馮睿杰，侯麗霞，郭 揚(yáng)，馬 倩，劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表達(dá)特性分析

馮睿杰，侯麗霞，郭 揚(yáng)，馬 倩，劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

為了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性，以抗低溫品種左優(yōu)紅組培苗為材料，通過同源克隆技術(shù)，獲得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全長CDS，對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)探究了3個(gè)基因的組織表達(dá)特性和響應(yīng)逆境因子及相關(guān)信號(hào)分子的特性。結(jié)果顯示：3個(gè)基因cDNA大小分別為954，978，1 011 bp，分別編碼317，325，336個(gè)氨基酸序列；3個(gè)蛋白分子量分別為36.65，36.97，38.12 kDa；等電點(diǎn)分別為5.12，5.33和5.16，且均在C端含有一個(gè)疏水的五肽APXAA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明，3個(gè)GolSs在葡萄不同組織中表達(dá)情況不同，VvGolS2和VvGolS4在葉片中表達(dá)量最高，而VvGolS3則在花和卷須中表達(dá)量最高；不同逆境因子及逆境信號(hào)分子均會(huì)影響VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的表達(dá)量，其中VvGolS2和VvGolS4基因的表達(dá)受鹽誘導(dǎo)最明顯，VvGolS3基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)最明顯；另外，脅迫信號(hào)分子乙烯、過氧化氫和脫落酸均可誘導(dǎo)VvGolS2基因表達(dá)量上升，而VvGolS3基因的表達(dá)受脫落酸和乙烯的誘導(dǎo)，乙烯、過氧化氫和硫化氫則均可誘導(dǎo)VvGolS4基因表達(dá)量上升。綜上推測(cè)，3個(gè)VvGolSs均與葡萄抵御逆境脅迫相關(guān)，但各自功能可能有所不同。

葡萄；肌醇半乳糖苷合成酶基因；基因克??；表達(dá)特性分析

葡萄(VitisviniferaL.)是多年生落葉藤本漿果類果樹，屬葡萄科葡萄屬，是我國主要的經(jīng)濟(jì)果樹之一。隨著葡萄基因組測(cè)序工作的完成，一些與葡萄抵御生物和非生物脅迫的基因被發(fā)掘和研究，這為從分子水平探討葡萄抵御逆境脅迫的機(jī)制，進(jìn)行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。低溫、干旱和鹽害是限制葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要逆境因子，近年來，人們先后克隆得到了VvWRKY18[1]、VvHsfHs[2]、VpPR10s[3]、VvBAP1[4]、VvCBF1[5]和VvGolS1[6]等與非生物脅迫相關(guān)基因并鑒定了其功能。葡萄對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)，許多逆境相關(guān)基因的功能還需要探究。

寡糖是植物遭受逆境脅迫時(shí)產(chǎn)生的一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，棉子糖系列寡糖是高等植物中含量僅次于蔗糖的一類可溶性糖。植物體內(nèi)棉子糖系列寡糖的合成由棉子糖的合成開始，以半乳糖苷肌醇作為半乳糖基供體，依次向蔗糖、棉子糖、水蘇糖轉(zhuǎn)移半乳糖基生成棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖。其中肌醇半乳糖苷由肌醇半乳糖苷合成酶(Galactinol synthase，GolS)催化肌醇和UDP-半乳糖合成，是這一通路的限速酶[7]。研究表明GolS是多基因家族[8-9]，不同的GolS在抵御非生物脅迫中的作用各不相同[10]。如擬南芥中共有10個(gè)GolS家族成員，其中高溫、干旱、鹽脅迫下AtGolS1和AtGolS2的表達(dá)量上升，而AtGolS3基因表達(dá)受低溫脅迫的誘導(dǎo)[11]。丹參3個(gè)SmGolS基因中，SmGolS1基因表達(dá)受高溫的誘導(dǎo)，而高溫和低溫均可誘導(dǎo)SmGolS2的表達(dá)[8]。葡萄中GolS基因家族由VvGolS1、VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4組成，Pillet等[6]從赤霞珠中克隆得到VvGolS1，并證明轉(zhuǎn)錄因子HsfA2以熱依賴的形式激活VvGolS1啟動(dòng)子響應(yīng)高溫脅迫。但目前為止未見關(guān)于葡萄中其他GolS基因的研究報(bào)道，因此，本試驗(yàn)以抗低溫品種左優(yōu)紅為材料，克隆得到VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4，初步分析了其表達(dá)特性，以期為深入研究該基因家族成員的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 葡萄組培材料及培養(yǎng)方法

以葡萄抗低溫品種左優(yōu)紅為試驗(yàn)材料，以一年生新梢為供試外植體，消毒處理后接種于含有0.1 mg/L生長素(Auxin，IAA)的1/2 MS培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30～50 d后使用。消毒和培養(yǎng)方法見張廣科等[4]。

1.2 試驗(yàn)材料及處理

取左優(yōu)紅大田苗一年生枝條的根、莖、葉、花芽、花、梢尖、卷須、以及幼果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期果實(shí)，提取總RNA，用于后續(xù)基因組織表達(dá)特異性的研究。

取正常生長4～5周齡的左優(yōu)紅葡萄組培苗分別經(jīng)過甘露醇(Mannitol 200 mmol/L)、NaCl(150 mmol/L)、4 ℃、40 ℃、脫落酸(Abscisic acid，ABA 0.5 mmol/L)、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O20.1%)、硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)供體硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide，NaHS 0.1 mmol/L)、乙烯(Ethylene，Eth)前體物質(zhì)1-氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC 0.1 mmol/L)分別處理0，3，6，9，12，24 h后，提取葉片總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因表達(dá)量的變化。每組處理至少重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA合成 按照李希東等[12]方法提取葡萄總RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈作為模板。

1.3.2VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4基因的克隆 根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的葡萄品種黑比諾基因組，搜索VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4序列，并設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，PCR引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)程序如下：VvGolS2：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；VvGolS3：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；VvGolS4：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物利用寶生物工程(大連)有限公司試劑盒回收，與pMD18-T載體連接。陽性克隆由上海桑尼生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.3 VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4的生物信息學(xué)分析 利用在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析；利用軟件DNAMAN分析氨基酸序列的同源關(guān)系；利用軟件MEGA 4.0采用N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹；利用在線軟件WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。

表1 克隆基因所用引物序列

1.3.4VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4基因表達(dá)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4相對(duì)表達(dá)量變化，引物如表2。熒光實(shí)時(shí)定量 PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。Melt 曲線從72 ℃至99 ℃，第1步維持45 s，以后每升高1 ℃ 維持5 s。每樣品進(jìn)行3次重復(fù)。以Actin為內(nèi)參對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)定量，VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4表達(dá)量參考Livak等[13]的方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的克隆

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的葡萄品種黑比諾基因中VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4基因序列，利用生物學(xué)軟件(Primer 5)設(shè)計(jì)特異性引物，以抗低溫品種左優(yōu)紅cDNA為模板，擴(kuò)增得到VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4序列，結(jié)果如圖1所示，分別在1 000 bp左右有清晰條帶。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)引物序列

將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接pMD18-T載體，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，將正確的轉(zhuǎn)化子送交測(cè)序，結(jié)果顯示：VvGolS2擴(kuò)增片段大小為954 bp，經(jīng)DNAMAN軟件分析可知，與GenBank中所提交品種黑比諾的基因序列一致性為98.75%；VvGolS3擴(kuò)增片段大小為978 bp，與GenBank中所提交品種黑比諾的基因序列一致性為97.34%；VvGolS4擴(kuò)增片段大小為1 011 bp，與GenBank中所提交品種黑比諾的基因序列一致性為99.60%。

2.2 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4生物信息學(xué)分析

M.DL2000 Marker；S1、S2、S3.VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DL2000 DNA Marker;S1，S2，S3.Sample of VvGolS2，VvGolS3，VvGolS4.

M.DL2000 DNA Marker； S1、S2、S3.VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4酶切產(chǎn)物。M.DL2000DNA Marker;S1，S2，S3.Sample of VvGolS2，VvGolS3，VvGolS4.

2.2.1 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4蛋白序列分析 利用在線軟件ProtParam對(duì)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4進(jìn)行氨基酸組成分析。結(jié)果表明，VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的分子式組成分別為C1669H2522N420O481S15、C1684H2541N423O482S17、C1744H2616N428O492S21；氨基酸數(shù)分別為317，325和336；分子量分別為36.65，36.97，38.12 kDa；等電點(diǎn)分別為5.12，5.33和5.16；不穩(wěn)定系數(shù)分別為37.97，40.53和38.75(40以下為穩(wěn)定蛋白)，推測(cè)VvGolS2和VvGolS4為穩(wěn)定蛋白，VvGolS3為不穩(wěn)定蛋白。

利用MEGA 4.0軟件分別將VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4與擬南芥、丹參、番茄、楊樹、黃瓜、玉米、苜蓿中的GolSs氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示葡萄中VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4與多種植物中GolS同源，都具有保守的錳離子結(jié)合序列DXD(圖3-A-C結(jié)構(gòu)域Ⅰ)、一個(gè)相對(duì)保守的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖3-A-C的*位置)以及C端末尾一個(gè)疏水性的五肽結(jié)構(gòu)APXAA(圖3-A-C結(jié)構(gòu)域Ⅱ)。進(jìn)化上，VvGolS2與玉米的ZmGolS1親緣關(guān)系較近，同源性為68.31%；VvGolS3與丹參的SmGolS2親緣關(guān)系較近，同源性為75.38%；VvGolS4與丹參的SmGolS1親緣關(guān)系較近，同源性為77.15%(圖3-D-F)。

2.2.2 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于推測(cè)蛋白質(zhì)執(zhí)行生物學(xué)功能的位置，從而進(jìn)一步推斷蛋白質(zhì)的具體功能。利用在線軟件WoLF PSORT對(duì)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4進(jìn)行了亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示VvGolS2定位于細(xì)胞質(zhì)的預(yù)測(cè)值為8，定位于葉綠體的預(yù)測(cè)值為3，定位于細(xì)胞核、線粒體的預(yù)測(cè)值為1；VvGolS3定位于葉綠體的預(yù)測(cè)值為13；VvGolS4定位于細(xì)胞質(zhì)的預(yù)測(cè)值為9，定位于葉綠體的預(yù)測(cè)值為3，定位于細(xì)胞核的預(yù)測(cè)值為1。推測(cè)VvGolS2和VvGolS4主要位于細(xì)胞質(zhì)，少量位于葉綠體；VvGolS3主要位于葉綠體。進(jìn)一步推測(cè)VvGolS3的主要功能可能與VvGolS2、VvGolS4有所差異。

2.3 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的表達(dá)特異性分析

2.3.1VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的組織表達(dá)特性分析 以抗低溫品種左優(yōu)紅為材料，檢測(cè)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4在不同組織器官中的表達(dá)量，結(jié)果如圖4示，VvGolS2在葉片、根、轉(zhuǎn)色期果實(shí)、成熟期果實(shí)中表達(dá)量較高，在花、花芽、卷須和幼果中表達(dá)量較少；VvGolS3在梢尖和花中的表達(dá)量最高，在成熟期果實(shí)中表達(dá)量次之，在葉片中表達(dá)量較少。VvGolS4在葉片中表達(dá)量最高，而其他組織器官幾乎檢測(cè)不到其表達(dá)。

Ⅰ、Ⅱ分別表示GolS的錳離子結(jié)合序列和C端保守疏水五肽；*表示保守的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；AtGolS1. 擬南芥 At2g47180；AtGolS2.擬南芥 At1g56600；AtGolS3. 擬南芥 At1g09350；SmGolS1. 丹參 GQ245764；SmGolS2. 丹參 JF937200；SmGolS3. 丹參 JF937201；MfGolS1. 苜蓿 FJ607306；PtGolS. 毛果楊 XM_002320922.2；SlGolS1. 番茄 AF311943；CsGolS. 黃瓜 AY237112；ZmGolS1. 玉米 AF497507。

Ⅰ,Ⅱrepresentative manganese-binding motif and a conserved hydrophobic pentapeptide in the C-terminal region of GolS, * representative a conserved serine phosphorylation site; AtGolS1.ArabidopsisthalianaAt2g47180；AtGolS2.ArabidopsisthalianaAt1g56600；AtGolS3.ArabidopsisthalianaAt1g09350；SmGolS1.SalviamiltiorrhizaGQ245764；SmGolS2.SalviamiltiorrhizaJF937200；SmGolS3.SalviamiltiorrhizaJF937201；MfGolS1.MedicagofalcateFJ607306；PtGolS.PopulustrichocarpaXM_002320922.2；SlGolS1 .LycopersiconesculentumAF311943；CsGolS.CucumissativusAY237112；ZmGolS1.ZeamaysAF497507.

圖3 葡萄與其他物種中GolSs氨基酸序列同源進(jìn)化分析(A-C)和進(jìn)化樹(D-F)比較

Fig.3 Amino acid sequence alignment (A-C) and and phylogenetic tree (D-F) of GolSs in grapevine and other species

S.莖；R.根；L.幼葉；F.花；Fb.花芽；St.梢尖；T.卷須；Tf.幼果；V.轉(zhuǎn)色果；M.成熟果。S.Stem；R.Root；L.Leaf；F.Flower；Fb.Flower bud；St.Shoot tip；T.Tendril；Tf.Tender fruit；V.Veraison；M.Mature.

2.3.2 幾種逆境因子對(duì)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4表達(dá)量的影響 由圖5可知，甘露醇和NaCl均可誘導(dǎo)VvGolS2的表達(dá)，其中NaCl誘導(dǎo)VvGolS2的表達(dá)最為顯著，在處理12 h后達(dá)到最大值；VvGolS3的表達(dá)量受低溫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而不受其余逆境因子的誘導(dǎo)；高溫、NaCl對(duì)VvGolS4表達(dá)量的誘導(dǎo)較為明顯，分別在處理6，9 h后表達(dá)量達(dá)到最大值，其中又以NaCl的誘導(dǎo)效果最為顯著，最大約為對(duì)照的84倍；低溫和甘露醇對(duì)VvGolS4表達(dá)量的影響較小。推測(cè)VvGolS2和VvGolS4可能參與葡萄抵御多種非生物脅迫，特別是鹽脅迫和溫度脅迫；而VvGolS3可能參與應(yīng)答低溫脅迫。

2.3.3 幾種逆境相關(guān)信號(hào)分子對(duì)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4表達(dá)量的影響 信號(hào)分子在植物抵御逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4對(duì)不同逆境信號(hào)分子的響應(yīng)有所不同(圖6)。其中，ABA、Eth和H2O2均可誘導(dǎo)VvGolS2的表達(dá)，以ABA對(duì)VvGolS2表達(dá)的誘導(dǎo)最為強(qiáng)烈，在處理后6 h可達(dá)到約630倍；H2O2也可較強(qiáng)烈地誘導(dǎo)VvGolS2的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量在9 h達(dá)到22倍，而乙烯的供體Eth對(duì)VvGolS2的誘導(dǎo)效果較弱，9 h表達(dá)量約為7倍；VvGolS3的表達(dá)量受ABA的誘導(dǎo)最為強(qiáng)烈，6 h表達(dá)量約達(dá)到對(duì)照的27倍；乙烯對(duì)VvGolS3表達(dá)量的誘導(dǎo)效果較弱。不同的信號(hào)分子均可誘導(dǎo)VvGolS4的表達(dá)，其中以H2S、Eth和H2O2的誘導(dǎo)效果較為強(qiáng)烈。推測(cè)VvGolS2可能參與ABA和H2O2調(diào)控的葡萄抵御非生物脅迫的反應(yīng)，VvGolS4可能參與H2S、Eth和H2O2介導(dǎo)的葡萄抵御非生物脅迫的反應(yīng)；VvGolS3可能參與ABA相關(guān)的響應(yīng)逆境脅迫的過程。

圖5 幾種逆境因子對(duì)葡萄葉片VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

棉子糖系列寡糖作為植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抵御生物、非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，其生物合成途徑中的限速酶基因GolSs也越來越多地受到人們的重視。近年陸續(xù)從擬南芥[11]、玉米[14]、毛果楊[15]、丹參[8]和豌豆[16]中克隆得到GolSs基因并研究了功能。越來越多的證據(jù)證明GolSs在植物的抗逆反應(yīng)、光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)和種子發(fā)育中發(fā)揮重要作用[17]。最新研究表明葡萄中共有4個(gè)GolS家族成員，但目前為止尚未見對(duì)除VvGolS1外的葡萄GolS家族其他成員的克隆和表達(dá)特性分析。本試驗(yàn)以抗低溫品種左優(yōu)紅為材料，克隆得到了VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，VvGolS2和VvGolS4均位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，但VvGolS3位于葉綠體中，這暗示著3個(gè)基因的功能會(huì)存在差異。同源性分析發(fā)現(xiàn)，VvGolSs基因家族都具有一個(gè)保守的錳離子結(jié)合序列DXD和一個(gè)相對(duì)保守的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(擬南芥AtGolS2、番茄SlGolS1中該位點(diǎn)為丙氨酸)，在C端均具有一個(gè)保守的疏水性五肽結(jié)構(gòu)APXAA，絕大部分GolSs家族序列為APSAA，而VvGolS2中該五肽的絲氨酸被精氨酸所替代，其序列為APRAA；毛果楊PtrGolS9、小巢菜VhGolS2中該五肽的絲氨酸分別為蘇氨酸、天冬酰胺所替代。

圖6 幾種逆境相關(guān)信號(hào)分子對(duì)葡萄葉片VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4相對(duì)表達(dá)量的影響

為了初步了解3個(gè)基因的功能，利用熒光定量PCR檢測(cè)了其組織表達(dá)特性。結(jié)果顯示VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4在不同組織器官中的表達(dá)情況存在差異。其中VvGolS2在葉片中表達(dá)量最高，根中其次，其他組織中表達(dá)較少；VvGolS4只在葉片中表達(dá)，其他組織中幾乎檢測(cè)不到；VvGolS3則在花、梢尖和成熟的果實(shí)等組織中表達(dá)量最高，葉片中的表達(dá)量最低，推測(cè)VvGolS3可能參與到花的發(fā)育過程?；蛟诓煌M織中的表達(dá)與其功能密切相關(guān)，小巢菜種子發(fā)育期間VhGolS1和VhGolS2表達(dá)引起種子中棉子糖的積累，賦予種子抵御脫水脅迫的能力[18]；毛果楊9個(gè)GolSs基因中PtrGolS4和PtrGolS6在根尖、莖、幼葉和成熟葉片中均有表達(dá)，而PtrGolS3和PtrGolS7則在根和莖中表達(dá)，9個(gè)基因在功能上也有所不同[15]；丹參中3個(gè)GolS基因也表現(xiàn)出不同的表達(dá)特性[8]；本試驗(yàn)中葡萄VvGolS2-4不同的組織表達(dá)特性暗示其功能可能有所不同。 有研究報(bào)道，不同干旱抗性的咖啡在受到水分脅迫時(shí)，其GolS的轉(zhuǎn)錄水平和棉子糖含量的積累也不相同[19]，Saito等[20]證明低溫下水稻OsGolS的表達(dá)量上調(diào)。那么葡萄中GolS家族成員是否也參與不同的逆境脅迫應(yīng)答的過程，本試驗(yàn)進(jìn)一步探討了VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4在高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)高鹽對(duì)VvGolS2和VvGolS4表達(dá)的誘導(dǎo)效果較明顯；干旱對(duì)VvGolS2，高溫和低溫對(duì)VvGolS4表達(dá)的影響較大，VvGolS3則表現(xiàn)出對(duì)低溫脅迫的專一性響應(yīng)，其他逆境因子無法影響該基因的表達(dá)，而VvGolS4主要參與對(duì)高鹽和溫度脅迫的應(yīng)答。說明不同VvGolS可能參與了不同的逆境響應(yīng)。

植物響應(yīng)逆境脅迫的過程是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，許多重要的信號(hào)分子如ABA、乙烯、H2O2和H2S均參與植物響應(yīng)非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中茉莉酸合成的前體物質(zhì)亞麻酸可以誘導(dǎo)逆境下AtGolS1的表達(dá)，進(jìn)而應(yīng)答氧化脅迫等逆境脅迫[21]；丹參中3個(gè)SmGolS基因均受ABA等激素的調(diào)控[8]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同信號(hào)分子均可不同程度誘導(dǎo)VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的表達(dá)，但誘導(dǎo)效果有所差異：ABA對(duì)VvGolS2表達(dá)的誘導(dǎo)最為強(qiáng)烈，對(duì)VvGolS3表達(dá)的誘導(dǎo)效果也較為明顯，暗示VvGolS2和VvGolS3可能主要以ABA依賴形式參與響應(yīng)脅迫；乙烯的前體物質(zhì)Eth可誘導(dǎo)VvGolS2、VvGolS4的表達(dá)，表明其參與乙烯介導(dǎo)的生理反應(yīng)。H2S是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛參與植物響應(yīng)逆境脅迫的氣體信號(hào)分子[22]，F(xiàn)u等[23]發(fā)現(xiàn)來自L-/D-CDes途徑的H2S參與葡萄抵御低溫脅迫的過程。本試驗(yàn)中H2S的供體NaHS、鹽和溫度脅迫均可誘導(dǎo)VvGolS4的表達(dá)，表明VvGolS4可能參與H2S介導(dǎo)的響應(yīng)溫度脅迫和鹽脅迫的信號(hào)通路。H2O2也是一種重要的逆境響應(yīng)的信號(hào)分子，在本試驗(yàn)中VvGolS2和VvGolS4基因的表達(dá)可較為明顯得被H2O2誘導(dǎo)，說明二者可能參與活性氧清除反應(yīng)。VvGolS3的表達(dá)量則表現(xiàn)出受ABA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，說明參與ABA調(diào)控的葡萄抗逆反應(yīng)。擬南芥AtGolS1和AtGolS2[11]、毛果楊中PtrGolS2、PtrGolS5-7[15]均被證明受ABA的誘導(dǎo)，旋蒴苣苔基因BhGolS1被證明受干旱和ABA的誘導(dǎo)，其啟動(dòng)子可與BhWRKY1結(jié)合，認(rèn)為BhGolS1以ABA依賴的形式抵御脫水脅迫[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，VvGolS3的表達(dá)受到低溫和ABA的誘導(dǎo)，那么是否VvGolS3也受到了轉(zhuǎn)錄因子WRKY家族成員的調(diào)控，從而參與ABA依賴的低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路需要深入研究。

葡萄GolS家族成員VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4受逆境因子和激素因子的誘導(dǎo)，VvGolS2可能參與ABA依賴型的抗?jié)B透脅迫途徑，VvGolS4可能參與H2S和乙烯介導(dǎo)的抵御鹽脅迫及溫度脅迫的反應(yīng)，而VvGolS3可能受ABA誘導(dǎo)參與抵御低溫脅迫。有研究證實(shí)玉米中ZmGolS2可作為轉(zhuǎn)錄因子ZmDREB2A的下游靶基因響應(yīng)干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫[25]，那么葡萄GolSs家族成員上游是否也存在不同的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其具體的調(diào)控機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步研究。

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Gene Cloning and Expression Analysis of Galactinol Synthase GeneVvGolS2-4 in Grape

FENG Ruijie，HOU Lixia，GUO Yang，MA Qian，LIU Xin

(College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

Using homology cloning method，the full-length cDNA of galactinol synthase geneVvGolS2，VvGolS3 andVvGolS4 were cloned fromVitisviniferacultivar Zuoyouhong tissue culture seedling.The analysis ofVvGolS2，VvGolS3 andVvGolS4 sequencing indicated that three genes were 954，978 and 1 011 bp ranging in size，coded as 317，325，336 amino acids respectively with molecular weight were 36.65，36.97，38.12 kDa and the isoelectric point were 5.12，5.33，5.16 respectively.Three VvGolSs all possessed a conserved hydrophobic APXAA pentapeptide domain in the C-terminal region.Real-time PCR analysis showed that threeVvGolSswere expressed different in all tested tissues，with the highest expression ofVvGolS2 andVvGolS4 in leaves，andVvGolS3 was highly expressed in flowers and tendrils. Using tissue culture seedling，the relative expression levels ofVvGolS2，VvGolS3 andVvGolS4 after different stresses or different stress singling factors treatment were checked.TheVvGolS2 andVvGolS4 were highly induced by salt stress，while theVvGolS3 was only induced by low temperature.Moreover，VvGolS2 was significantly induced by stress-related signal molecules，such as abscisic acid(ABA)，ethylene(ACC)，and hydrogen peroxide(H2O2).TheVvGolS4 was induced by ACC，H2O2and H2S，and theVvGolS3 was induced by ABA and ACC.Together，these results suggested that these threeVvGolSswere involved in abiotic stresses resistance in grape with different functions.

Vitisvinifera；Galactinol synthase gene；Gene clone；Expression analysis

2017-01-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572107；31540090；31401844)

馮睿杰(1991-)，男，山西太原人，碩士，主要從事葡萄生理與分子生物學(xué)研究。馮睿杰、侯麗霞為同等貢獻(xiàn)作者。

劉 新(1966-)，女，山東萊陽人，教授，主要從事葡萄生理與分子生物學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2017)02-0087-09

10.7668/hbnxb.2017.02.014