文/高 楊 尚東洋

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的探討

文/高 楊1尚東洋2

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

提出并建立了一種快速測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的高效液相色譜法。樣品處理后，經(jīng)C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱分離，甲醇作為流動(dòng)相，高效液相-紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法進(jìn)行定量。試驗(yàn)結(jié)果表明，C18色譜柱檢測(cè)葉黃素保留時(shí)間穩(wěn)定，分離效果良好，且峰型良好，能夠滿足檢測(cè)要求。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、污染少等特點(diǎn)，具有較好的實(shí)用性。

葉黃素；高效液相色譜法；嬰幼兒配方奶粉

葉黃素系統(tǒng)名稱為3，3，-α，β-二羥基-胡蘿卜素，分子式為C40H56O2，相對(duì)分子質(zhì)量為568.88（按2007年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量）。屬于類胡蘿卜素類色素，又名“植物黃體素”，是一種天然色素。葉黃素廣泛存在于自然界的植物體中，其中萬(wàn)壽菊中含量最多。

葉黃素具有多種生物活性，富有營(yíng)養(yǎng)而無(wú)副作用，因此用途非常廣泛，可應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、煙草和禽類飼料等領(lǐng)域。大量醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，葉黃素對(duì)視覺(jué)有保護(hù)作用，能夠預(yù)防白內(nèi)障、動(dòng)脈硬化，并且有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效，特別在預(yù)防癌變發(fā)生、延緩癌癥發(fā)展等方面發(fā)揮了重要作用，是目前國(guó)際上功能性食品成分研究中的熱點(diǎn)之一，具有廣闊的開發(fā)前景。

鑒于葉黃素獨(dú)特的生理功能，近年來(lái)，越來(lái)越多的乳品企業(yè)開展了將葉黃素添加到嬰幼兒配方奶粉中的相關(guān)研究工作，并取得了一定的成效。隨著添加葉黃素的嬰幼兒配方奶粉陸續(xù)上市，準(zhǔn)確、快速檢測(cè)產(chǎn)品中葉黃素的含量對(duì)嬰幼兒配方奶粉的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，關(guān)于葉黃素含量的檢測(cè)方法主要有紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法普及率高、分析速度快、準(zhǔn)確性高，是目前應(yīng)用最為廣泛，同時(shí)也是葉黃素含量測(cè)定最適用的檢測(cè)方法之一。

2016年8月31日，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布了GB 5009.248-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測(cè)定》，該標(biāo)準(zhǔn)代替了GB/T 23209-2008《奶粉中葉黃素的測(cè)定 液相色譜-紫外檢測(cè)法》。新發(fā)布的國(guó)標(biāo)和舊國(guó)標(biāo)相比，增加了對(duì)葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的校正要求、操作過(guò)程注意點(diǎn)，更改了提取溶劑等，方法更加嚴(yán)謹(jǐn)，提高了回收率，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，可以很好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。但該方法操作步驟較為繁瑣費(fèi)時(shí)。筆者采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器，以甲醇作為流動(dòng)相，采用最普遍使用的C18色譜柱進(jìn)行分離，操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、減少污染、實(shí)用性強(qiáng)，可適用于嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的快速測(cè)定。

1 儀器設(shè)備與試驗(yàn)方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（日本島津，型號(hào)為L(zhǎng)C-20AT，配有紫外檢測(cè)器）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)為XW-80A）；分析天平（美國(guó)奧豪斯，型號(hào)為CAV214C，感量0.1 mg）；數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司，型號(hào)為KQ-700DE）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津，型號(hào)為UV2550）；氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，型號(hào)為WTN-2800D）；超純水儀（沃特爾，型號(hào)為WP-UPLH-20）；冷凍速離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)為TGL16M）；深冷冰柜（海爾醫(yī)療，型號(hào)為DW86L338）；移液器（DRAGON，1～5 mL）。

1.1.2 試劑材料

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma，純度≥98.0%；正己烷，色譜純；無(wú)水乙醇，色譜純；甲醇，色譜純；二氯甲烷，色譜純；0.45 μm濾膜，有機(jī)系；試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自己制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確至0.01 g）均勻試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL約50 ℃的溫水，超聲20 min，使樣品充分溶解。

用移液管準(zhǔn)確移取處理好的均勻樣液1 mL于10 mL螺口試管中，加入1 mL無(wú)水乙醇，渦旋振蕩1 min混勻，再加入3 mL正己烷，避光渦旋振蕩提取3 min，4 500 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次，合并提取液，以10 mL水洗滌，4 500 r/min離心3 min分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機(jī)相，于室溫氮?dú)獯蹈?，以甲醇渦旋振蕩溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL。冷凍30 min，4 500 r/min離心3 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.2.2 液相條件

色譜柱：C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；

流動(dòng)相：甲醇；

流速：1.0 mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：445 nm；

進(jìn)樣體積：10 μL；

柱溫：30 ℃。

2 試驗(yàn)結(jié)果與注意事項(xiàng)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（200 mg/L）：稱取標(biāo)樣0.001 g，用二氯甲烷溶解并定容至5 mL容量瓶，在-80 ℃冰箱中避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（8 mg/L）：吸取1 mL儲(chǔ)備液，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，在-80 ℃冰箱中避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)靈敏度和使用需要，用甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L。此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液需于分析前臨時(shí)配制。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。在0.10～0.50 mg/L范圍內(nèi)，葉黃素線性范圍良好，線性回歸方程為Y=29330X+2993.6，相關(guān)系數(shù)為0.9989。測(cè)試溶液中被測(cè)組分濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

2.2 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在不含葉黃素的空白樣品中，分別添加3 個(gè)不同梯度的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)梯度做6 個(gè)平行樣，按照1.2的樣品處理方法進(jìn)行處理。結(jié)果見表1：加標(biāo)量為0.10～0.50 μg，其回收率為86.4%～95.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%～3.83%。

2.3 注意事項(xiàng)

2.3.1 由于葉黃素穩(wěn)定性差，對(duì)光敏感，所有試驗(yàn)操作應(yīng)在500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進(jìn)行。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制后需要用紫外可見分光光度計(jì)校準(zhǔn)，得到準(zhǔn)確濃度。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

本文以GB 5009.248-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測(cè)定》為基礎(chǔ)，對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn)，方法改進(jìn)后具有操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、污染少等特點(diǎn)，具有較好的實(shí)用性。C

[1] 郭志有，高翠玲，宋儒，等. 葉黃素的功能及應(yīng)用. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，14（2）：52-53.

[2] 楊鈴，陳金偉. 葉黃素的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展. 食品科技，2012，37（5）：199-203.

[3] 蔡晶，許新德. 嬰幼兒配方奶粉中葉黃素的添加. 中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37（1）：40-41，61.

[4] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 26405-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 葉黃素. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[5] 鄭菲菲，陶保華，賴世云，等. 高壓液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的葉黃素和β-胡蘿卜素.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014，5（1）：227-234.

[6] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). GB 5009.248-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測(cè)定. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[7] 單藝，楊金寶，鄂來(lái)明，等. 反相高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方食品中的葉黃素. 食品科技，2011，36（10）：276-279.

[8] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 23209-2008奶粉中葉黃素的測(cè)定 液相色譜-紫外檢測(cè)法. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

高楊（1987-），女，助理工程師，從事乳品質(zhì)量管理工作。

2017-04-19）