喻涌泉,黃魏魏,董建江,朱啟法,盧滇楠,劉永民(1.遼寧石油化工大學(xué)石油化工學(xué)院,遼寧 撫順11001;.清華大學(xué)化學(xué)工程系,北京 10008;.安徽皖南煙葉責(zé)任有限公司,安徽 宣城 000;.中國(guó)煙草總公司安徽省公司,安徽 合肥 00)
硝基還原假單胞菌吸附重金屬鎘的機(jī)理研究
喻涌泉1,2,黃魏魏3,董建江4,朱啟法3,盧滇楠2,劉永民1*(1.遼寧石油化工大學(xué)石油化工學(xué)院,遼寧 撫順113001;2.清華大學(xué)化學(xué)工程系,北京 100084;3.安徽皖南煙葉責(zé)任有限公司,安徽 宣城 242000;4.中國(guó)煙草總公司安徽省公司,安徽 合肥 230022)
系統(tǒng)研究了硝基還原假單胞菌對(duì)重金屬鎘的吸附特性與吸附機(jī)理.研究結(jié)果表明,此株菌可以耐受200mg/L重金屬鎘,而進(jìn)一步提高鎘離子的濃度則會(huì)顯著抑制該菌的生長(zhǎng).將該菌株接種至含20、50和100mg/L Cd2+的液體LB培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò)120h的培養(yǎng),鎘的去除率分別能達(dá)到94.3%,91.0%和86.0%.系統(tǒng)研究了pH值、溫度、鹽濃度和多種重金屬離子存在下,該菌株對(duì)溶液中鎘離子去除效果的影響.結(jié)果表明,硝基還原假單胞菌可以在pH值為4~8范圍內(nèi)有效吸附鎘離子,當(dāng)NaCl溶液提升至1mol/L時(shí),該菌株仍可耐受,并且可以吸附除了鉛離子之外的多種重金屬離子.X射線光電子能譜分析結(jié)果顯示,吸附后 Cd2+的結(jié)合能發(fā)生了變化.掃描電鏡結(jié)果顯示,與正常菌株相比,吸附鎘的菌株產(chǎn)生明顯形變,且表面有白色顆粒狀物質(zhì)吸附,結(jié)合X射線光電子能譜分析結(jié)果,可以說(shuō)明生物礦化是該菌株吸附和鈍化重金屬的途徑之一.
硝基還原假單胞菌;鎘污染;生物修復(fù);耐鎘菌株;吸附機(jī)理
重金屬鎘廣泛存在充電電池、電子設(shè)備、釉料、繪畫、塑料和磷肥中[1-2].環(huán)境中的鎘元素主要源于人類的工業(yè)和農(nóng)業(yè)不斷地排放[3].鎘離子可以從植物根部遷移到地表組織中,并經(jīng)食物鏈最終進(jìn)入人體器官.鎘作為生物體內(nèi)非必需元素,對(duì)動(dòng)植物產(chǎn)生巨大危害[4],鎘在極低濃度(0.001~0.1mg/L)時(shí)都會(huì)對(duì)人體造成巨大毒害[5].因此,被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)定義為強(qiáng)致癌的物質(zhì)[6].鎘離子去除與鈍化成為目前環(huán)境科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一.
傳統(tǒng)重金屬的去除方法包括化學(xué)沉淀、氧化還原、電化學(xué)處理(電氧化或電還原)、反滲透、離子交換和物理吸附等等[7-12].當(dāng)重金屬濃度低于100mg/L時(shí),大部分這些技術(shù)不足以完全除去重金屬[13].這就意味著物理化學(xué)的方法在重金屬濃度較低(≤100mg/L)時(shí)會(huì)失去效果或者處理費(fèi)用極其昂貴[14].近年來(lái),隨著微生物技術(shù)的不斷發(fā)展,將環(huán)境微生物用于水體和土壤重金屬的吸附脫除或者鈍化成為目前環(huán)境科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[15].目前,已有研究表明細(xì)菌[16]、真菌[17]和酵母[18]等微生物均具有重金屬鎘的去除能力,而且因?yàn)槠渚哂协h(huán)境友好且適宜于低濃度鎘污染處理的特點(diǎn),日益引起研究者的關(guān)注[19].假單胞菌是一類革蘭氏陰性桿菌,以極生鞭毛運(yùn)動(dòng),不形成芽孢,嚴(yán)格好氧,呼吸代謝.對(duì)于農(nóng)田土壤等重金屬污染區(qū)域,假單胞菌有廣泛的分布,它既能產(chǎn)生目標(biāo)污染物的降解酶又能對(duì)相關(guān)重金屬產(chǎn)生抗性,通過(guò)生物吸附,生物累積,表面沉淀,和生物礦化等修復(fù)機(jī)制鈍化土壤中的重金屬;也能夠溶解、還原或氧化重金屬來(lái)達(dá)到去除或者降低重金屬毒性的效果.重金屬污染土壤的微生物修復(fù)具有成本低、對(duì)土壤擾動(dòng)小、操作方便等優(yōu)點(diǎn),是一種非常有效的原位修復(fù)土壤重金屬污染的方法.假單胞菌在治理土壤重金屬污染的過(guò)程中起了重要作用,成為潛在的重金屬鈍化的功能微生物[20].然而,假單胞菌吸附或者鈍化重金屬鎘的機(jī)制及其影響因素研究尚不充分.
因此本文以實(shí)驗(yàn)室保存的硝基還原假單胞菌為研究對(duì)象,系統(tǒng)研究了該菌株對(duì)鎘的耐受性、吸附容量以及環(huán)境因素對(duì)該菌株生長(zhǎng)特性的影響.進(jìn)而采用XPS、SEM等技術(shù)對(duì)該菌吸附和鈍化鎘的機(jī)理進(jìn)行了探討,以期獲得此類菌株去除或者鈍化鎘的機(jī)制并指導(dǎo)環(huán)境微生物的設(shè)計(jì)與使用.
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
本實(shí)驗(yàn)所用菌株源自實(shí)驗(yàn)室保存菌株,購(gòu)于保藏中心,篩選自江蘇省南京第一農(nóng)藥廠,是一株硝基還原假單胞菌,此菌為革蘭氏陰性菌、短桿狀,菌落為乳白色,邊緣不規(guī)則,好氧,化能異養(yǎng).除對(duì)重金屬有吸附作用以外,還有潛在的降解鄰苯二酚的作用,在含100mg/L鄰苯二酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),3d內(nèi)降解率大于90%.
LB液體培養(yǎng)基:10.0g/L蛋白胨(Thermo Fisher Oxoid),5.0g/L 酵母粉(Thermo Fisher Oxoid),10.0g/L NaCl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).3CdSO4·8H2O(分析純,國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).
1.2 鎘離子濃度對(duì)硝基還原假單胞菌生長(zhǎng)特性的影響
在500mL的搖瓶中加入200mL的LB液體培養(yǎng)基,在120℃下滅菌15min,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中鎘離子濃度分別為 20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L和250mg/L,以1%的加入量接種菌株.在30℃和170r/min條件下培養(yǎng)五天,每24h檢測(cè)600nm處吸光度值以表示細(xì)胞密度,8000r/min條件下離心10min收集上清液,利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP)層頂上清液中重金屬的濃度.
1.3 重金屬鎘吸附實(shí)驗(yàn)
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)按式(1)計(jì)算重金屬的去除率(R):
式中:c0和cR分別為培養(yǎng)基上清液中Cd2+的初始濃度和剩余濃度,mg/L.
1.4 pH值、溫度和NaCl濃度對(duì)吸附效果的影響
選取pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,溫度分別為10、20、30和40℃,以及NaCl濃度為0.1~1.0mol/L,研究菌株在含有50mg/L的Cd2+的 LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性和鎘去除率.其它實(shí)驗(yàn)條件與前述相同.
1.5 菌株對(duì)混合重金屬吸附能力
首先測(cè)定了 50mg/L的 Cu、Pb、Zn、Cr和 Cd單獨(dú)存在條件下,菌株對(duì)上述重金屬的吸附能力作為對(duì)照.然后在每種金屬濃度均為50mg/L時(shí),測(cè)定了菌株對(duì)這五種混合重金屬的吸附能力.上述實(shí)驗(yàn)中,均采用培養(yǎng) 48h收集到的菌體作為吸附劑,吸附時(shí)間為24h.其它實(shí)驗(yàn)條件與前述相同.
1.6 鎘的胞外吸附與胞內(nèi)累積
對(duì) Figueira等[21]的方法進(jìn)行了改進(jìn).將吸附鎘 72h后的菌體進(jìn)行離心(8000r/min,10min),收集菌體離心后,無(wú)菌水洗滌2~3次,收集全部洗滌液,用 ICP測(cè)定其中鎘的濃度;進(jìn)一步用含有10mmol/L的 EDTA的洗滌液進(jìn)一步洗脫菌體,重復(fù) 3次操作,再次離心(8000r/min,10min)收集菌體和上清液.上清液中 Cd2+濃度即為細(xì)胞壁對(duì)Cd2+的吸附量,沉淀菌體用 HNO3微波消解至無(wú)色液體,并定容至 50mL,即為菌體細(xì)胞內(nèi)的Cd2+吸附量.
上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.
1.7.1 菌體含量 菌體含量采用吸光度法測(cè)定.檢測(cè)波長(zhǎng)為600nm.
1.7.2 重金屬離子含量 重金屬離子的濃度通過(guò)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP型號(hào):IRIS、生產(chǎn)廠家:美國(guó)熱電公司)來(lái)檢測(cè).
1.7.3 掃描電鏡(SEM) 將吸附鎘前后菌體根據(jù)Gharieb等[22]方法制樣.簡(jiǎn)言之,菌體經(jīng)過(guò)戊二醛固定、乙醇梯度脫水干燥以及鍍金等操作后,置于掃描電鏡(FEIQuanta 200,美國(guó) FEI 公司)下觀察細(xì)胞表面形態(tài).
1.7.4 X射線光電子能譜(XPS)分析 收集吸附鎘的菌體,取樣一部分菌體直接冷凍干燥,另一部菌體在 8000r/min離心 10min,收集上清液,將上清液進(jìn)行冷凍干燥.以不接菌的含鎘培養(yǎng)基冷凍干燥后作為空白對(duì)照.冷凍干燥完成后,將所有樣品研磨粉碎,用 X射線光電子能譜(XPS,美國(guó)Perkin- Elmer公司)檢測(cè)元素鎘結(jié)合能的改變,以此判斷鎘與菌株結(jié)合前后樣品中鎘電子能譜的變化.
2.1 鎘濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
圖1給出了不同濃度的鎘對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響.
圖1 Cd2+濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響Fig.1 The effect of Cd2+concentrations on the growth of Pseudomonas nitroreducens
圖1結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)基中鎘濃度增加,菌株生長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)遲滯現(xiàn)象,并且降低最終菌體密度.總體而言,在鎘濃度低于50mg/L時(shí),對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響較小,而鎘濃度升高為 100mg/L和200mg/L時(shí),菌體的遲滯期分別延長(zhǎng)到24h和48h.當(dāng)濃度達(dá)到250mg/L時(shí)菌株幾乎不生長(zhǎng).這主要源于,在低濃度重金屬污染存在條件下,細(xì)菌可以通過(guò)改變自身特性,比如細(xì)胞表面積,來(lái)抵抗境的毒性壓力[23-24];而在高濃度重金屬污染物存在條件下,其能破壞細(xì)胞表面結(jié)構(gòu),從而造成不可修復(fù)的損傷[25].
2.2 菌株對(duì)鎘的吸附能力
“農(nóng)拓者,顧名思義,就是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)服務(wù)的開(kāi)拓者。我們名字就決定給了我們的使命,就是要從根本上優(yōu)化農(nóng)民的種植方式,幫助農(nóng)民實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高收益的夢(mèng)想?!眲⒈驈?qiáng)調(diào)?,F(xiàn)在,歷經(jīng)三年多的努力和發(fā)展,農(nóng)拓者不僅在焉耆等地?fù)碛辛藦V大的粉絲和良好的口碑。同時(shí)由農(nóng)拓者發(fā)起的“新疆辣椒(色素)全產(chǎn)業(yè)鏈聯(lián)盟”,還得到了種業(yè)、肥業(yè)、藥業(yè)、金融、保險(xiǎn)、收購(gòu)方、種植大戶合作社等多方環(huán)節(jié)合作和幫助,實(shí)現(xiàn)從種到收到金融和保險(xiǎn)的閉環(huán),創(chuàng)新性的推動(dòng)了新疆辣椒行業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
圖2 菌株對(duì)鎘離子吸附去除效果Fig.2 The removal ratio of Cd2+by Pseudomonas nitroreducens
圖2為菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)基中鎘離子的吸附去除效果.由圖 2可見(jiàn),在 20mg/L和50mg/L Cd2+濃度下,菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期達(dá)到最大的金屬去除量.而在較高的 100mg/L的 Cd2+下,菌株在衰亡期達(dá)到最大金屬去除量.可見(jiàn)初始 Cd2+濃度不同,最適宜去除金屬的生長(zhǎng)階段也不同.
2.3 影響菌株吸附鎘的因素
2.3.1 NaCl的影響 考察了 NaCl濃度從0.1mol/L到1.0mol/L時(shí)NaCl濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和鎘吸附量的影響,結(jié)果如圖3所示.
圖3 NaCl濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和鎘脫除率的影響Fig.3 Effect of NaCl on the growth of cell and the removal of Cd2+
圖3結(jié)果表明,當(dāng)NaCl濃度從0.1mol/L提高到0.2mol/L時(shí),反而有利于細(xì)菌的生長(zhǎng),這種現(xiàn)象可能是由于 Na+的外排系統(tǒng)增強(qiáng)的表達(dá)[26],也有可能是由于一種滲透壓的沖擊用來(lái)保護(hù)細(xì)胞不被Cd2+毒害[26].然而隨著NaCl濃度的繼續(xù)上升,細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制并且去除效果下降.
2.3.2 pH值的影響 研究了pH值對(duì)鎘去除率的影響,結(jié)果如圖4所示.
圖4結(jié)果表明,隨著溶液pH值增大,去除率隨之先增大后降低.該菌株吸附去除鎘的最優(yōu)pH值為7.0.當(dāng)pH值低于4.0后,菌株對(duì)鎘的吸附脫除效果顯著降低.Kiran[27]和 Kapoor等[28]研究表明溶液pH值可通過(guò)影響菌株的生長(zhǎng)、吸附位點(diǎn)的性質(zhì)及重金屬離子在溶液中的狀態(tài)等來(lái)影響生物吸附過(guò)程.
圖4 pH對(duì)菌株吸附脫除鎘的影響Fig.4 The influence of pH value on Cd2+removal by cell in presence of 50mg/L of Cd2+
2.3.3 溫度的影響 溫度不僅可以改變細(xì)胞表面官能團(tuán)的電離程度,而且還可以影響細(xì)胞表面官能團(tuán)與重金屬離子之間形成絡(luò)合物的穩(wěn)定性,從而影響吸附劑與重金屬離子之間的親和力.因此考察了溫度對(duì)鎘去除效果的影響,結(jié)果如圖5所示.
圖5 溫度對(duì)菌株吸附Cd2+的影響Fig.5 Influence of temperature on Cd2+removal by cell in presence of 50mg/L of Cd2+
圖5結(jié)果表明,當(dāng)溫度小于30℃時(shí),去除率隨著溫度增高而增大,這可能的原因是溫度的升高增加了生長(zhǎng)菌體的生物酶活性,增加了細(xì)胞的新陳代謝,從而提高菌體對(duì)Cd2+的胞內(nèi)積累;當(dāng)溫度大于 30℃,吸附量迅速下降,這可能原因是菌株不適應(yīng)高溫環(huán)境,影響其生長(zhǎng),導(dǎo)致吸附量下降[29].因此,最優(yōu)溫度為 30℃.Fan等[30]通過(guò)真菌吸附Cd2+的研究發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高,菌體表面的吸附位點(diǎn)和重金屬的親和力隨之增強(qiáng),當(dāng)溫度升高到不適宜菌體生存時(shí),會(huì)造成細(xì)胞壁變形,導(dǎo)致吸附位點(diǎn)減少,從而引起吸附量的減少.
2.3.4 多種重金屬的吸附去除能力 進(jìn)一步分析了菌株對(duì)多種重金屬的吸附能力,結(jié)果如圖6所示.
圖6 菌株對(duì)多種重金屬的吸附能力Fig.6 Removal of different individual metals by cell after 24h of incubation at 37℃
圖 6(a)表明,菌株單獨(dú)對(duì) Pb的吸附量最低,為 1.9mg/g菌體;而對(duì) Cd的吸附量最高為22.2mg/g菌體.對(duì)Zn和Cr的吸附量接近.圖6(b)結(jié)果表明,當(dāng)混合5種金屬時(shí),菌株對(duì)各金屬的吸附量都比單獨(dú)施加時(shí)出現(xiàn)了明顯的下降.Fu和Maier等[31]的研究得到類似結(jié)果,吸附量由大到小依次為Cr>Cu>Zn>Pb>Cd.
2.4 吸附機(jī)理研究
2.4.1 菌株對(duì)鎘的胞外吸附與胞內(nèi)累積 為了研究不同 Cd2+濃度下胞外吸附和胞內(nèi)積累的關(guān)系,檢測(cè)了總吸附量,胞外吸附和胞內(nèi)積累的量,結(jié)果如圖7所示.
圖7 不同濃度Cd2+在細(xì)胞內(nèi)外分布情況Fig.7 Extracellular adsorption and intracellular accumulation under different Cd2+concentrations
圖7表明,隨著初始鎘濃度的上升,胞外吸附量也隨之上升,這可能是由于高濃度鎘部分破壞了細(xì)胞使細(xì)胞暴露了更多潛在的吸附位點(diǎn).也有可能由于細(xì)胞存在排斥重金屬的機(jī)能,將金屬排出細(xì)胞內(nèi)因而更多的吸附在細(xì)胞表面.而 Pabst等[32]的研究認(rèn)為胞外吸附量的增加可能是由于生成了胞外多聚物而造成的.本文在較高的50mg/L和100mg/L Cd2+濃度下,胞內(nèi)積累量基本保持不變,這與活細(xì)胞能將多余的金屬離子排出細(xì)胞質(zhì)的觀念吻合.這種 Cd2+的動(dòng)態(tài)平衡很有可能是由于細(xì)胞將金屬離子外排系統(tǒng)作為一種脫毒機(jī)制將Cd2+排出細(xì)胞內(nèi)所造成的[33].
2.4.2 掃描電鏡(SEM)分析 圖8為Cd2+處理前后菌體的掃描電鏡圖.結(jié)果表明,在沒(méi)有 Cd2+存在的情況下菌株表面光滑且飽滿.而 Cd2+處理過(guò)之后菌株出現(xiàn)不同程度的形變,說(shuō)明一定Cd2+處理會(huì)給菌體帶來(lái)?yè)p傷.且菌體表面吸附有大量白色顆粒,可能是由于 Cd2+吸附在菌體表面所造成.結(jié)合圖7胞外吸附與胞內(nèi)累積的結(jié)果推測(cè),菌株吸附 Cd2+的機(jī)理主要是靠菌體表面的生物礦化.
2.4.3 X射線光電子能譜(XPS)分析 圖9給出了吸附前后鎘能譜的變化.a為空白組,b為上清液組,c為菌液組.結(jié)果表明,吸附到菌體表面的Cd2+與空白組 Cd2+的峰位相比發(fā)生了變化,分別為404.62eV和405.7eV,表明吸附后Cd2+的電子能譜發(fā)生了變化.結(jié)合圖 9掃描電鏡結(jié)果推測(cè)Cd2+被吸附在菌體表面且價(jià)態(tài)發(fā)生了變化,說(shuō)明生物礦化可能是該株菌吸附重金屬的一種途徑.
圖8 菌株在空白組(A)和鎘處理組(B)的掃描電鏡圖Fig.8 SEM images of cell with(B) and without(A) treatment with 200mg/L Cd2+
圖9 鎘被菌株吸附后的XPS峰譜圖Fig.9 XPS spectra of Cd after biosorption by cell
3.1 硝基還原假單胞菌對(duì)Cd2+有良好的吸附性能,1%的接種量接種于含 20mg/L、50mg/L和100mg/L Cd2+的液體LB培養(yǎng)基中,在30℃,170r/ min條件下?lián)u床培養(yǎng)5d,結(jié)果顯示其分別能達(dá)到94.3%、91.0%和86.0%的去除率.
3.2 該菌株在較高的Cd2+濃度下仍能維持其細(xì)胞功能,說(shuō)明存在一種脫毒機(jī)制使它能將金屬離子外排出.
3.3 該菌株能在高鹽條件下生存,對(duì)低溫和低pH值有一定抵抗力,對(duì)多種金屬均有吸附性能且有較強(qiáng)的耐受多金屬的能力.
3.4 探究了該株菌吸附鎘的機(jī)理,胞外生物礦化是該株菌吸附重金屬鎘的重要途徑之一.
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Study on the removal of Cd(II) by Pseudomonas nitroreducens: Biosorption characteristics and mechanism.
YUYong-quan1,2, HUANG Wei-wei3, DONG Jian-jiang4, ZHU Qi-fa3, LU Dian-nan2, LIU Yong-min1*(1.College of Petroleum and Chemical Engineering,Liaoning Shihua University, Fushun 113001, China;2.Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China;3.Anhui Wannan Tobacco Liability Company, Xuancheng 242000, China;4.China Tobacco Corporation, Hefei 230022, China). China Environmental Science, 2017,37(6):2232~2238
The adsorption characteristics and adsorption mechanism of cadmium removal by Pseudomonas nitroreducens were investigated systematically. The results showed that the strain could tolerate cadmium up to 200mg/L. Further increase the concentration of cadmium led to a significantly inhibition of the growth of Pseudomonas nitroreducens. In a liquid culture of Pseudomonas nitroreducens, where a liquid LB medium containing 20mg/L, 50mg/L or 100mg/L Cd2+was used, the removal rate of cadmium reached 94.3% 91.0% and 86.0%, respectively after 120h of cultivation. The impact of pH, temperature, salt concentration and various other heavy metal ions on the removal efficiency of cadmium were also explored. The results showed that Pseudomonas nitroreducens effectively adsorbed cadmium with in the pH range from 4 to 8. The osmosis stress test showed that Pseudomonas nitroreducens could tolerate a NaCl solution of 1mol/L. Under this condition, the strain still adsorbed a variety of heavy metal ions except lead ions. X-ray photoelectron spectroscopy analysis showed that the binding energy of cadmium changed after adsorption. Scanning electron microscopy (SEM) showed that Pseudomonas nitroreducens deformed and has white particles attached on the surface after cadmium treatment, indicating that biomineralization is one of its ways to adsorb heavy metals.
Pseudomonas nitroreducens;cadmium pollution;bioremediation;resistance to cadmium strains;the adsorption mechanism
X53
A
1000-6923(2017)06-2232-07
喻涌泉(1992-),男,湖南岳陽(yáng)人,碩士研究生,研究方向?yàn)橥寥酪约八w重金屬污染修復(fù).
2016-10-19
國(guó)家自然科學(xué)基金(21276139)
* 責(zé)任作者, 教授, liu79ym@tom.com