高澤成，梁春年，吳曉云，李明娜，張志飛，閻 萍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

牦牛皮膚中調(diào)控毛色基因表達(dá)定量和黑色素細(xì)胞組織學(xué)分析

高澤成1，2，梁春年2，吳曉云2，李明娜2，張志飛2，閻 萍1，2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

旨在通過(guò)分子水平和組織學(xué)水平闡明牦牛不同被毛顏色的機(jī)理。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)皮膚組織中決定色素形成通路中的主效基因：鼠灰色基因(Agouti signaling protein gene(ASIP)，Agouti)、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor，MITF)、黑色素皮質(zhì)素受體1基因(Melanocortin 1 receptor，MC1R)和酪氨酸酶基因(Tyrosinasegene，TYR)表達(dá)量。結(jié)果表明：MC1R表達(dá)量在黑色毛色高于白色毛色；MITF表達(dá)量在黑色毛色與白色毛色中差異明顯；ASIP表達(dá)量在白色毛色和黑色毛色中差異不顯著；TYR表達(dá)量在天祝純白被毛中表達(dá)量是大通純黑被毛的2.87倍，這與有色被毛高表達(dá)的結(jié)果相反，TYR的表達(dá)量對(duì)牦牛黑色素的合成影響有待深入研究。采用石蠟切片制作方法，用HE和甲苯胺藍(lán)染色。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)牦牛毛囊是由毛鞘、毛乳頭和毛球外面周?chē)慕Y(jié)締組織形成的。在天祝白牦牛的表皮和毛囊周?chē)l(fā)現(xiàn)分布著大量的黑色素細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有少量的黑色素顆粒存在。大通牦牛的毛囊和表皮黑色素細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有黑色素的存在。黑色被毛毛囊中與毛發(fā)相連毛乳頭附近的黑色素含量比毛囊周?chē)渌课缓扛?。大通牦牛的毛囊群比天祝牦牛毛囊群密集，毛囊的直徑比天祝長(zhǎng)，毛發(fā)較粗。大通牦牛毛囊周?chē)谏丶?xì)胞比天祝白牦牛密集，細(xì)胞核大，而且更為明顯。

牦牛;毛色基因;定量表達(dá);石蠟切片;黑色素

動(dòng)物的毛發(fā)是由毛囊發(fā)育生長(zhǎng)的皮膚衍生物，毛色是動(dòng)物重要特征之一，它在確定雜交組合、品種純度和親緣關(guān)系以及評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量等方面均有很強(qiáng)的使用價(jià)值，因此，在組織中的差異性表達(dá)及其不同基因相互作用的研究有助于更深地了解毛色形成的分子機(jī)理。有研究發(fā)現(xiàn)毛色與生長(zhǎng)速度、瘦肉率及對(duì)疫病的抵抗能力等生產(chǎn)性能有直接關(guān)系[1]。毛囊解剖學(xué)、毛囊形態(tài)發(fā)生學(xué)研究已經(jīng)證明，哺乳動(dòng)物毛發(fā)著色主要來(lái)源于毛球部毛母質(zhì)細(xì)胞間成熟黑色素細(xì)胞合成的色素[2]。黑色素細(xì)胞是人類(lèi)和其他脊椎動(dòng)物皮膚產(chǎn)生和維持色素的主要細(xì)胞，起源于神經(jīng)嵴。黑色素細(xì)胞在胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸移至表層和毛囊等部位。黑色素細(xì)胞在胚胎早期，分布于真皮層，至妊娠后期真皮層的黑色素細(xì)胞基本消失，此時(shí)黑色素細(xì)胞主要分布于表皮和毛囊中。

黑色素皮質(zhì)素受體-1(MC1R)和鼠灰色基因(ASIP)的表達(dá)量與毛發(fā)的顏色有著相關(guān)性。ASIP能夠抑制黑色素細(xì)胞刺激素(α-MSH)誘導(dǎo)的小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)基因的表達(dá)以及MITF蛋白與酪氨酸基因(TYR)啟動(dòng)子的結(jié)合，從而使酪氨酸表達(dá)下調(diào)，最終導(dǎo)致真黑色素合成減少，褐黑色素生成[3]。研究表明MITF在調(diào)節(jié)黑色素的生成過(guò)程中起著重要的作用[4]。Zhu等[5]研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)羊駝MITF基因的表達(dá)量差異進(jìn)而影響被毛顏色不同。哺乳動(dòng)物的MC1R基因與皮膚色素沉積密切相關(guān)，主要在毛囊和皮膚黑色素細(xì)胞中表達(dá)[6]。在MC1R功能喪失或MC1R受到與其拮抗的ASIP蛋白抑制時(shí)，酪氨酸酶不能被激活而保持較低活性，造成真黑色素減少，出現(xiàn)棕色或紅色等較淺的毛色性狀[7]。任玉紅等[8]研究發(fā)現(xiàn)MC1R在有色被毛羊駝組織中的表達(dá)量高于白色組織。MC1R基因在不同被毛顏色哈薩克綿羊皮膚組織中均有表達(dá)，且在黑色被毛皮膚組織中的表達(dá)量最高，棕色次之，白色最低。TYR是黑色素形成的關(guān)鍵酶也是決速酶之一，它的表達(dá)活性決定著黑色素合成的數(shù)量及速度。當(dāng)紫外光照射刺激時(shí)，TYR表達(dá)量增加可以導(dǎo)致黑色素合成增加[9]。

對(duì)于有色毛發(fā)來(lái)說(shuō)，黑色素合成發(fā)生于毛囊生長(zhǎng)期，毛球部的黑色細(xì)胞合成黑色素顆粒，轉(zhuǎn)運(yùn)到毛干皮質(zhì)細(xì)胞。黑色素顆粒的多少、顆粒性狀及分布決定毛發(fā)的顏色。生長(zhǎng)期結(jié)束的特征是黑色素細(xì)胞樹(shù)突收縮，黑色素生成停止[10]。黑色素細(xì)胞主要分布在皮膚和毛囊中，視網(wǎng)膜上皮、虹膜、眼葡萄膜、軟腦膜和內(nèi)耳中也有少量分布[11-12]。毛囊黑色素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成毛色，具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性[13]。謝光躍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞在烏骨羊表皮基底層和毛囊中大量分布，并且黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)是黑色皮膚和黑色毛發(fā)的主要來(lái)源。

牦牛是青藏高原與藏民族的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，牦牛被譽(yù)為“高原之舟”，它以極強(qiáng)的生命力和適應(yīng)性來(lái)豐富著青藏高原這一地區(qū)的物質(zhì)和文化生活。牦牛毛、絨制品深受喜愛(ài)，因此，研究牦牛毛色有著重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

家畜禽遺傳資源保種場(chǎng)青海省大通種牛場(chǎng)取樣，6頭純黑色被毛牦牛和4頭黑白花被毛牦牛；天祝牦牛：11月甘肅省天?？h取樣，6頭純白色被毛牦牛和3頭黑白花被毛牦牛。皮膚組織樣品采集：大通純黑色被毛和天祝純白色被毛均取自背部左側(cè)；黑白花被毛分別取樣黑色區(qū)域和白色區(qū)域皮膚組織樣。均取2 cm×5 cm皮膚組織樣，-80 ℃液氮保存。分別標(biāo)注：大通純黑被毛(DH)、大通黑白花黑色被毛(DHH)、大通黑白花白色被毛(DHB)、天祝純白色被毛(TB)、天祝黑白花黑色被毛(THB)、天祝黑白花白色被毛(THH)。3頭純黑色被毛大通牦牛和3頭純白色被毛天祝牦牛。大通純黑色被毛和天祝純白色被毛均取自背部左側(cè)。均取5 cm×5 cm皮膚組織樣，生理鹽水沖洗后放入福爾馬林固定液中保存。

1.2 儀器設(shè)備

超速冷凍離心機(jī)、DEPC水、NanNoDrop 2000(Thermal)、Peltier Thermal Cycler(Bio-RAD)、Real-time PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)、TRIzol(TaKaRa)、BYY-6C型電泳儀、Gel Image System(Tanon 2500)、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)、TaKaRa熒光定量試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、顯微鏡(Leica DM5500B)、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、石蠟切片機(jī)(Leica RM2235)、石蠟包埋機(jī)(Leica EG1150H)、組織全自動(dòng)脫水機(jī)(Leica ASP300S)、載玻片、蓋玻片、染缸、干燥箱、中性樹(shù)脂、梯度酒精(100%，95%，90%，80%，70%)、二甲苯、蒸餾水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 皮膚組織總mRNA提取和反轉(zhuǎn)錄 液氮中取出保存皮膚組織樣80～100 mg用TRIzol法提取樣品總mRNA。然后用NanNoDrop 2000總mRNA濃度測(cè)定;再用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總mRNA提取質(zhì)量；最后總mRNA稀釋到 500 ng/μL保存到-80 ℃保存箱。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行，除去基因組DNA反應(yīng)：首先在每支PCR管中加入DNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、總mRNA 1 μL，然后加入RNase Free gH2O 使PCR管總體積達(dá)到10 μL，上述步驟在冰上進(jìn)行；最后42 ℃、2 min進(jìn)行除去基因組DNA反應(yīng)，4 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將上述反應(yīng)液PCR管中依次加入PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 24 μL、RNase Free gH2O 4 μL，上述反應(yīng)在冰上進(jìn)行；然后在37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應(yīng)條件下進(jìn)行；反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存待用。

1.3.3 熒光定量 熒光定量引物合成，參考NCBI中所收錄的牦牛和牛的基因。內(nèi)參基因GAPDH和ASIP、MITF、MC1R、TYR4種mRNA基因序列。用Primer 5.0和Oligo 6.0設(shè)計(jì)內(nèi)參引物和熒光定量引物，引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成(表1)。參照熒光定量試劑盒在熒光定量PCR板每孔均加入SYBR Premix Ex TaqⅡ5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 3 μL；反應(yīng)程序設(shè)置95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。加熔解曲線程序，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。其中ΔCT目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT目的基因-△CT大通純黑被毛。

1.3.5 石蠟切片 取樣、修塊，大小為4 mm×4 mm×3 mm；脫水：自來(lái)水洗24 h，5%苯酚(24 h)使組織軟化，脫水70%(1)、80%(1)、90%(2)、95%(2)、100%(Ⅰ、Ⅱ各1 h)，二甲苯透明(Ⅰ、Ⅱ各1 h)，浸蠟(24 h)、包埋、修塊、切片、展片(40 ℃)。

1.3.6 HE染色 二甲苯(Ⅰ、Ⅱ各5 min)，100%(Ⅰ、Ⅱ各5 min)，95%(3 min)，80%(2 min)，蒸餾水洗 5 min，蘇木素染色 5 min，自來(lái)水5 min，分化液分化30 s，蒸餾水浸泡15 min，伊紅染色90 s，蒸餾水洗10 min，梯度酒精脫各1 min：70%，80%，90%，100%(Ⅰ、Ⅱ)，二甲苯透明各1 min(Ⅰ、Ⅱ)，晾干，中性樹(shù)脂封片。

1.3.7 甲苯胺藍(lán)染色 皮膚組織切片二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)脫蠟，梯度酒精脫水70%，80%，90%，100%(Ⅰ、Ⅱ)，0.5%甲苯胺藍(lán)染色15 min，蒸餾水洗3次，每次1 min，95%，100%乙醇快速脫水(將切片放入其中蘸洗10次左右)，二甲苯透明3次(5 min/次)，晾干，中性樹(shù)脂封片，鏡下觀察。

表1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取總mRNA濃度和質(zhì)量測(cè)定

用NanoDrop2000測(cè)定提取總RNA樣品濃度為450～1 200 ng/μL，OD值A(chǔ)260/280為1.92～2.09，A260/230為2.12～2.17，符合要求；總mRNA樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠帶呈現(xiàn)清晰的28S、18S和5S 3條帶，并且28S條帶亮度是18S亮度的2倍，結(jié)果表明提取總mRNA完整(圖1)。

2.2 熒光定量

圖1 總mRNA瓊脂糖凝膠電泳

在所有檢測(cè)樣本中ASIP基因在DHB中表達(dá)含量較其他樣本高；MITF基因在DH和THH高表達(dá)，TB和THB低表達(dá)；MC1R基因在THH、DHH和THB高表達(dá)，TB中表達(dá)含量低；TYR基因表達(dá)量在DHH和THH相對(duì)較高(圖2)，TYR表達(dá)量在天祝純白被毛中表達(dá)量是大通純黑被毛的2.87倍。

DH.大通純黑被毛;DHH.大通黑白花黑色被毛;DHB.大通黑白花白色被毛;TB.天祝純白被毛;THB.天祝黑白花黑色被毛;THH.天祝黑白花白色被毛。DH.Datong pure black coat; DHH. Datong piebald black coat; DHB. Datong piebald white coat; TB. Tianzhu white coat;THB. Tianzhu piebald black coat; THH. Tianzhu piebald white coat.

2.3 甲苯胺藍(lán)染色

甲苯胺藍(lán)是一種堿性染料，屬于噻嗪類(lèi)染料，可作為細(xì)胞核染劑[15]。2種被毛顏色皮膚組織均能較好的顯示牦牛皮膚的黑色素分布和皮膚分層，是分析黑色素細(xì)胞和黑色素的研究關(guān)鍵。顯微鏡下清晰看到毛囊、毛發(fā)的結(jié)構(gòu)，黑色素的分布。在毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中，基部的黑色素細(xì)胞不能看到有黑色素顆粒的生成，毛乳頭細(xì)胞位于毛球中央，是由大量的結(jié)締組織構(gòu)成，主要作用是供給毛發(fā)營(yíng)養(yǎng)，從而保證了細(xì)胞不間斷得分裂增殖。在天祝白牦牛的毛囊染色發(fā)現(xiàn)毛發(fā)的根部容易被染色劑著色，周?chē)暮谏丶?xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生黑色素顆粒。大通牦牛毛囊周?chē)谏丶?xì)胞比天祝白牦牛密集，細(xì)胞核大，而且更為明顯。毛囊是由毛鞘、毛乳頭和毛球外面周?chē)慕Y(jié)締組織形成的。大通牦牛毛囊周?chē)捅砥ぶ械暮谏丶?xì)胞均產(chǎn)生大量黑色素顆粒，數(shù)量多于天祝白牦牛(圖3)。

A.大通牦牛毛發(fā)生長(zhǎng)初期；B.大通牦牛成熟的毛發(fā)；C.大通牦牛毛囊與皮膚表皮結(jié)構(gòu)；D.大通牦牛毛囊與皮膚表皮結(jié)構(gòu)；E.天祝白色被毛牦牛毛囊結(jié)構(gòu)；F.成熟毛囊及毛發(fā)結(jié)構(gòu)；1.毛囊周黑色素細(xì)胞；2.黑色素顆粒；3.毛乳頭；黑色箭頭指示黑色素顆粒。

A.Datong yak wool happening grows initial stage; B.Datong yak mature hairs; C.Datong yak hair follicle and skin epidermis structure; D.Datong yak hair follicle and skin epidermis structure; E.Tianzhu white coat yak hair follicle structure; F.Mature follicle and hair structure; 1.Week of hair follicle melanocytes; 2.Melanin granules; 3. Hair papilla;Black arrow means the melanin granules.

圖3 大通黑色被毛牦牛和天祝白色被毛牦牛甲苯胺藍(lán)染色

Fig.3 Datong black coat yak and Tianzhu white coat toluidine blue staining

2.4 HE染色

普通的HE染色，黑色素不能清楚地顯示，但能清楚地顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)[15]。在天祝白牦牛的表皮和毛囊周?chē)暮谏丶?xì)胞分布密集。大通牦牛毛囊中與毛發(fā)相連毛乳頭附近的黑色素含量比毛囊周?chē)渌课缓扛?。在同一放大倍?shù)視野下發(fā)現(xiàn)，大通牦牛的毛囊群比天祝白牦牛毛囊群密集，毛囊的直徑比天祝白牦牛長(zhǎng)，毛發(fā)粗大。表皮黑色素細(xì)胞不規(guī)則，它們一般有形成空泡的趨勢(shì)，細(xì)胞核較大，成熟的黑色素細(xì)胞還有不明顯的樹(shù)突，細(xì)胞相互接觸，形成黑色素細(xì)胞簇，有的具有非典型的細(xì)胞核或者整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)出多形性，部分細(xì)胞還存在于真皮和表皮連接處的上方(圖4)。

甲苯胺藍(lán)染色比HE染色較容易看到黑色素顆粒的分布，但是不能很好地對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行染色；HE染色能充分得對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行染色，能夠看到黑色素細(xì)胞的分布和形狀大小、細(xì)胞結(jié)構(gòu)。黑色素在正常情況下分散在皮膚、毛發(fā)、眼睛虹膜及脈絡(luò)膜等器官內(nèi)，皮膚的黑色素細(xì)胞位于表皮基底層細(xì)胞之間，無(wú)細(xì)胞間橋和張力原纖維，細(xì)胞體積較大，大小不均勻，有圓形、橢圓形、紡錘形等；細(xì)胞核大致呈圓形或卵圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量黑色素。黑色素細(xì)胞出現(xiàn)在表皮基底細(xì)胞之間和其上下方。另外也見(jiàn)于毛囊中。

A.天祝白牦牛皮膚組織切片；B.大通牦牛皮膚組織切片；C.天祝白牦牛毛囊；D.大通牦牛毛囊及黑色毛發(fā)；E.大通黑色被毛毛囊群；F.天祝白色被毛毛囊群；黑色箭頭指示黑色素顆粒。

3 討論與結(jié)論

3.1 ASIP基因相對(duì)表達(dá)量與毛色的關(guān)系

ASIP基因編碼的信號(hào)蛋白作用于毛囊微環(huán)境，阻止α-MSH與MC1R的結(jié)合，從而拮抗黑色素的產(chǎn)生[16]。吳偉偉[17]在山羊研究中發(fā)現(xiàn)ASIP在皮膚組織表達(dá)量白色最高，黑色最低。在不同被毛顏色太行山羊研究中發(fā)現(xiàn)，ASIP基因表達(dá)量不同。在羊駝皮膚中ASIP基因均有表達(dá)，但其表達(dá)水平與被毛顏色不同而表現(xiàn)出不同。在白色羊駝中表達(dá)量最高，不同毛色羊駝皮膚中ASIP基因表達(dá)量存在顯著差異[18]。本研究顯示ASIP基因高表達(dá)，MC1R基因會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)，ASIP基因與MC1R基因是負(fù)相關(guān)。DHB中ASIP基因表達(dá)量最高，相反MC1R基因表達(dá)量白色被毛低于黑色被毛。這與毛色調(diào)控通路中ASIP的高表達(dá)抑制MC1R的表達(dá)相一致。

3.2 MITF基因相對(duì)表達(dá)量與毛色的關(guān)系

MITF可以調(diào)控TYR基因家族的表達(dá)，參與黑色素生成調(diào)控。ASIP能夠抑制α-MSH誘導(dǎo)MITF基因的表達(dá)和MITF與TYR基因啟動(dòng)子Mbox的結(jié)合，導(dǎo)致TYR表達(dá)下調(diào)，最終黑色素合成減少[19]。MITF在牦牛皮膚組織中mRNA表達(dá)量黑色顯著高于其他皮膚(P<0.01)。當(dāng)ASIP基因在DH、THH出現(xiàn)低表達(dá)時(shí)，對(duì)應(yīng)的組織樣中的MITF基因出現(xiàn)高表達(dá)；ASIP基因在DHB中高表達(dá)時(shí)，DHB中MITF基因呈現(xiàn)低表達(dá)。ASIP基因?qū)ITF基因呈現(xiàn)抑制作用，符合ASIP對(duì)MITF抑制調(diào)控機(jī)理。

3.3 MC1R基因相對(duì)表達(dá)量與毛色的關(guān)系

MC1R基因是黑色素皮質(zhì)素受體1基因，當(dāng)上游的ASIP基因下調(diào)MC1R基因，通過(guò)氨基酸末端，降低TYR水平[20]，最終導(dǎo)致真黑色素合成終止，轉(zhuǎn)為合成褐黑色素。在羊駝中，棕色被毛皮膚中MC1R基因的表達(dá)量是白色被毛的4.32倍，差異極顯著[21]。對(duì)大通牦牛和天祝牦牛基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析顯示，MC1R在牦牛皮膚組織中mRNA表達(dá)量DHH、THH、THB顯著高于其他皮膚(P<0.05)，THH中表達(dá)量最高。本研究同樣MC1R基因在白色被毛皮膚中高表達(dá)。

3.4 TYR基因相對(duì)表達(dá)量與毛色的關(guān)系

TYR是合成黑色素的限速酶，其表達(dá)量的高低和活性直接影響著黑色素合成的種類(lèi)和數(shù)量。牛TYR基因被認(rèn)為是決定毛色位點(diǎn)之一[22]。高莉等[23]研究發(fā)現(xiàn)TYR基因在棕色羊駝中的表達(dá)量是白色羊駝的13.67倍。本研究的結(jié)果顯示TYR表達(dá)量在TB中表達(dá)量是DH的2.87倍，與高莉等[23]研究結(jié)果相反。TYR的高表達(dá)并沒(méi)有出現(xiàn)在有色被毛中，推斷不同物種及遺傳可能是產(chǎn)生結(jié)果不同的原因，有待深入研究。

3.5 甲苯胺藍(lán)染色與HE染色

在天祝純白色被毛牦牛中發(fā)現(xiàn)，盡管毛色純白，但是經(jīng)過(guò)染色發(fā)現(xiàn)在皮膚表皮中分布著數(shù)量較少的黑色素，牦牛生活在高海拔的地區(qū)，陽(yáng)光的紫外線照射強(qiáng)烈，為了適應(yīng)環(huán)境，皮膚表皮的黑色素可以吸收紫外線，減少傷害。年輕的黑色素細(xì)胞可分裂，皮膚的顏色決定于表皮細(xì)胞內(nèi)黑色素的多少，而不決定于黑色素細(xì)胞的數(shù)目[24]。表皮基底層的黑色素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成膚色，具有保護(hù)作用，使機(jī)體免受紫外線傷害[25]。在大通純黑色被毛牦牛中發(fā)現(xiàn)，有些皮膚表皮并沒(méi)有黑色素存在，但在毛囊周?chē)l(fā)現(xiàn)黑色素，毛囊的黑色素細(xì)胞與表皮的黑色素細(xì)胞的調(diào)控機(jī)理不同或許是傳導(dǎo)運(yùn)輸機(jī)理不同。黑色素細(xì)胞是黑色素的制造者，制成的黑色素沿黑色素細(xì)胞樹(shù)枝突沿途分送給角質(zhì)形成細(xì)胞。故后者不制造黑色素也含有。黑色素形如細(xì)小的棕色顆粒，存在于基底細(xì)胞之間。當(dāng)黑色素細(xì)胞向淺方位移位時(shí)，這種顆粒漸漸消失，故淺層細(xì)胞中僅有淺淡色。黑色素主要是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生和存儲(chǔ)，黑色素細(xì)胞根據(jù)特征不同分為3個(gè)群體：第一類(lèi)分布在表皮，它們只有少量黑色素沉積；第二類(lèi)分布于毛囊外根鞘中，它們的形態(tài)較小，沒(méi)有黑色素分泌，但是能夠增生分化；第三類(lèi)分布于毛球部，形態(tài)較大并且有大量黑色素分泌，但是卻不能增生分化[26-27]。毛囊黑色素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成毛色[13]。黑色素通過(guò)黑色素細(xì)胞樹(shù)枝狀突起，向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移，然后隨表皮細(xì)胞上行至角質(zhì)層，隨著老化的膠質(zhì)細(xì)胞脫落排出體外[28]。

毛乳頭是毛發(fā)發(fā)生的部位，在毛發(fā)生長(zhǎng)中，毛囊周?chē)暮谏丶?xì)胞產(chǎn)生黑色素在細(xì)胞之間傳導(dǎo)運(yùn)輸，經(jīng)黑色素運(yùn)輸?shù)脚c毛發(fā)直接相連的毛乳頭部位，因此，在毛囊中毛發(fā)的基部與毛乳頭相連接的部位黑色素密集。哺乳動(dòng)物毛發(fā)著色主要來(lái)源于毛球部毛母質(zhì)細(xì)胞間成熟黑色素細(xì)胞合成的色素[2]，而與毛囊所在皮膚組織中黑色素細(xì)胞的數(shù)量以及成熟度無(wú)關(guān)[29]。

3.6 結(jié)論

根據(jù)研究結(jié)果顯示，4種基因?qū)﹃笈２煌幻伾鸬揭欢ǖ恼{(diào)控作用。ASIP對(duì)MITF和MC1R基因起著拮抗作用，影響TYR基因的表達(dá)量及黑色素的合成。TYR的高表達(dá)對(duì)黑色素的合成具有重要作用。為了進(jìn)一步揭示牦牛不同被毛顏色的調(diào)控，需要結(jié)合基因的多態(tài)性和基因間相互關(guān)系進(jìn)一步研究。大通牦牛是野生牦牛與家養(yǎng)牦牛雜交品種，大通牦牛比天祝白牦牛生活海拔地區(qū)較高，環(huán)境更加惡劣復(fù)雜，粗大的毛囊可以生長(zhǎng)出較為粗長(zhǎng)的毛發(fā)，而且毛囊的密度比天祝白牦牛的密度大。這樣密集的毛發(fā)有利于大通牦牛適應(yīng)寒冷嚴(yán)酷的生活環(huán)境。

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Quantitative the Control Colour Gene Expression and the Melanin Cell Histologic Analysis in the Yak Skin

GAO Zecheng1，2，LIANG Chunnian2，WU Xiaoyun2，LI Mingna2， ZHANG Zhifei2，YAN Ping1，2

(1. College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;2.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS，Key Laboratory of Yak Breeding Engineering of Gansu Province，Lanzhou 730050，China)

The test was to through the molecular level and histological level shed light the different mechanism of coat color in yak. The experiment adopted the Real-time fluorescent quantitive PCR technique to detect the skin tissue determines the main effect of pigment formation pathway genes：gray mouse gene(agouti signaling protein gene (ASIP)，Agouti)，small eye malformation associated transcription factor (microphthalmia-associated transcription factor，MITF)，melanin cortisol receptor 1 gene(melanocortin receptor 1，MC1R) and tyrosine enzyme gene(tyrosinase gene，TYR) expression.The results showed that theMC1Rexpression quantity in black the color was higher than the white color;MITFexpression quantity in the black coat with white color difference was obvious;ASIPexpression quantity in white color and black color was not different;TYRexpression quantity in Tianzhu white coat was Datong pure black coat 2.87 times，this result was opposite the colored coat with high expression result，theTYRexpression quantity of yak melanin synthesis effect remained to be further research.Test made by paraffin section method，using HE and toluidine blue staining.Mammalian hair by hair follicle growth and development of derivatives，the melanothore mainly distributed in the epidermis and hair follicles.Through microscope found the yak hair follicle was made up of wool sheath,hair papilla and connective tissue around the group formed outside the bulb.A lot of melanothores were found in skin and around hair follicels in Tianzhu white yak，and found that there was a small amount of melanin granules.Melanin granules were found in hair follicle and epidermis melanothore in Datong yak.The melanin content near the hair dermal papilla was higher than other parts around the hair follicle in black coat hair follicle.Datong yak hair follicle group was more serried than Tianzhu yak hair follicle group，and the diameter of the hair follicle was longer than Tianzhu yak，with thicker hair.The melanin cell around the hair follicle of Datong yak was denser than Tianzhu yak，and the nucleus was larger，and more obvious.

Yak;Genes about colour;RT-PCR;Paraffin section;Melanin

2016-11-09

科技部科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD13B05)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛牦牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)

高澤成(1991-)，男，山東萊蕪人，在讀碩士，主要從事家畜分子生物學(xué)研究。

閻 萍(1963-)，女，山西運(yùn)城人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。

Q78；S823

A

1000-7091(2017)02-0117-07

10.7668/hbnxb.2017.02.018