程黎，賈功偉

亞低溫對(duì)腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響①

程黎1，賈功偉2

目的探討亞低溫對(duì)腦缺血再灌注大鼠內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)的影響。方法30只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和亞低溫組，每組10只。后兩組制備大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)2 h再灌注動(dòng)物模型，亞低溫組進(jìn)行亞低溫處理24 h。Longa評(píng)分評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能；濕/干重法測(cè)定腦含水量；TTC染色觀察腦梗死體積；ELISA法檢測(cè)腦組織VEGF、HIF-1α蛋白含量；qPCR法檢測(cè)腦組織VEGF mRNA水平。結(jié)果與假手術(shù)組比，模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高，腦含水量及腦梗死率增加，腦組織HIF-1α蛋白、VEGF蛋白及mRNA水平上調(diào)(P＜0.05)。與模型組比，亞低溫組神經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低(χ2=26.657,P＜0.001)，腦含水量及腦梗死率降低，腦組織HIF-1α蛋白、VEGF蛋白及mRNA水平進(jìn)一步上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論亞低溫可能通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)VEGF上調(diào)，促進(jìn)缺血組織區(qū)新生血管形成，從而發(fā)揮對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用。

缺血再灌注；亞低溫；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；低氧誘導(dǎo)因子-1α；大鼠

[本文著錄格式]程黎，賈功偉.亞低溫對(duì)腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(6):667-671.

CITED AS:Cheng L,Jia GW.Effect of mild hypothermia on expression of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1α in rats with cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(6):667-671.

缺血性腦卒中是由于腦血管狹窄或閉塞導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，腦細(xì)胞死亡，并引起神經(jīng)功能缺損癥狀的一種疾病[1]，具有高致死率及致殘率的特點(diǎn)[2-3]。研究表明，腦缺血后血管新生可以促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的建立，增加缺血區(qū)域組織低灌注[4]，從而改善患者預(yù)后[5]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、提高毛細(xì)血管滲透壓的細(xì)胞因子[6]，能刺激血管發(fā)生和血管再生，發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)及神經(jīng)保護(hù)作用[7]。缺氧能觸發(fā)VEGF的產(chǎn)生[8]。低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是缺氧條件下哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在組織缺氧時(shí)，其降解減少，濃度增高[9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可與VEGF啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，從而上調(diào)VEGF的基因轉(zhuǎn)錄水平，增加VEGF蛋白表達(dá)[10]。

亞低溫作為目前被證實(shí)有確切神經(jīng)保護(hù)作用的治療措施之一，其減輕腦缺血時(shí)腦組織梗死體積及腦水腫的作用不論在臨床還是基礎(chǔ)研究中均得到證實(shí)[11-12]，但其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制尚不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)亞低溫可增加局部腦缺血時(shí)海馬VEGF的表達(dá)[13]。因此，我們推測(cè)亞低溫可能通過(guò)HIF-1α上調(diào)VEGF的表達(dá)，刺激血管再生，改善腦缺血預(yù)后。

本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討亞低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注后皮層區(qū)VEGF表達(dá)的影響，明確亞低溫在缺血性腦卒中中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠45只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試劑和儀器

ELISA試劑盒：北京四正柏生物科技有限公司?？俁NA提取試劑盒：北京BIOTAKE公司。RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司。大鼠肛溫溫度計(jì)、低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)儀器由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院提供。

1.3 方法

45只大鼠最終納入30只進(jìn)行研究，其中死亡大鼠12只，未觀察到神經(jīng)損傷癥狀大鼠3只。30只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組和亞低溫組，每組10只。按Longa法[14]制備大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)動(dòng)物模型。大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg麻醉，固定于簡(jiǎn)易手術(shù)臺(tái)上，頸正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露頸總、外動(dòng)脈，在其近心端用手術(shù)線結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈近分叉處暫時(shí)夾閉血管，用手術(shù)剪剪一細(xì)切口，插入線栓，將其緩慢推入頸內(nèi)動(dòng)脈18～20 mm，縫合傷口，2 h后拔出栓線。動(dòng)物清醒后參考Longa的5分制法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[15]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，無(wú)法行走。

假手術(shù)組除不插入栓線外余操作步驟同前。亞低溫組大鼠造模后放入裝有冰袋和碎冰的代謝籠中，測(cè)大鼠肛溫降至(33±1)℃，持續(xù)亞低溫24 h后取出并自然復(fù)溫。

模型排除標(biāo)準(zhǔn)：①Longa評(píng)分0分的大鼠；②未到觀察時(shí)間點(diǎn)死亡的大鼠。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：Longa評(píng)分1～4分。再灌注24 h后再次進(jìn)行評(píng)分。

1.4 評(píng)價(jià)方法

1.4.1 腦含水量測(cè)定

再灌注24 h時(shí)，各組取3只大鼠10%水合氯醛過(guò)量麻醉，斷頭取腦，去掉低位腦干、小腦以及嗅球，濾紙吸干稱重后放入60℃烤箱48 h至恒重后稱干重，根據(jù)公式計(jì)算含水量：

1.4.2 TTC染色觀察腦梗死體積

再灌注24 h時(shí)，各組取3只大鼠10%水合氯醛過(guò)量麻醉，斷頭取腦，將大腦組織置于-20℃冰箱20 min后冠狀均勻切成5片，浸于2%TTC溶液，37℃培養(yǎng)箱中避光染色30 min，再于4%多聚甲醛固定。此時(shí)梗死區(qū)域呈白色，正常組織呈紅色，拍照后用Image-Pro Plus軟件計(jì)算腦梗死率：

1.4.3 ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織VEGF、HIF-1α蛋白含量

再灌注24 h時(shí)，各組取4只大鼠麻醉后經(jīng)心尖處插管，生理鹽水150 ml灌注，冰上取缺血半暗帶區(qū)域腦組織(距額葉前端4 mm和8 mm處行冠狀切片，取中間4 mm厚腦塊，沿矢狀線旁開(kāi)4 mm，右開(kāi)30°切片所得楔形組織)，-80℃保存。稱取腦組織，每毫克組織加入10 μl裂解液，超聲裂解1 min，4℃靜置30 min，12,000 r/min離心15 min，取上清。

按ELISA試劑盒說(shuō)明操作：配置不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，和稀釋后的組織勻漿液一起復(fù)孔加入樣品孔，100 μl/孔，封板，37℃孵育90 min。除去封板膜，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入抗大鼠VEGF或HIF-1α抗體工作液100 μl，37℃孵育60 min，洗板后每孔加入酶結(jié)合物工作液100 μl，37℃孵育30 min，洗板后每孔加入顯色底物100 μl，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min后加入終止液。酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值。以pg/mg表示蛋白含量。

1.4.4 qPCR法測(cè)大鼠腦組織VEGF的mRNA表達(dá)水平

于-80℃冰箱取出已取缺血半暗帶區(qū)域腦組織，按總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠腦組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VEGF的上游引物為5'-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3'，下游引物為5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；內(nèi)參β-actin的上游引物為5'-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3'，下游引物為5'-GTCACGCACGATTCCCTCT-3'。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃60 s，55℃45 s，72℃60 s，72℃10 min，共40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(xˉ±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；等級(jí)資料的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

再灌注24 h后，模型組、亞低溫組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較假手術(shù)組均升高，亞低溫組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著低于模型組(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(n)

2.2 腦含水量

模型組、亞低溫組腦組織含水量較假手術(shù)組增加(P＜0.05)；亞低溫組腦含水量低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 腦梗死率

模型組、亞低溫組腦梗死率較假手術(shù)腦梗死率均增加(P＜0.05)；亞低溫組腦梗死率低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組腦含水量及梗死體積的比較

2.4 VEGF及HIF-1α蛋白水平

模型組、亞低溫組腦組織VEGF及HIF-1α蛋白水平均較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，亞低溫組腦組織VEGF及HIF-1α蛋白水平較模型組增高(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較(pg/mg)

2.5 VEGF mRNA水平

模型組、亞低溫組腦組織VEGF mRNA水平均較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，亞低溫組較模型組增高(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組VEGF mRNA表達(dá)水平的比較

圖1 各組大鼠腦TTC染色

3 討論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建經(jīng)典的模擬缺血性腦血管病的大鼠MCAO模型，旨在觀察亞低溫對(duì)大鼠缺血性腦梗死的影響及潛在機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞低溫組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低，腦含水量及腦梗死體積減少，證明亞低溫能減輕腦水腫，縮小缺血半暗帶移行區(qū)，對(duì)急性期缺血性腦卒中有保護(hù)作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，亞低溫組HIF-1α及VEGF蛋白含量進(jìn)一步增高，提示增加HIF-1α及VEGF表達(dá)可能與亞低溫發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

腦缺血發(fā)生時(shí)，缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速壞死，半暗區(qū)細(xì)胞處于低灌注狀態(tài)，及時(shí)恢復(fù)該區(qū)血供能有效改善神經(jīng)功能缺損[16]。VEGF作為參與血管重塑的關(guān)鍵因子之一[17]，在腦缺血缺氧時(shí)表達(dá)迅速增多，能促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成，建立側(cè)支循環(huán)，有效改善缺血區(qū)低灌注[18-19]，一直是腦血管疾病研究的熱點(diǎn)。但僅依靠?jī)?nèi)源性血管新生恢復(fù)腦缺血后神經(jīng)缺損功能效用有限，補(bǔ)充外源性的VEGF進(jìn)一步提高其含量能促進(jìn)MCAO模型大鼠血管新生[20]，改善感覺(jué)和認(rèn)知功能損害[21]。臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血清VEGF濃度與神經(jīng)功能恢復(fù)正相關(guān)[22]。本研究中VEGF在假手術(shù)組呈現(xiàn)低表達(dá)，在模型組表達(dá)增強(qiáng)，與既往研究結(jié)果缺血缺氧誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增多一致[20]，而亞低溫組VEGF較模型組進(jìn)一步增高。

HIF-1是一種缺氧誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子[23]，缺氧對(duì)HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過(guò)α亞基即HIF-1α來(lái)實(shí)現(xiàn)[24]。組織缺氧時(shí)HIF-1α降解減少，并可通過(guò)激活乳酸脫氫酶等多種酶促進(jìn)糖的轉(zhuǎn)移利用，為細(xì)胞修復(fù)提供能量[25]；同時(shí)HIF-1α還可結(jié)合VEGF啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件，上調(diào)其表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，HIF-1α與VEGF蛋白含量的變化趨勢(shì)在各組中均保持一致，VEGF mRNA水平亦呈現(xiàn)同步上調(diào)，提示腦缺血時(shí)HIF-1α可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)VEGF表達(dá)。

綜上所述，亞低溫可通過(guò)增加HIF-1α的表達(dá)，介導(dǎo)VEGF上調(diào)，促進(jìn)缺血組織新生血管形成，從而發(fā)揮對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用。

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Effect of Mild Hypothermia on Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Hypoxia-inducible Factor-1α in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

CHENG Li1,JIA Gong-wei2
1.Department of ICU,Chongqing Emergency Medical Center,Chongqing 400010,China;2.Department of Rehabilitation,the SecondAffiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China

JIA Gong-wei.E-mail:jiagongwei＠163.com

Objective To observe the effect of mild hypothermia on expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in brain tissues in rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group and mild hypothermia group with ten rats in each group.The latter two groups were established middle cerebral artery occlusion(MCAO)for two hours and reperfusion model.The mild hypothermia group

mild hypothermia treatment for 24 hours.The neurologic function was evaluated with Longa's score.The brain water content was measured by wet/dry method.The infarction area ratio was assessed by TTC staining.The protein levels of VEGF and HIF-1α were determined by ELISA,while the mRNA level of VEGF was assessed by qPCR.Results Compared with the sham group,the score of neurologic score,the brain water content ratio and the infarction area ratio,the expression of VEGF protein and HIF-1α protein,and the mRNA level of VEGF increased in the model group(P＜0.05).Compared with the model group,the score of neurologic score significantly decreased(χ2=26.657,P＜0.001),the brain water content ratio and the infarction area ratio decreased(P＜0.05),and the expression of VEGF protein and HIF-1α protein,and the mRNA level of VEGF further increased(P＜0.05)in the mild hypothermia group.Conclusion Mild hypothermia may protect against ischemic-induced neurologic injury by up-regulating the expression of VEGF and HIF-1α,and promote the angiogenesis in the rats with cerebral ischemia-reperfusion.

ischemia-reperfusion;mild hypothermia;vascular endothelial growth factor;hypoxia-inducible factor-1α;rats

R743.3

A

1006-9771(2017)06-0667-05

2017-02-21

2017-03-31)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.06.010

重慶市衛(wèi)生計(jì)生委2014年醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.20142077)。

1.重慶市急救醫(yī)療中心ICU，重慶市400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶市400010。作者簡(jiǎn)介：程黎(1983-)，女，漢族，湖北隨州市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：賈功偉，男，主治醫(yī)師。E-mail:jiagongwei＠163.com。