張 玲，劉 祥，許彥梅，李新瓊，王 紅，熊衍文

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四川自貢地區(qū)健康人群中艾伯特埃希菌的分離鑒定

張 玲1，劉 祥1，許彥梅2，李新瓊1，王 紅1，熊衍文2

目的 了解長(zhǎng)期從事雞鴨等家禽養(yǎng)殖及屠宰人員等健康人群艾伯特埃希菌的攜帶情況。方法 收集家禽養(yǎng)殖、屠宰人群及其他健康人糞便，經(jīng)EC肉湯增菌后PCR檢測(cè)eae基因，陽(yáng)性樣品接種麥康凱瓊脂，挑選不發(fā)酵乳糖菌落，通過(guò)16S rDNA序列分析和多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。分離株進(jìn)行緊密粘附素亞型和cdtB亞型分析，并通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析與動(dòng)物來(lái)源艾伯特埃希菌菌株間的相關(guān)性。結(jié)果 從189份從事雞鴨宰殺人員的糞便中，分離到2株艾伯特埃希菌，從58份其他健康人群糞便中分離到1株菌，而138份家禽養(yǎng)殖場(chǎng)人員糞便中未分離到菌株。3株菌株的緊密粘附素亞型分別為sigma, iota 2, nu，cdtB亞型均為 II/III/V亞型。PFGE顯示三株菌之間的帶型相似性小于80%，并且與雞鴨等來(lái)源的艾伯特埃希菌帶型不同。結(jié)論 從事雞鴨屠宰等健康人員中存在一定程度的艾伯特埃希菌攜帶率，但其與家禽攜帶艾伯特埃希菌的關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。

艾伯特埃希菌；健康人群；eae；MLST；PFGE

艾伯特埃希菌是2003年命名的埃希菌屬中的一個(gè)新種，作為一種腸道病原菌，可引起人感染性腹瀉。1991年Albert等首次從孟加拉達(dá)卡腹瀉兒童糞便標(biāo)本中分離到艾伯特埃希菌[1]。由于艾伯特埃希菌缺乏區(qū)分其他腸道致病菌，尤其是區(qū)分大腸埃希菌的特異性生化特征，傳統(tǒng)的商品化生化鑒定系統(tǒng)往往將艾伯特埃希菌鑒定為魯氏耶爾森菌，沙門氏菌，蜂窩哈夫尼亞菌，或大腸埃希菌等，使實(shí)驗(yàn)室對(duì)其鑒定存在相對(duì)困難，往往被誤檢為同樣攜帶eae基因的EPEC/EHEC。目前主要采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)，16srDNA測(cè)序等分子生物學(xué)方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行聚類分析[2]。Ooka等[2]對(duì)278株eae陽(yáng)性鑒定為大腸埃希菌的菌株進(jìn)一步通過(guò)多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)等分析，從中鑒定出26株為艾伯特埃希菌，其中14株來(lái)自人，11株來(lái)自鳥(niǎo)類，1株來(lái)自貓科動(dòng)物，14份來(lái)自人的菌株中，有13份是分離自胃腸道感染患者。近年來(lái)日本出現(xiàn)多起由艾伯特埃希菌引起的食物中毒報(bào)道[3-5]。2004年美國(guó)阿拉斯加出現(xiàn)的一起大規(guī)模金翅鳥(niǎo)雀死亡也與艾伯特埃希菌有關(guān)[6]，近期韓國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查表明，多種鳥(niǎo)類可攜帶艾伯特埃希菌[7]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)艾伯特埃希菌引起人類感染導(dǎo)致腹瀉疾病的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。我們前期從四川自貢地區(qū)市售生豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉中分離到艾伯特埃希菌，特別是雞腸和鴨腸的檢出率更高[8]。本研究旨在對(duì)中國(guó)四川省自貢市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中長(zhǎng)期從事雞鴨宰殺工作和養(yǎng)殖場(chǎng)中從事雞、鴨及鵪鶉養(yǎng)殖的人群是否攜帶艾伯特埃希菌進(jìn)行調(diào)查，并同時(shí)從市場(chǎng)中采用單純隨機(jī)抽樣的方式抽取一部分工作地點(diǎn)遠(yuǎn)離雞鴨宰殺攤位，從事與生鮮食品產(chǎn)銷無(wú)關(guān)的人群作為對(duì)照，以探討雞鴨等攜帶艾伯特埃希菌對(duì)相關(guān)人群健康的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 2015年6-7月，收集四川省自貢地區(qū)從事雞、鴨、鵪鶉養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖人員糞便138份、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中雞鴨屠宰人員糞便189份，并收集遠(yuǎn)離雞鴨宰殺攤位，從事與生鮮食品產(chǎn)銷無(wú)關(guān)的對(duì)照人群糞便58份。上述人員近期(2周內(nèi))均無(wú)腹瀉病史。樣品具體信息如表1所示。糞便樣品置30%甘油的腦心肉湯保存管中，低溫運(yùn)送到自貢市疾病預(yù)防控中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱(黃石恒豐)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、SensoQuest Labcycler PCR儀(德國(guó)SensoQuest)、GEL DocXR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad )。

1.2.2 主要試劑 EC肉湯、木糖、乳糖購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs 及DNA Marker：購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq MasterMIX(含染料)和DNA Marker(DM1000)：購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；核酸染料(GeneGreen)：購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成及測(cè)序：由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.3 艾伯特埃希菌篩查 取1 mL左右糞便保存液于5 mL EC肉湯中，20 ℃震蕩培養(yǎng)24—36 h。取1 mL增菌液至1.5 mL無(wú)菌離心管中，8 000 r/min離心8 min，棄上清，以100 μL去離子水重懸后，水煮10 min，10 000 r/min離心3 min，上清液作即為PCR檢測(cè)模板，檢測(cè)eae基因[3]。將eae基因檢測(cè)陽(yáng)性的EC增菌液，接種麥康凱瓊脂，36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選無(wú)色圓形光滑菌落，PCR檢測(cè)eae基因。eae陽(yáng)性菌落傳代到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)。菌株純培養(yǎng)后進(jìn)行乳糖、木糖發(fā)酵和動(dòng)力試驗(yàn)。

1.4 艾伯特埃希菌菌株鑒定 將eae陽(yáng)性、不發(fā)酵乳糖、不發(fā)酵木糖及無(wú)動(dòng)力菌株，進(jìn)行16S rDNA序列分析，即以上游引物16S-F(5′-agagtttgatcmtggctcag-3′)和下游引物16S-R (5′-tacggytaccttgttacgactt-3′)PCR擴(kuò)增疑似菌株，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)和聚類分析[9]。根據(jù)大腸埃希菌大腸埃希菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)提供的7個(gè)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)，對(duì)艾伯特埃希菌疑似菌株進(jìn)行MLST分析。MLST參考菌株的選擇、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建按照文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。

1.5 艾伯特埃希菌分子特征分析 緊密粘附素分型分析及cdtB基因檢測(cè)和分型分析，參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。參照PulseNet非O157大腸埃希菌PFGE分型方案，對(duì)3株艾伯特埃希菌進(jìn)行PFGE分型分析，并使用BioNumerics 4.0軟件對(duì)健康人群分離菌株及動(dòng)物來(lái)源分離株構(gòu)建UPGMA聚類樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 樣品初篩結(jié)果 從189份從事雞鴨宰殺人員的糞便中，分離到2株eae基因陽(yáng)性不發(fā)酵乳糖和木糖、動(dòng)力陰性的疑似菌株，檢出率為1.06%；從138份家禽養(yǎng)殖場(chǎng)人員糞便中未分離到疑似菌株。從58份對(duì)照人群糞便中分離到eae基因陽(yáng)性1份不發(fā)酵乳糖和木糖、動(dòng)力陰性的疑似菌株，檢出率為1.72%。家禽屠宰、養(yǎng)殖人群和其他健康人群艾伯特埃希菌疑似菌株篩查情況見(jiàn)表1。

表1 家禽屠宰、養(yǎng)殖人群和其他健康人群艾伯特埃希菌疑似菌株篩查情況
Tab.1 The situation of screening suspectedEscherichiaalbertiifor poultry slaughter population, poultry farming population and other healthy population

健康人群Healthypopulation初篩陽(yáng)性率%Screeningpositiverate%家禽屠宰人群Poultryslaughterpopulation1.06(2/189)家禽養(yǎng)殖人群Poultrybreedingpopulation0(0/138)其他健康人群Otherhealthypopulation1.72(1/58)合計(jì)Total0.78(3/385)

2.2 疑似菌株的鑒定

2.1.1 16S rDNA序列分析 16S rDNA序列分析基因測(cè)序長(zhǎng)度為1 506 bp，去掉兩端測(cè)序無(wú)效的序列，最后獲得1 404 bp長(zhǎng)度序列用于分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明此次分離的3株菌株與艾伯特埃希菌參考菌株LMG 20976、KF1、NBRC107761、TW07627等相似性最大，而與大腸埃希菌、弗格森埃希菌等參考菌株差異較大，支持這3株疑似菌株均為艾伯特埃希菌。

2.1.2 多位點(diǎn)序列分析(MLST) 按照大腸埃希菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)提供的分型方案，獲得7個(gè)管家基因的序列，并將這7個(gè)基因的序列拼接后獲得3 423 bp長(zhǎng)度的序列，以大腸埃希菌K-12 MG1655的序列為參考與艾伯特埃希菌參考菌株LMG 20976、KF1菌株序列構(gòu)建Neighbor-Joining樹(shù)，見(jiàn)圖1。MLST分析表明，3株疑似菌株中有2株序列完全一致，與另一株存在較小的差異，這3株分離株均與艾伯特埃希菌親緣關(guān)系最近。根據(jù)16S rDNA序列分析和MLST分析結(jié)果，可以確定這3株疑似菌株菌為艾伯特埃希菌。

圖1 3株艾伯特埃希菌與參考菌株基于7個(gè)管家基因序列的Neighbor-Joining樹(shù)Fig.1 Neighbour-joining dendrogram of three E.albertii strains and reference strains based on the seven housekeeping genes

2.3 菌株分子生物學(xué)特征

2.3.1 緊密粘附素亞型及cdtB分型結(jié)果 根據(jù)緊密粘附素全長(zhǎng)序列的聚類分析結(jié)果，從雞鴨宰殺人群糞便中分離的TS20150072菌株是Sigma亞型，TS20150248菌株是iota 2亞型，而對(duì)照人群糞便中分離的TS20150298菌株屬于nu亞型。3株分離株cdtB亞型均為II/III/V亞型群，見(jiàn)圖2。

2.3.2 PFGE分型結(jié)果 3株健康人群的艾伯特埃希菌均產(chǎn)生了較清晰的條帶，并且3株菌之間的PFGE帶型均不相同。通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)自雞腸、鴨腸、雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉及白鷺糞便中分離的48株艾伯特埃希菌PFGE帶型聚類比較分析，發(fā)現(xiàn)這3株健康人群菌株的帶型與動(dòng)物源性菌株的PFGE帶型存在差異，且聚類相似性均小于80%，見(jiàn)圖2。

3 討 論

艾伯特埃希菌作為一種非常重要的潛在新發(fā)食源性致病菌，它可以引起人類胃腸道疾病，如腹瀉、腹脹、發(fā)熱、脫水、嘔吐等，與多起食源性疾病爆發(fā)有關(guān)[11-12]。日本有多起報(bào)道從腸胃炎的患者中分離鑒定出艾伯特埃希菌[13-14]，美國(guó)明尼蘇達(dá)州和伊利諾斯州的腹瀉患者、幾內(nèi)亞比紹兒童也分離到該菌[6、15-16]。Inglis TJ 等在患有胃腸道感染的76歲菌血癥患者的血液、糞便中檢出艾伯特埃希菌，是第一例艾伯特埃希菌腸外感染病例[17]。

艾伯特埃希菌是一種引起人畜共患病的病原體，因此在家禽家畜，野生動(dòng)物，鳥(niǎo)類等動(dòng)物宿主也有報(bào)道檢出。中國(guó)四川地區(qū)從野生白鷺?lè)蛛x到1株，從雞腸、鴨腸中分離到37株艾伯特埃希菌[8],Ooka等從1株來(lái)自貓科動(dòng)物樣本中鑒定出1株艾伯特埃希菌[2]，此外，在北美、歐洲、澳大利亞的各種野生和家養(yǎng)鳥(niǎo)類中也檢出了艾伯特埃希菌[6]。在各種食品和飲用水中也有艾伯特埃希菌感染的報(bào)道。中國(guó)四川地區(qū)從雞肉、羊肉、豬肉、鴨肉分離到7株艾伯特埃希菌[8]，在在美國(guó)的雞漂洗液中也檢出艾伯特埃希菌[18]。在匈牙利醫(yī)院的飲用水分配系統(tǒng)中也有檢出[19]。

圖2 3株健康人群艾伯特埃希菌分離株與48株動(dòng)物源性艾伯特埃希菌菌株的PFGE帶型聚類圖Fig.2 Dendrogram of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) profiles of E.albertii between 3 strains from people stool and 48 strains from animal derived food

本項(xiàng)目在雞腸、鴨腸、雞肉、鴨肉檢出較多艾伯特埃希菌，那么長(zhǎng)期從事雞鴨養(yǎng)殖、宰殺等的人群危險(xiǎn)性是否高于一般的人群，這種危險(xiǎn)性是否造成艾伯特埃希菌感染的流行都需要加以關(guān)注。本次研究為主動(dòng)監(jiān)測(cè)，從189份從事雞鴨宰殺人員的糞便中，分離到2株艾伯特埃希菌，從58份其他健康人群糞便中分離到1株菌，而138份家禽養(yǎng)殖場(chǎng)人員糞便中未分離到菌株，說(shuō)明健康人群中確實(shí)攜帶該菌。國(guó)外暫時(shí)未見(jiàn)對(duì)密切接觸人群艾伯特埃希菌感染情況調(diào)查的報(bào)道。

通過(guò)PFGE帶型的對(duì)比分析，此次分離的3株菌株與雞腸、鴨腸、雞肉、鴨肉、牛肉、白鷺等樣品中分離的菌株的帶型存在差異，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)兩者之間的遺傳學(xué)聯(lián)系。但是此次實(shí)驗(yàn)說(shuō)明從事雞鴨宰殺的人群確實(shí)能檢出艾伯特埃希菌，也就是說(shuō)這類人群是可能成為病原體的傳染源。

目前國(guó)內(nèi)外都缺乏艾伯特埃希菌商品化生化鑒定系統(tǒng)，限制了在食物中艾伯特埃希菌的發(fā)病率調(diào)查。我國(guó)作為食源性腹瀉多發(fā)國(guó)家之一，艾伯特埃希菌很可能是導(dǎo)致腹瀉疾病的病原體，因此在我國(guó)系統(tǒng)的開(kāi)展對(duì)該菌的檢測(cè)，研究致病機(jī)制，確定危險(xiǎn)因素，對(duì)有效控制該菌的感染和暴發(fā)至關(guān)重要。下一步可以通過(guò)增加樣本量來(lái)提高檢出率，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析確定艾伯特埃希菌感染的高危因素。通過(guò)建立該病原體檢測(cè)的技術(shù)儲(chǔ)備，結(jié)合分子生物學(xué)研究，對(duì)艾伯特埃希菌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、有效控制，進(jìn)而保護(hù)人群健康具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[20]。

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Identification ofEscherichiaalbertiifrom healthy carriers in Zigong,Sichuan Province, China

ZHANG Ling1, LIU Xiang1,XU Yan-mei2, LI Xin-qiong2,WANG Hong1, XIONG Yan-wen2

(1.ZigongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zigong643000,China；2.StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the carrying situation ofEscherichiaalbertiifrom healthy people engaged in breeding and slaughtering poultry for a long time. We collected stool samples from people engaged in breeding and slaughtering poultry and other healthy people. After enriched with EC broth,eae-positive enrichment culture was directly streaked on MacConkey, andeae-positive lactose non-fermenting isolate was retained for further investigation. The 16S rDNA sequencing and multilocus sequence typing (MLST) were applied in the identification ofE.albertiifrom suspected strains. Intimin subtypes andcdtBtypes ofE.albertiistrains were detected. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to detected genetic polymorphism of strains from this study and animal source ones. Results showed that two isolates were identified asE.albertiifrom 189 stools of people exposed to slaughtering chickens and ducks and one from 58 stools in control groups. No isolate was identified asE.albertiifrom 138 stools samples of people exposed to breeding poultry. Intimin subtypes of three isolates from stool samples were subtyped as sigma, iota 2, nu, andcdtBtypes were closely related to types II/III/V. PFGE patterns of the three strains was distinguishable (<80% similarity), and appeared in different cluster with chickens, ducks and other sources ofE.albertiistrains. The rate of carryingE.albertiito a certain extent exist in healthy people engaged in slaughtering chickens and ducks, and the relationship between these strains and strains from poultry should be further investigated.

Escherichiaalbertii; healthy carriers; eae; MLST; PFGE

s:Wang Hong, Email: 460973389@qq.com；Xiong Yan-wen, Email: xiongyanwen@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.019

自貢市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013S06)，四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(No.150259),傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No.2016SKLID309)聯(lián)合資助

王 紅，Email: 460973389@qq.com； 熊衍文，Email: xiongyanwen@icdc.cn

1.自貢市疾病預(yù)防控制中心，自貢 643000； 2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

R378

A

1002-2694(2017)06-0569-05

2016-09-01 編輯：梁小潔

Supported by the Zigong Key Science and Technology Program(No.2013S06),the Health and Family Planning Commission of Sichuan Province(No.150259)and the Open Project from State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control(No.2016SKLID309)