宣吉晴，陳瑜莉，敖 夢,2*，王志剛,2，鄭元義,2,3，汪朝霞，李 奧

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲分子影像學重慶市重點醫(yī)學實驗室，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010；3.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院超聲科，上海 200233；4.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院超聲科，重慶 400016；5.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科；江蘇 南京 210029)

攜帶cRGD肽的靶向納米粒超聲造影劑的制備以及體外尋靶實驗研究

宣吉晴1，陳瑜莉1，敖 夢1,2*，王志剛1,2，鄭元義1,2,3，汪朝霞4，李 奧5

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲分子影像學重慶市重點醫(yī)學實驗室，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010；3.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院超聲科，上海 200233；4.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院超聲科，重慶 400016；5.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科；江蘇 南京 210029)

目的 制備攜帶精-甘-天冬氨酸(cRGD)肽的聚乳酸/羥基乙酸(PLGA)納米粒超聲造影劑，觀察其在體外對大鼠肝星狀細胞(HSC)的靶向能力。方法 以PLGA-COOH和全氟新溴烷(PFOB)為原料，采用雙步乳化法制備PLGA-PFOB納米粒，采用光學顯微鏡、掃描電鏡以及透射電鏡觀察其表面以及內部結構；采用馬爾文粒徑分析儀測量其粒徑大小、分布以及表面電位；通過碳二亞胺法連接cRGD肽制備靶向納米粒超聲造影劑(cRGD-NPs)，用激光共聚焦顯微鏡以及流式細胞儀檢測PLGA-PFOB納米粒造影劑與cRGD肽的連接情況；在大鼠HSC中驗證該造影劑的靶向性能。結果 所得樣品為乳白色混懸液，納米粒大小均勻，粒徑分布較窄，平均粒徑(255.3±66.8)nm，多分散指數(shù)為0.025，Zeta電位為(-16.4±5.1)mV；掃描電鏡示納米粒表面光滑規(guī)則、透射電鏡示PLGA外殼里包裹液氮氟碳PFOB；共聚焦顯微鏡觀察到連接FITC-cRGD顯示為綠色，與顯示紅色的納米粒共同融合成橙色，靶向納米粒超聲造影劑大量向大鼠HSC聚集并被其吞噬，紅色熒光強度明顯多于普通非靶向造影劑。結論 成功制備的攜帶cRGD肽的納米粒超聲造影劑，在體外實驗中對大鼠HSC有較強的特異性親和力。

靶向；納米粒；超聲檢查；造影劑

超聲靶向分子成像技術是一種將影像技術與分子生物學相結合的新技術，近年來納米靶向超聲造影劑的制備和應用備受關注。納米級超聲造影劑較常規(guī)微泡超聲造影劑粒徑更小，可穿過血管內皮細胞進入組織間隙，使血管外靶向組織顯像[1-2]。肝纖維化在全球范圍內有較高的發(fā)病率和死亡率[3]，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經階段。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)的活化和增生是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，在肝纖維化形成中起著關鍵作用。HSC活化后轉化為纖維母細胞樣，合成大量以Ⅰ型膠原蛋白為主的細胞外基質。而黏附分子家族中的整合素有可識別細胞外基質特性的氨基酸序列[精-甘-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，即RGD肽][4]，參與HSC活化的多個環(huán)節(jié)，參與細胞和細胞外基質、細胞和細胞間的黏附。本實驗旨在制備一種可攜帶含RGD序列的環(huán)八肽(cRGD)的納米級超聲造影劑，探討其體外結合大鼠HSC的特性。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 光學顯微鏡(IX71，Olympus，日本)；激光共聚焦顯微鏡(A1R，Nikon，日本)；馬爾文粒徑分析儀(Zeta SIZER 3000HS，英國)；流式細胞儀(FACS-calibur，美國)；聲振儀(Sonics & Materials，美國)；羧基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12000，聚合比50∶50)；全氟新溴烷(PFOB；TCI，日本)；FITC標記環(huán)八肽cRGD(序列為C*GRGDSPC*，中國強耀生物有限公司)；EDC/souf-NHS、熒光染料尼羅紅、DAPI(Sigma公司，美國)；MES緩沖液；Gibco EMDM高糖培養(yǎng)基；大鼠肝細胞細胞株(BRL-3A)和大鼠肝星狀細胞細胞株(HSC-T6；武漢普諾賽生命科技有限公司細胞庫)。

1.2PLGA-PFOB納米粒造影劑的制備 采用雙步乳化法，將100 mg PLGA-COOH和少量尼羅紅染料加入4 ml二氯甲烷中(分散相)置于50 ml離心管，常溫振蕩至完全溶解，加入60 μl PFOB，振蕩數(shù)秒，確保與二氯甲烷充分混勻。在冰浴條件下聲振儀聲振 3 min (130 W，聲振5 s、停止5 s)，加入10 ml 4% PVA溶液(連續(xù)相)在旋渦器中振蕩數(shù)秒后以同樣功率、頻率再次聲振3 min。將溶液移至放有磁珠的50 ml燒杯，加入2%異丙醇溶液20 ml，室溫下攪拌至少6 h，使二氯甲烷充分揮發(fā)，經去離子水多次離心、洗滌，獲得熒光標記的PLGA-COOH包裹PFOB的普通納米造影劑(NPs)，制備過程中全程避光。

1.3PLGA-PFOB納米粒造影劑的表征

1.3.1表面形態(tài)及內部結構 采用光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及電子掃描電鏡觀察PLGA-PFOB納米粒的大小、分散性；將稀釋后納米?；鞈乙褐糜诠杵稍镞^夜后，采用電子掃描電鏡觀察納米粒的外部形態(tài)；將樣品滴于銅網上，自然干燥成膜，以透射電鏡觀察PLGA-PFOB納米粒內部結構。

1.3.2粒徑大小、分布以及表面電位 采用馬爾文粒徑分析儀測量PLGA-PFOB納米粒粒徑大小、分布以及電位。

1.4 cRGD修飾的靶向納米粒造影劑的制備 將上述普通納米粒造影劑分散溶解于適量MES緩沖液(0.1 mol/L，pH值5.5)，以EDC與NHS質量比1∶3、PLGA與EDC摩爾比1∶10先后加入零長度偶聯(lián)活化劑EDC/NHS，冰浴振蕩孵育40 min后，多次洗滌、離心后復溶于MES緩沖液(0.1 mol/L，pH值8)；加入一定量cRGD肽(摩爾比cRGD∶PLGA=1∶1)，冰浴條件(4 ℃)振蕩孵育過夜；多次離心、洗滌、收集獲得靶向cRGD納米粒(cRGD-NPs)造影劑，溶于2 ml去離子水中，4 ℃保存。

1.5 cRGD與納米粒造影劑結合力的檢測 將不帶有熒光染料的空白NPs混懸液稀釋至半透明狀態(tài)，作為對照組，將制備好的靶向cRGD-NPs混懸液(使用FITC標記的cRGD，綠色熒光)作為實驗組，采用流式細胞儀測定FITC熒光強度后與對照組比較。制備靶向納米粒造影劑前加入尼羅紅染料于溶解的PLGA即獲得紅色熒光標記的NPs，采用激光共聚焦顯微鏡檢測紅色熒光染料標記的NPs與綠色熒光染料(FITC)標記的cRGD結合情況。

1.6 cRGD-NPs的毒性測試 用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BRL-3A細胞，長滿培養(yǎng)瓶后，加入0.25%胰酶，37℃消化，加培養(yǎng)液吹打，傳代，取對數(shù)生長期的細胞行CCK8試驗。將BRL-3A細胞懸液100 μl按接種密度約5.5×103/孔移入96孔培養(yǎng)板中培育24 h，倒掉培養(yǎng)基后每孔加入100 μl不同濃度的cRGD-NPs混懸液(納米粒濃度用無胎牛血清培養(yǎng)液稀釋為20、10、5、2.5、1.25 mg/ml)。24 h后再加入10 μl CCK8試劑孵育4 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)。細胞活力=[A(cRGD-NPs)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100%。

1.7 體外評估cRGD-NPs造影劑靶向特性 體外培養(yǎng)大鼠HSC，取對數(shù)生長期細胞，以1×105/孔的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h，分為靶向納米粒組和非靶向納米粒組。靶向納米粒組：每個培養(yǎng)皿加入1 ml經尼羅紅染色的靶向cRGD-NPs；非靶向納米粒組：每個培養(yǎng)皿加入1 ml經尼羅紅染色的非靶向NPs；將2組納米粒與細胞在37 ℃孵箱內孵育1 h后，用4%多聚甲醛1 ml固定15 min，PBS沖洗3次，加入DAPI染色劑對細胞核進行染色。 15 min后以PBS沖洗3次，于激光共聚焦顯微鏡下觀察2組納米粒與細胞的結合情況。

2 結果

2.1 PLGA-PFOB納米粒造影劑的表征結果

2.1.1 表面形態(tài)及內部結構結果 PLGA-PFOB納米粒造影劑外觀呈乳白色混懸液，穩(wěn)定性好，不分層，光學顯微鏡(圖1)以及激光共聚焦顯微鏡(圖2)示PLGA-PFOB納米粒大小均勻，形態(tài)規(guī)則，分散度好；掃描電鏡顯示PLGA-PFOB納米粒外觀呈球形，表面規(guī)則光滑(圖3)；透射電鏡顯示PLGA-PFOB納米粒由于PLGA殼與PFOB核不同的電子密度可呈現(xiàn)出殼和核的結構(圖4)。

圖1 光學顯微鏡下顯示納米粒大小均勻，形態(tài)規(guī)整(×600) 圖2 激光共聚焦顯微鏡下顯示納米粒形態(tài)規(guī)則、分散度好(×600) 圖3 掃描電鏡顯示納米粒外觀呈球形，表面規(guī)則光滑(×10 000) 圖4 透射電鏡顯示因液態(tài)氟碳PFOB位于納米粒中心呈現(xiàn)為灰白色，PLGA位于外殼位置呈現(xiàn)灰黑色(×30 000)

圖5 激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀檢測納米粒與cRGD肽的結合情況(×600) A.尼羅紅染色的靶向納米粒呈紅色熒光; B.與靶向納米粒連接的經FITC標記的cRGD肽呈綠色熒光; C.兩者在融合通道下呈橙黃色熒光; D.流式細胞儀顯示非靶向納米粒NPs的綠色熒光強度; E.流式細胞儀顯示靶向納米粒cRGD-NPs的綠色熒光強度

圖6 納米粒體外與大鼠肝星狀細胞結合情況熒光染色圖 A～C.靶向組cRGD-NPs; D～F.非靶向組NPs [A、D：DAPI染色細胞核(藍色熒光)；B、E.尼羅紅染色納米粒(紅色熒光)； C、F：融合圖像]

2.1.2粒徑大小、分布及表面電位 PLGA-PFOB納米粒粒徑大小為(255.3±66.8)nm，多分散指數(shù)為0.025，粒徑分布較窄；Zeta電位為(-16.4±5.1)mV。

2.2 cRGD與納米粒造影劑結合力的檢測結果 激光共聚焦顯微鏡顯示尼羅紅染色的靶向納米粒呈紅色熒光(圖5A)，F(xiàn)ITC標記的cRGD呈綠色熒光(圖5B)，兩者在融合通道下呈橙黃色熒光(圖5C)。流式細胞儀檢測不帶有熒光染料的非靶向納米粒NPs的綠色熒光(FITC)強度為1.26%(圖5D)，靶向納米粒cRGD-NPs的綠色熒光(FITC)強度為99.66%，即cRGD肽與納米粒的連接率達99.66%(圖5E)。

2.3 cRGD-NPs的毒性測試結果 CCK8試驗結果顯示大鼠正常肝細胞BRL-3A細胞株加入濃度分別為20、10、5、2.5、1.25 mg/ml的cRGD-NPs混懸液孵育后，細胞活力分別為 (86.6±8.5)%、(89.5±7.8)%、(91.5±7.0%)、(94.9±2.9)%、 (93.8±5.8)%，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.754 2，P>0.05)。

2.4 納米粒造影劑體外靶向性結果 納米粒經尼羅紅染色呈紅色熒光，大鼠肝星狀細胞細胞核經DAPI染色后呈現(xiàn)藍色熒光。靶向納米粒組(cRGD-NPs)顯示有大量紅色熒光，即被尼羅紅染色后納米粒被大鼠肝星狀細胞靶向結合和吞噬，不能穿過核膜位于細胞的細胞質內；非靶向納米粒組(NPs)僅見少量紅色熒光與細胞結合，熒光強度明顯低于靶向組(圖6)。

3 討論

黏附分子家族中的整合素參與HSC活化的多個環(huán)節(jié)，參與細胞和細胞外基質、細胞和細胞間的黏附。RGD序列是多種細胞外基質成分共有的高度保守的氨基酸序列，是整合素與細胞外基質配基或基膜成分配基相結合的識別位點。有研究者[5-7]采用放射性核素、熒光素、順磁顆粒等示蹤劑對RGD配基進行標記，并對整合素αvβ3受體表達追蹤。HSC表面可表達多種整合素受體[8]，既往研究[9-10]表明含有精-甘-天冬氨酸的cRGD通過受體介導的細胞內吞作用可被活化狀態(tài)的星狀細胞選擇性的攝取，因此筆者采用氨基酸序列Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys定制獲得cRGD，通過碳二亞胺法將cRGD側鏈的氨基與PLGA-COOH的羧基形成穩(wěn)定的肽鍵，從而將cRGD連接到NPs表面獲得cRGD-NPs，該連接方法較為穩(wěn)定，在體內外受環(huán)境影響較小[11]。本實驗運用激光共聚焦以及流式細胞儀證實了靶向造影劑通過碳二亞胺法成功與cRGD連接，且連接率較高, 達99.66%。

超聲分子成像技術是近年來超聲醫(yī)學研究的熱點，而分子探針是超聲分子影像學發(fā)展的基礎，微泡超聲造影劑作為超聲分子探針重要載體已在國內外研究[12-13]獲得成功。但微泡造影劑的直徑較大，難以穿過血管內皮間隙到達靶組織，只能實現(xiàn)血管內顯像。因此需制備一種高靶向性、粒徑較小的納米級超聲造影劑。液態(tài)氟碳是全氟碳化物的一種，具有高度穩(wěn)定性和良好的攜氧功能，循環(huán)半衰期長，有研究[14-15]成功制備了包裹液態(tài)氟碳的納米級高分子超聲造影劑不僅可用于超聲顯像，還可實現(xiàn)CT、MRI的顯像。本實驗選用的液態(tài)氟碳PFOB是一種具有穩(wěn)定性好、生物安全性高的液態(tài)氟碳[16]。本研究制備的PLGA-PFOB納米粒造影劑穩(wěn)定性高，在4 ℃條件存放1周以內均可保持很好的混懸狀態(tài)和分散性，粒徑變化不明顯；細胞毒性CCK8的實驗結果表明納米粒造影劑即使在較高濃度對大鼠正常肝細胞幾乎無毒性，細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(F=0.754 2，P>0.05)，生物安全性高。

在體外尋靶實驗中，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)靶向組有大量的靶向cRGD-NPs被HSC識別并攝取，即使經PBS反復沖洗，仍可緊密結合，紅色熒光強度明顯高于非靶向組，表明cRGD-NPs對HSC有很高的特異性結合能力。但因在制備納米粒造影劑過程中仍有少許染料不能被完全漂洗干凈，會被細胞少量吞噬，因而非靶向納米粒組也會呈現(xiàn)少許紅色熒光。

本實驗未對造影劑的體內外顯像進行分析，但本課題組前期[15,17]已經成功制備了具有超聲/CT雙模態(tài)顯像的PFOB微球，可使肝臟持續(xù)強化，增強肝臟腫瘤的顯像，且Pisani等[14]也通過體內外實驗證實PLGA-PFOB納米粒造影劑的超聲/MRI雙模態(tài)顯像能力。隨后筆者將進一步驗證cRGD-NPs的體內外顯像能力，嘗試為體內肝纖維化的分子顯像提供新的方法。

綜上所述，本實驗將高分子材料PLGA-COOH與液態(tài)氟碳PFOB通過雙步乳化法制成納米造影劑，再通過碳二亞胺化學連接法，將環(huán)八肽cRGD連至造影劑表面，獲得cRGD-NPs；該造影劑形態(tài)規(guī)則，呈球形，大小較均一；在體外尋靶實驗中，該靶向納米粒造影劑與HSC結合率高。

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Experimental study on preparation and targeting research in vitro of targeted nanoparticle ultrasound contrast agent carrying cRGD

XUANJiqing1,CHENYuli1,AOMeng1,2*,WANGZhigang1,2,ZHENGYuanyi1,2,3,WANGZhaoxia4,LIAo5

(1.ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundMolecularImaging,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400010,China; 2.DepartmentofUltrasound,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.DepartmentofUltrasound,ShanghaiJiaoTongUniversityAffiliatedShanghaiSixthPeople'sHospital,Shanghai200233,China; 4.DepartmentofUltrasound,theChildren'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;5.DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)

Objective To prepare a poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles ultrasound contrast agent carrying cRGD, and to investigate its targeting ability to the rat hepatic stellate cells (HSC) in vitro. Methods PLGA-PFOB nanoparticles were prepared by a double emulsion solvent evaporation process with a modified polymeric shell (PLGA-COOH) encapsulating perflurooctyl bromide (PFOB). The morphological and structural characteristics of the nanoparticles were observed by an optical microscope, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. The size, distribution and Zeta potential were observed using Malvern particle size analyzer. The cRGD was conjugated onto the nanoparticles by carbodiimide technique. The combination of cRGD with nanoparticles (cRGD-NPs) and the targeting function of cRGD-NPs in vitro were proved by laser scanning confocal microscopy (LSCM). Results The samples were milk white in deionized water, with a mean diameter of (255.3±66.8)nm and a polydispersity index of 0.025. Zeta potential was (-16.4±5.1)mV. Scanning electron microscopy images reveal that majority of capsules were spherical with smooth surface. Transmission electron microscope resented spherical particle with a core-shell structure. By observing LSCM, Nile red-dyed NPs emitted red fluorescence, FITC-labeled cRGD emitted green fluorescence, and overlay fluorescence image emitted bright homogeneous yellow fluorescence. It was found that greater and stronger red fluorescence representing cRGD-NPs could be observed in the cytoplasm of HSC while fewer NPs remained within HSCs in the non-targeted group. Conlusion The PLGA encapsulated PFOB nanoparticles carrying cRGD (cRGD-NPs) can be prepared successfully. The cRGD-NPs contrast agent has strongly specific affinity on the HSC.

Target; Nanoparticles; Ultrasonography; Contrast media

國家自然科學基金青年基金(81501482、81401427)、國家自然科學基金(81227801)、國家杰出青年科學基金(81425014)。

宣吉晴(1982—)，女，四川瀘州人，在讀博士，主治醫(yī)師。研究方向：超聲造影劑的基礎與臨床。E-mail: alice11@yeah.net

敖夢，重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲分子影像學重慶市重點醫(yī)學實驗室，400010；重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲科，400010。

E-mail: aomeng735@163.com

2017-02-15

2017-04-27

R445.1

A

1003-3289(2017)06-0810-06

10.13929/j.1003-3289.201702043