曲音波，畢衍金，李雪芝，趙淑晶，韓小龍，閆俊卿，杜健，李宏偉

1.山東大學微生物技術國家重點實驗室，國家糖工程技術研究中心，濟南 250100

2.山東泉林紙業(yè)有限責任公司科研所，聊城 252800

纖維素乙醇產業(yè)化的突破口
——集成就地產酶工藝的多聯(lián)產生物精煉

曲音波1，畢衍金2，李雪芝1，趙淑晶2，韓小龍1，閆俊卿2，杜健1，李宏偉2

1.山東大學微生物技術國家重點實驗室，國家糖工程技術研究中心，濟南 250100

2.山東泉林紙業(yè)有限責任公司科研所，聊城 252800

曲音波，教授，博士生導師。曾任中國微生物學會副理事長，亞洲生物技術聯(lián)合會咨詢委員?，F為亞洲生物技術聯(lián)合會生物能源與生物煉制分會理事，《微生物學報》副主編。長期從事纖維素酶研究和可再生資源微生物轉化技術開發(fā)，先后擔任過“973”項目首席科學家和國家自然科學基金重點項目負責人，主持或參加了20余項國家或省部級以上科研項目。發(fā)表研究論文360余篇。主持或參與編寫著作10余部。篩選到的青霉纖維素酶抗降解物阻遏高產突變株已被用于工業(yè)酶制劑生產。先后獲得國家科技進步二等獎1項，國家技術發(fā)明二等獎和四等獎各1項，省部級二等以上科技獎勵8項，國家發(fā)明專利13項，并獲得中國發(fā)明專利優(yōu)秀獎1項。E-mail：quyinbo@sdu.edu.cn

纖維素乙醇產業(yè)化在可再生資源利用、環(huán)境污染控制、農業(yè)產業(yè)鏈延伸、農村經濟發(fā)展、農民就業(yè)等方面均可發(fā)揮重大作用。但由于生產成本仍然偏高，至今未能實現大規(guī)模的產業(yè)化。把集成了就地產酶過程的多聯(lián)產生物精煉技術選擇為實現纖維素乙醇大規(guī)模產業(yè)化的突破口，可以大幅度降低酶解產糖的用酶成本。同時，引進精煉概念，提高了纖維素乙醇生產與同類糧食和石油產品的經濟競爭力。玉米芯生物精煉聯(lián)產木糖產品-乙醇-木質素工藝技術，成功實現了纖維素乙醇工業(yè)化生產，最近正在合作開發(fā)秸稈生物精煉聯(lián)產紙漿-乙醇-黃腐酸肥新技術，有望實現更大規(guī)模的工業(yè)生產。

纖維素乙醇；集成生物精煉；就地產酶；纖維素酶；戊糖/己糖共發(fā)酵

1 纖維素乙醇研究的意義和開發(fā)進展

通過纖維素乙醇的規(guī)模化生產，可以大規(guī)模開發(fā)未被充分利用的秸稈等可再生性的農林廢棄物資源，防止秸稈就地焚燒造成的空氣污染。同時，通過推廣含10%～20%乙醇的汽油醇用作車用燃料，可以提高汽油的辛烷值，減少汽車尾氣中的氮氧化物、硫氧化物及微細顆粒物。這些都可以協(xié)助減少霧霾的形成。來源于太陽光合作用吸收二氧化碳生產的纖維素乙醇屬于碳中性的清潔燃料，燃燒過程不會造成二氧化碳的凈排放，大規(guī)模應用可以減少化石能源利用和減緩氣候變暖，保護生態(tài)環(huán)境。另外，發(fā)展纖維素乙醇產業(yè)還可以在不影響糧食安全供應的基礎上，延長農業(yè)生產的產業(yè)鏈、安排農民就業(yè)和增收、促進農村經濟發(fā)展，為解決我國的三農問題提供幫助。從人類歷史發(fā)展的長遠角度來看，纖維素乙醇生產技術的成熟還可以推動可再生的木質纖維素資源轉化生產液體燃料和生物基化學品巨型產業(yè)的形成和發(fā)展，為人類應對石油與煤炭等一次性化石資源的逐漸耗竭，實現以可再生資源利用為基礎的綠色循環(huán)生物經濟的永續(xù)發(fā)展打下基礎。因而，其對人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要意義是不言而喻的，受到了世界各國的廣泛重視，并對其研發(fā)過程給與了大力的支持。

然而，經過了30多年堅持不懈的艱苦努力，纖維素乙醇至今卻仍未能實現大規(guī)模的產業(yè)化。以致纖維素乙醇被某些人戲稱為“夢幻燃料”，不少人已不再相信“狼來了”的呼喚，放棄了繼續(xù)的努力或對進一步研發(fā)的支持。目前，纖維素乙醇生產的研發(fā)過程已經取得了巨大進展，并已經開始進入了產業(yè)化階段。稀酸、汽爆、水熱、氨法等多種預處理技術都能使纖維素和半纖維素的水解轉化率達到80%以上；諾維信等公司開發(fā)的第二代、第三代（Cellic CTec2、Cellic CTec3）等復合纖維降解酶制劑的噸乙醇用酶成本已經達到了經濟上可以接受的水平；經過代謝網絡工程反復改造的酵母工程菌株已經可以實現木糖-葡萄糖的共發(fā)酵。在此基礎上，意大利M＆G集團與諾維信合作建立的貝塔可再生公司（Beta Renewables）早在2012年底就在意大利克雷什迪諾（Crescentino）建成了年產4萬～6萬噸級工業(yè)規(guī)模的纖維素乙醇工廠，并于2013年10月宣布投產。2014年9月POET-DSM先進生物燃料有限公司，也在美國愛荷華州（Emmetsburg，Iowa）為美國第一家商業(yè)規(guī)模的纖維素乙醇工廠舉辦了開工典禮。此后，美國、巴西等國又有多家企業(yè)宣稱他們的工業(yè)規(guī)模生產裝置已經投入試產[1]。然而，多方面因素造成石油價格在2014年出現暴跌，造成燃料乙醇價格快速跌落，沉重打擊了纖維素乙醇的產業(yè)化進程，加上新技術在放大過程中必然會出現的一些工程上的問題，使這些商業(yè)化裝置在投入試產后多半未能實現長時間連續(xù)生產或達到預期的產能。

總體來說，多家工業(yè)規(guī)模纖維素乙醇生產裝置的成功建成，說明了由纖維素資源生產液體燃料和化學品技術的產業(yè)化已邁出了實質性的關鍵一步，已經處于大規(guī)模產業(yè)化應用的起步階段。進一步改進和完善纖維素乙醇生產技術，提高其在經濟上的競爭力成為纖維素乙醇產業(yè)化成敗的關鍵。在分析和比較已有研究成果的基礎上，筆者研究團隊把集成就地產酶過程的多產物聯(lián)產生物精煉技術選擇為實現纖維素乙醇大規(guī)模產業(yè)化的突破口，開展了積極探索。

2 就地產酶技術與纖維素乙醇生產的集成

由于天然木質纖維素材料的復雜結構是植物通過億萬年進化后用來保護自身不被微生物及其酶系統(tǒng)攻擊的防護措施，纖維素被嚴密地包裹在木質素和半纖維素等組成的保護層中，加上纖維素本身能形成緊密的結晶結構，使纖維素酶解的比活力非常低。盡管經過適當的預處理后使其可降解性有明顯改善，但是纖維素酶解過程需要的用酶量仍然遠遠大于糧食乙醇的用酶量。通常情況下，1噸玉米淀粉原料水解時只需要約0.2～0.3kg淀粉酶蛋白，而每噸纖維素原料水解時往往需要10～50kg酶蛋白，用酶量高出了數十乃至上百倍。這在提高了纖維素乙醇生產成本的同時，也給大規(guī)模纖維素乙醇企業(yè)的酶制劑穩(wěn)定供應制造了難題。把發(fā)酵生產出來的粗酶液加工成可儲存運輸的商品酶制劑需要復雜的后加工工藝過程（除菌、濃縮、防腐等），在增加生產費用的同時還造成一定的損耗，加上包裝、運輸等費用，顯著增加了用酶的成本。把產酶過程集成進纖維素生物煉制系統(tǒng)內，可以去除酶制劑生產的后處理過程和保質、儲運的成本及損耗，并可通過就地利用纖維素加工中產生的廢棄物或副產物配制廉價的培養(yǎng)基，通過企業(yè)內部的熱電平衡來進一步降低產酶的成本，從而大幅度地降低酶解產糖的用酶成本。德國克萊恩（Clariant）公司在巴伐利亞州建立了年產1000噸纖維素乙醇的示范工廠，在其多年實驗運行中對集成現場產酶的優(yōu)勢進行了詳細的比較分析[2]，發(fā)現可以使纖維素酶在乙醇總生產成本中的比例從外購商品酶時的35%，或異地產酶時的28%，降低到集成現場產酶時的10%，而且可以做到成本和風險可控，使纖維素乙醇具備了市場競爭性。

3 理性構建纖維素酶高產菌株和高效降解酶系

采用現場就地產酶技術需要乙醇生產企業(yè)具有高效纖維素酶系的高產菌株和生產技術。山東大學長期從事真菌纖維素酶的相關基礎和生產技術研究，通過篩選誘變獲得了一批纖維素酶高產菌株[3]。其中一些青霉菌株已被用于纖維素酶制劑的生產，在食品、飼料等工業(yè)領域得到了應用。近年來，在國家“973”項目支持下，筆者研究團隊對3株青霉菌株進行了基因組學、分泌蛋白組學和轉錄組學的系統(tǒng)分析[4]。研究發(fā)現，所謂纖維素酶是由降解纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等數十種木質纖維素酶組分組成的復雜酶系統(tǒng)，各種酶系組分通過協(xié)同作用來共同完成對植物纖維素類底物的高效降解。與出發(fā)菌株相比，纖維素酶高產突變株不僅胞外蛋白質的產量有所提高，而且纖維素、半纖維素降解酶系主要組分的比例均同步明顯提高，而淀粉酶和蛋白酶等其他酶系組分的比例則同時明顯下降，使纖維素降解酶系的比活力得到大幅度提高。因此筆者研究團隊推測，不同酶系中各基因的表達是在轉錄水平上協(xié)同調控的[5]。通過對出發(fā)菌株與高產突變菌株中可能相關的轉錄調控因子基因堿基序列的比較，發(fā)現因碳降解物阻遏因子CreA的結構基因上缺失了一個堿基而造成了移碼突變，使其部分喪失了介導降解物阻遏效應的功能，是突變體纖維素酶產量提高的主要因素。而在淀粉酶激活因子ArmR和蛋白酶激活因子PrtT的基因啟動子部位發(fā)現的堿基突變，則可以影響兩種轉錄激活因子的表達量，進而導致淀粉酶和蛋白酶產量的下降，間接提高了纖維素酶系的比活力。為了闡明是否還有轉錄調控因子會影響纖維素酶系的合成，筆者研究團隊利用生物信息學分析了青霉的基因組，共預測到529個可能的轉錄因子基因，進而使用已建立的高效基因敲除平臺[6]，對全部轉錄因子進行了單基因敲除，建立起了含470個突變體的轉錄因子突變體文庫。通過對文庫的篩選鑒定，發(fā)現了20種與纖維素酶合成調控相關的轉錄因子[7]。其中，ClrB在纖維素酶合成中發(fā)揮關鍵的表達激活作用；新發(fā)現的ClrB-2也發(fā)揮一定的協(xié)同激活作用；XlnR主要促進半纖維素酶的基因表達，同時在纖維素酶基因表達中與ClrB有協(xié)同作用；而AmyR本身的表達受ClrB的阻遏，同時參與了CreA對纖維素酶合成的抑制。多種轉錄調控因子之間有直接的相互作用，共同完成了對碳源利用相關基因表達的精確反饋調控。

各轉錄因子自身的表達則受到不同碳源的誘導或阻遏。葡萄糖等易代謝碳源的存在會阻遏復雜多糖降解酶類的合成。而組成型合成的少量纖維素酶降解胞外的纖維素所產生的纖維二糖等纖維寡糖，通過纖維寡糖轉運蛋白運輸到細胞內后，則會通過相關轉錄因子，誘導纖維素降解相關酶基因的表達合成（圖1）。對纖維寡糖轉運蛋白的過表達，特別是對胞內β-葡萄糖苷酶基因的敲除，可以顯著提高纖維素酶的產量[8-9]。

圖1 纖維素酶基因合成調控機制CBH—外切纖維素酶；EG—內切纖維素酶；BG—β-葡萄糖苷酶；Bgl2—胞內β-葡萄糖苷酶2；GT—葡萄糖轉運蛋白；CDT—纖維寡糖轉運蛋白；CCR—碳降解物阻遏；CreA—碳降解物阻遏因子；AmyR—淀粉酶激活因子；ClrB—纖維素酶激活因子；XlnR—半纖維素酶激活因子；CK2—酪蛋白激酶2；ATP—腺三磷；cAMP—環(huán)腺一磷

在較深入地了解纖維素酶合成調控機制的基礎上，筆者研究團隊通過對基因的多步遺傳操作（如過表達ClrB和XlnR，敲除CreA和Bgl2）[7，10]，重構了青霉菌的纖維素酶合成調控網絡，大幅度提高了纖維素酶的生產效率。同時，通過在高產菌株中過表達特定的酶系組分（如β-葡萄糖苷酶），明顯改進了酶系的纖維素酶解效率[11]，為就地產酶提供了優(yōu)良產酶菌株。

4 木質纖維素多產品聯(lián)產的生物精煉技術

石化產業(yè)獲得成功的根本經驗之一是利用催化裂化等技術將原油精煉成為多種石化產品，滿足了多樣的市場需求，實現了產品價值的最大化。秸稈等植物生物質的組成成分其實比原油更加復雜，只利用其中的部分組分轉化生產廉價的液體燃料，而不將其他組分也轉化成相對高值的產品，經濟上很難具備競爭力。為此，筆者研究團隊于2005年在國際上率先提出了玉米芯生物精煉的集成創(chuàng)新技術：先從玉米芯中提取半纖維素，生產低聚木糖、木糖醇等高附加值產品，再用木糖渣就地生產纖維素酶和燃料乙醇，殘渣中的木質素也提取出來用于生產化工產品，從而實現原料組分全利用、產物多樣化、價值最大化。技術經濟分析顯示，其乙醇生產成本接近或低于糧食乙醇成本。新技術于2012年在山東龍力生物科技公司正式實現了工業(yè)化，成為國內首家、也是目前唯一一家獲得國家發(fā)展和改革委員會批準的纖維素乙醇生產企業(yè)，取得了良好的經濟和社會效益。然而，由于玉米芯生物精煉的主要盈利產品低聚木糖和木糖醇的市場規(guī)模不夠大，激烈的競爭造成了分散的小規(guī)模經營，木質素產品的推廣應用也需要時間，所以新技術一直未能得到廣泛推廣。進一步完善相關生產技術，努力擴大纖維原料種類和聯(lián)產產品種類，成為纖維素乙醇產業(yè)發(fā)展的新方向。例如，河南天冠集團提出了利用秸稈聯(lián)產燃料乙醇-沼氣/車用燃氣-熱/電-渣肥四類產品的新技術路線，建設了萬噸級示范工廠，進行了試生產。只是由于后幾類產品均不夠高值，仍在努力改進新技術和提高經濟競爭力。

最近，山東泉林紙業(yè)集團開發(fā)出了秸稈清潔制漿及其廢液肥料資源化利用新技術（獲國家技術發(fā)明二等獎），并成功在工業(yè)規(guī)模上獲得了推廣應用，取得了良好的經濟和社會效益。山東大學研究團隊也在高效纖維素酶高產菌株構建、戊糖/己糖共發(fā)酵釀酒酵母代謝工程改造[12]等方面獲得突破性進展。在此基礎上，目前山東大學研究團隊正在與泉林紙業(yè)合作，開發(fā)新的利用秸稈聯(lián)產本色紙漿-燃料乙醇-黃腐酸肥料的生物精煉技術（圖2）。

圖2 本色紙漿-燃料乙醇-黃腐酸肥料聯(lián)產的生物精煉技術路線

由于纖維素酶生產可以就地取材，利用自產的少量預處理漿和亞銨制漿黑液（含有大量能誘導產酶的纖維素和半纖維素來源的寡糖及殘銨等營養(yǎng)物）配制廉價的培養(yǎng)基，結合采用流加補料培養(yǎng)等新型發(fā)酵技術，可使纖維素乙醇的酶解用酶成本降到很低。同時，通過戊糖和己糖同步糖化共發(fā)酵，可以大幅度提高原料的乙醇得率和發(fā)酵液的乙醇濃度。實驗室實驗結果的初步分析顯示，新技術的經濟可行性明顯提高。目前，企業(yè)正在積極籌備開展中試放大研究。新技術非常契合國家“十三五”發(fā)展規(guī)劃中實現秸稈綜合利用85%以上、大力發(fā)展纖維素乙醇等目標要求，且具有技術已經比較成熟、3種產品（紙漿、乙醇和肥料）均有巨大市場的明顯優(yōu)勢，具有良好的發(fā)展前景。

［1］ 曲音波，王祿山，劉國棟，等.非糧生 物質煉制技術——木質纖維素生物降解機理及其酶系合成調控[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2017：6-7.

［2］ RARBACH M. Process integrated enzyme production：the costefficiert way to commercially viable 2G cellulosic ethanol[EB/ OL].（2017-01-23）[2017-05-19]. http：//www.biofuelsdigest.com/ bdigest/2017/01/23/process-integrated-enzyme-production-the-costeff cient-way-to-commercially-viable-2g-cellulosic-ethanol/.

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Breakthrough point for commercialization of cellulosic ethanol：Integrated biorefinery with on-site cellulase production

QU Yinbo1， BI Yanjin2， LI Xuezhi1，ZHAO Shujing2， HAN Xiaolong1，YAN Junqing2，DU Jian1，LI Hongwei2

1. State Key Laboratory of Microbial Technology, National Glycoengineering Research Center, Shandong University, Jinan 250100, China
2. Institute of Science and Technology, Shandong Tranlin Group, Liaocheng 252800, China

Cellulose ethanol industry can play a signif cant role in the use of renewable resources, environmental pollution control, agricultural industry chain extension, the development of rural economy, and farmers’ employment. However, its production cost is still high and so far hasn’ t achieved large-scale industrialization. We have developed integrated multiproducts bioref nery with on-site enzyme production technology to achieve a breakthrough in large-scale industrialization of cellulosic ethanol. At the same time, the concept of refining to maximize the interests and improving the economic competitiveness of comprehensive processing with that of grain and oil products is introduced. Based on the development of corncob bioref nery to produce xylose products-ethanol-lignin, cellulosic ethanol production was industrialized successfully. Recently, a straw bioref nery process to produce pulp-ethanol-fulvic acid fertilizer together is being explored, with expect to establish a larger-scale lignocellulosic bioref nery industry.

cellulosic ethanol; integrated biorefinery; on-site enzyme production; cellulases; pentose/hexose cofermentation

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.03.005