭 欣,陳一心,等.骨組織工程支架材料應(yīng)用于大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].創(chuàng)傷外科雜志,2013,15(1):87-90.

本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.21.3977.02

范建楠