苗 燕，張炎晶，劉利平*，陳 娟，趙育芳，魯 琴

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，山西 太原 030001；2.山西省人民醫(yī)院超聲科，山西 太原 030012)

裸鼠膽囊癌皮下移植瘤超聲造影定量參數(shù)與血管生成及細(xì)胞增殖的相關(guān)性

苗 燕1，張炎晶1，劉利平1*，陳 娟1，趙育芳1，魯 琴2

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，山西 太原 030001；2.山西省人民醫(yī)院超聲科，山西 太原 030012)

目的 探討裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS定量參數(shù)與腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖狀態(tài)的相關(guān)性。方法 建立裸鼠膽囊癌皮下移植瘤模型，測定CEUS定量參數(shù)和微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 成功建立移植瘤20個(gè)，最終CEUS成功16個(gè)。裸鼠膽囊癌皮下移植瘤PI與MVD、PCNA呈正相關(guān)(r=0.635、0.514，P=0.008、0.042)，而CEUS各定量參數(shù)與VEGF表達(dá)均無相關(guān)性(P均>0.05)。裸鼠膽囊癌皮下移植瘤MVD與VEGF、PCNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.680、0.650，P=0.004、0.006)，VEGF與PCNA呈正相關(guān)(r=0.611，P=0.012)。結(jié)論 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤PI與MVD、PCNA呈正相關(guān)，有助于評(píng)估腫瘤的血管生成及細(xì)胞增殖狀態(tài)；MVD、VEGF、PCNA兩兩之間均呈正相關(guān)，表明腫瘤血管生成與細(xì)胞增殖之間相互促進(jìn)，共同促進(jìn)腫瘤生長。

膽囊腫瘤；超聲檢查；造影劑；微血管密度；血管內(nèi)皮生長因子；增殖細(xì)胞核抗原

原發(fā)性膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，惡性程度高，發(fā)病率呈上升趨勢，且早期診斷困難，預(yù)后極差，5年生存率僅5%左右[2]。CEUS可實(shí)時(shí)顯示造影劑微泡在膽囊癌組織微血管內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，觀察病灶的血流灌注特征及供血血管的走行等[3-4]，可有效提高膽囊癌的診斷效能[5-6]。本研究通過建立裸鼠膽囊癌皮下移植瘤模型，探討CEUS在評(píng)價(jià)裸鼠膽囊癌血流灌注、血管生成和細(xì)胞增殖狀態(tài)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型制備 正常健康BALB/C裸鼠12只，雄性，3～4周齡，體質(zhì)量16～18 g(購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(無特定病原體飼養(yǎng)室)。GBC-SD人膽囊癌細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞株從1名61歲的男性低分化膽囊癌患者中建立)。

隨機(jī)選取2只裸鼠作為荷瘤鼠，于裸鼠右側(cè)肩胛區(qū)皮下接種0.2 ml濃度為1×107/ml的GBC-SD細(xì)胞懸液，以結(jié)節(jié)直徑達(dá)5 mm×5 mm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。待瘤體長徑約1 cm后，用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，鈍性剝離瘤體，選取腫瘤邊緣有活力的瘤體，用眼科剪將其剪碎為體積約1 mm3的瘤塊，放于盛有生理鹽水的治療碗中清洗備用。

取10只裸鼠同上法麻醉后消毒裸鼠雙側(cè)肩胛區(qū)皮膚，剪開長約2～4 mm的切口，隨機(jī)夾取2～3塊已備好的瘤塊，塞入切口周圍皮下，縫合、消毒。連續(xù)3天對(duì)裸鼠后腿部進(jìn)行青霉素肌肉注射，防止術(shù)后感染，3天后拆線。21天后成功建模。

1.2儀器與方法 采用GE Logiq E9型彩色超聲診斷儀，ML6-15寬頻探頭，頻率15 MHz，機(jī)械指數(shù)0.09，造影劑為SonoVue。造影過程中顯像深度、聲壓和增益等設(shè)置均保持不變。將裸鼠麻醉后側(cè)臥位保定于檢查床。先常規(guī)超聲觀察并選擇腫瘤的最大切面，測量腫瘤長徑(L)和前后徑(W)，依據(jù)公式計(jì)算體積：體積=長徑×前后徑2/2。再按預(yù)設(shè)造影條件進(jìn)入造影模式，消毒裸鼠尾靜脈，快速推注SonoVue混懸液0.1 ml[7]，即刻計(jì)時(shí)，動(dòng)態(tài)觀察并存儲(chǔ)圖像?？身樌瓿稍煊皠┑耐谱⑶乙浦擦鲲@影即視為CEUS成功。

1.3圖像分析 采用TIC-Analysis定量分析軟件，避開腫瘤中央壞死區(qū)及較粗大血管，于腫瘤周邊強(qiáng)化區(qū)內(nèi)勾畫相同大小ROI(2 mm×2 mm)，獲得定量參數(shù)：到達(dá)時(shí)間(arrival time, AT)、達(dá)峰時(shí)間(time to peak, TTP)、峰值強(qiáng)度(peak intensity, PI)、曲線下面積(area under curve, AUC)1(AT到TTP內(nèi)的AUC)、AUC 2(AT到其后1 min內(nèi)的AUC)，由2名有經(jīng)驗(yàn)的超聲診斷醫(yī)師進(jìn)行CEUS檢查及分析，并達(dá)成一致意見。

1.4免疫組化染色與結(jié)果判定 CEUS后處死裸鼠，及時(shí)剝離腫瘤，在福爾馬林溶液中固定、脫水、透明，石蠟包埋、切片，行HE染色及免疫組化染色。

免疫組化中的一抗為抗CD34多克隆抗體、抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗體和抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(均購自北京中杉金橋生物工程公司)。按照試劑說明書進(jìn)行免疫組化染色，參照文獻(xiàn)[8]判斷腫瘤微血管密度(microvessel density, MVD)：先于100倍鏡下尋找3個(gè)血管密集區(qū)(即“熱點(diǎn)”)，再于250倍鏡下計(jì)數(shù)棕染的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇的數(shù)目，不論微血管管腔形成與否均視為1個(gè)微血管計(jì)數(shù)，其均值為該切片的MVD。VEGF表達(dá)水平的判斷：先于100倍鏡下尋找3個(gè)胞漿和胞膜棕染的陽性細(xì)胞密集區(qū)，再轉(zhuǎn)至250倍鏡下，根據(jù)染色范圍(陰性為0分；陽性細(xì)胞 1%～25%為1分；陽性細(xì)胞26%～50%為2分；陽性細(xì)胞51%～75%為3分；陽性細(xì)胞76%～100%為4分)和染色強(qiáng)度(0分：陰性；1分：弱陽性；2分：陽性；3分：強(qiáng)陽性)進(jìn)行評(píng)分，兩者得分相加記為單個(gè)視野的總分，測3個(gè)視野取平均值[9]。PCNA表達(dá)水平的判斷：以細(xì)胞核棕染視為陽性表達(dá)；評(píng)分方法與VEGF相同[10]。

表1 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS定量參數(shù)與MVD、VEGF、 PCNA的相關(guān)性分析結(jié)果

圖1 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS表現(xiàn) A.瘤體剖面圖，瘤體蒼白、質(zhì)韌； B.增強(qiáng)早期(2 s)瘤體呈快速環(huán)形增強(qiáng)(箭)； C.達(dá)峰時(shí)(6 s)瘤體整體明顯均勻增強(qiáng)(箭)； D.增強(qiáng)晚期瘤體逐漸廓清(箭)

2 結(jié)果

成功建立裸鼠膽囊癌皮下移植瘤20個(gè)，其中2只(4個(gè)移植瘤)因經(jīng)尾靜脈推注SonoVue混懸液不成功，次日死亡，最終CEUS成功的移植瘤共16個(gè)。常規(guī)超聲測量腫瘤平均長徑(0.92±0.27)cm，前后徑(0.67±0.18)cm，體積(0.25±0.22)cm3，呈均勻或不均勻低回聲，圓形或橢圓形，外生性和膨脹性生長，邊界尚清。

2.1CEUS表現(xiàn) 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS早期呈快速環(huán)形增強(qiáng)，其中5個(gè)移植瘤達(dá)峰值時(shí)整體呈均勻增強(qiáng)(圖1)，11個(gè)移植瘤中央伴不規(guī)則狀持續(xù)無增強(qiáng)區(qū)，增強(qiáng)晚期腫瘤內(nèi)造影劑逐漸廓清。

2.2病理表現(xiàn) 瘤體大體標(biāo)本蒼白、質(zhì)韌(圖1A)，部分瘤體中央呈乳糜樣壞死。鏡下觀察：HE染色示腫瘤細(xì)胞排列雜亂，內(nèi)有大量分化程度低、形狀不規(guī)則、大小不一、胞質(zhì)豐富的深染巨核細(xì)胞，細(xì)胞核異型性明顯，同時(shí)可見少量核分裂象及多核瘤巨細(xì)胞(圖2)。

2.3相關(guān)性分析 16個(gè)移植CEUS定量參數(shù)AT、TTP、PI、AUC1、AUC2分別為(0.40±0.29)s、(6.37±3.51)s、(16.75±5.82)dB、52.88±29.83、582.93±335.60，MVD計(jì)數(shù)為13.09±3.45；VEGF蛋白表達(dá)為4.75±0.46；PCNA蛋白表達(dá)為4.75±1.44。PI與MVD、PCNA呈正相關(guān)(r=0.635、0.514，P=0.008、0.042)，CEUS各定量參數(shù)與VEGF均無相關(guān)性，見表1。MVD與VEGF、PCNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.680、0.650，P=0.004、0.006)，VEGF與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.611，P=0.012)。

3 討論

CEUS因具有實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、可重復(fù)檢查，以及無創(chuàng)、無輻射、過敏反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來迅速發(fā)展的影像學(xué)方法之一[11-12]。超聲造影劑SonoVue微泡直徑與紅細(xì)胞相當(dāng)，不會(huì)溢出血管外進(jìn)入組織間隙，被稱為純血池顯像劑，可更好地反映腫瘤內(nèi)部及周邊的血流灌注及血管生成情況[13]。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后與腫瘤血管生成密不可分。CEUS與時(shí)間信號(hào)曲線定量參數(shù)相結(jié)合，可很好地反映腫瘤血管生成及血供分布情況，提高病灶血管檢出的敏感度[14]。MVD是腫瘤血管生成研究中的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS早期呈迅速高增強(qiáng)，且CEUS的PI與MVD呈正相關(guān)，提示裸鼠膽囊癌皮下移植瘤屬血管依賴性腫瘤，其內(nèi)新生血管網(wǎng)非常豐富，CEUS可間接提示膽囊癌MVD的表達(dá)水平，有助于評(píng)估腫瘤血管的生成。

VEGF是一個(gè)選擇性促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，屬胱氨酸生長因子超家族，是目前已知的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成促進(jìn)因子之一。本研究顯示裸鼠膽囊癌皮下移植瘤MVD與VEGF的表達(dá)存在正相關(guān) (r=0.680，P=0.004)，可間接反映VEGF有促進(jìn)新生血管形成的作用。但裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS各定量參數(shù)與VEGF的表達(dá)均無相關(guān)性，與既往報(bào)道[15]一致，可能由于腫瘤血管生成有賴于周圍環(huán)境，VEGF雖是最強(qiáng)有力的血管生成促進(jìn)因子，但其血管生成是由多種因子共同作用的結(jié)果。

圖2 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤病理圖(×250) A.HE染色示腫瘤中央細(xì)胞異型性明顯，排列紊亂，細(xì)胞核大深染，分裂象多見； B.CD34染色示血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色； C.VEGF染色示胞漿或胞膜棕染； D.PCNA染色示細(xì)胞核棕染

PCNA是細(xì)胞核內(nèi)合成的一種酸性蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞周期中的DNA復(fù)制，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的可靠指標(biāo)之一，同時(shí)與腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后和復(fù)發(fā)等均有顯著相關(guān)性[16]。本研究顯示裸鼠膽囊癌皮下移植瘤PI與PCNA呈正相關(guān)，有助于評(píng)估腫瘤的細(xì)胞增殖狀態(tài)。另外本研究中MVD、VEGF均與PCNA呈正相關(guān)，提示裸鼠膽囊癌皮下移植瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)與腫瘤組織表達(dá)VEGF進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成密切相關(guān)。

本研究AT、TTP、AUC1、AUC2定量參數(shù)分別與MVD、VEGF及PCNA不存在相關(guān)性，原因可能為：①樣本量較小，AT、TTP、AUC1、AUC2分別表示病灶開始增強(qiáng)的時(shí)間、病灶增強(qiáng)強(qiáng)度達(dá)高峰的時(shí)間及病灶特定時(shí)間范圍內(nèi)的平均血流灌注量，與MVD、VEGF及PCNA間的關(guān)系不明顯；②部分裸鼠麻醉過淺，CEUS中動(dòng)物的晃動(dòng)會(huì)使腫瘤ROI發(fā)生偏移，特別是在腫瘤體積小或內(nèi)部壞死區(qū)域較多時(shí)，CEUS各定量參數(shù)的測值可能受影響。

總之，本研究中MVD、VEGF、PCNA間均存在正相關(guān)關(guān)系，表明腫瘤血管生成與細(xì)胞增殖之間相互促進(jìn)，共同有利于腫瘤的生長發(fā)展；裸鼠膽囊癌皮下移植瘤CEUS的PI值可間接反映腫瘤MVD、PCNA的豐富程度，CEUS定量技術(shù)在評(píng)價(jià)裸鼠膽囊癌血管生成及細(xì)胞增殖狀態(tài)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1] Miller G, Jarnagin WR. Gallbladder carcinoma. Eur J Surg Oncol, 2008,34(3):306-312.

[2] Gourgiotis S, Kocher HM, Solaini L, et al. Gallbladder cancer. Am J Surg, 2008,196(2):252-264.

[3] Xie XH, Xu HX, Xie XY, et al. Differential diagnosis between benign and malignant gallbladder diseases with real-time contrast-enhanced ultrasound. Eur Radiol, 2010,20(1):239-248.

[4] 周琦,姜鈺,劉百靈,等.超聲造影在膽囊癌診斷中的價(jià)值.中華超聲影像學(xué)雜志,2008,17(5):416-418.

[5] 謝曉華,謝曉燕,劉廣健,等.超聲造影與增強(qiáng)CT對(duì)膽囊病變鑒別診斷的對(duì)比研究.中華超聲影像學(xué)雜志,2012,21(12):1048-1051.

[6] 張瀟月,唐少珊.超聲造影鑒別診斷膽囊良惡性病變Meta分析.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2015,31(9):1340-1343.

[7] 王志會(huì),胡向東,錢林學(xué).人肝癌裸鼠模型的超聲造影峰值強(qiáng)度與血管生成關(guān)系的研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(12): 1060-1062.

[8] Weidner N. Chaper 14. Measuring intratumoral microvessel density. Methods Enzymol, 2008,444:305-323.

[9] 湯光宇,肖湘生,劉勇,等.乳腺病變動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI與血管生成的相關(guān)性.中華放射學(xué)雜志,2007,41(11):1205-1208.

[10] 楊重恒.血管內(nèi)皮生長因子、增殖細(xì)胞核抗原在良惡性腮腺多形性腺瘤中的表達(dá)及意義.中國老年學(xué)雜志,2014,34(23):6626-6627.

[11] 張揚(yáng),劉利平.膽囊息肉樣病變的超聲診斷現(xiàn)狀及其新技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展.中國介入影像與治療學(xué),2014,11(12):823-826.

[12] 姜雨姍,姜虹虹,鄒如海,等.超聲造影對(duì)肝腺瘤的診斷價(jià)值.中國中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)雜志,2015,13(6):630-632.

[13] 張會(huì)萍,都偉麗,李凡,等.超聲造影定量評(píng)價(jià)YC-1治療療效的實(shí)驗(yàn)研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(8):676-679.

[14] Zhang H, He Y, Du L, et al. Shorter hepatic transit time can suggest coming metastases: Through monitoring by contrast-enhanced ultrasonography? J Ultrasound Med, 2010,29(5):719-726.

[15] 劉利平,魯琴,張炎晶,等.兔脂肪肝及正常肝內(nèi)VX2移植瘤血管生成的比較及超聲造影參數(shù)與其相關(guān)性研究.中華超聲影像學(xué)雜志, 2014, 23(4): 340-344.

[16] Sch?nenberger F, Deutzmann A, Ferrando-May E, et al. Discrimination of cell cycle phases in PCNA-immunolabeled cells. BMC Bioinformatics, 2015,16:180.

Correlation between CEUS parameters and angiogenesis and cell proliferation of gallbladder carcinoma transplant tumor in nude mice

MIAOYan1,ZHANGYanjing1,LIULiping1*,CHENJuan1,ZHAOYufang1,LUQin2

(1.DepartmentofUltrasound,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2.DepartmentofUltrasound,ShanxiProvincialPeoples'sHospital,Taiyuan030012,China)

Objective To explore the correlation between CEUS blood perfusion characteristics and angiogenesis and cell proliferation in nude mice models of gallbladder carcinoma transplant tumor. Methods Nude mice models of gallbladder carcinoma transplant tumor were established. The blood perfusion characteristics of the nude mice models were quantitatively analyzed, CEUS quantitative parameters and the expression levels of microvessel density (MVD), vascular endothelial growth factor (VEGF) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemically were obtained. The correlations were performed. Results Twenty tumors were successfully established. The CEUS of 16 tumors was successful. There was positive correlation between peak intensity (PI) and MVD, PCNA (r=0.635, 0.514,P=0.008, 0.042). The CEUS parameters were not correlated with expression of VEGF. MVD had positive correlation with expression of VEGF, PCNA (r=0.680, 0.650,P=0.004, 0.006); VEGF had positive correlation with expression of PCNA (r=0.611,P=0.012). Conclusion The PI of CEUS is positive correlation with MVD and PCNA in nude mice models of gallbladder carcinoma transplant tumor, which may be helpful to evaluate tumor angiogenesis and cell proliferation state. The MVD, VEGF and PCNA positively correlates to each other, which indicates there is the relationship of reciprocal promotion between tumor angiogenesis and cell proliferation, and is good for tumor growth.

Gallbladder neoplasms; Ultrasonography; Contrast media; Microvessel density; Vascular endothelial growth factor; Proliferating cell nuclear antigen

山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014011037-4)、山西省人力資源和社會(huì)保障廳留學(xué)回國人員擇優(yōu)資助項(xiàng)目(晉人社廳2014-95)、山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院院級(jí)醫(yī)技基金項(xiàng)目(YJ1406)。

苗燕(1990—)，女，山西武鄉(xiāng)人，碩士，醫(yī)師。研究方向：膽囊癌的超聲診斷。E-mail: 287614535@qq.com

劉利平，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，030001。E-mail: liuliping1600@sina.com

2016-10-13

2017-04-16

R-332; R445.1

A

1003-3289(2017)06-0822-04

10.13929/j.1003-3289.201610049