夏亞飛，閻 姝，楊 艷

金銀花配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

夏亞飛，閻 姝，楊 艷

目的：建立金銀花配方顆粒的高效液相色譜法（HPLC）及傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）的質(zhì)量控制方法，為金銀花配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。方法：利用HPLC對(duì)不同企業(yè)的金銀花配方顆粒中綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，采用FTIR對(duì)其配方顆粒進(jìn)行掃描，將所得圖譜與金銀花對(duì)照藥材及相關(guān)輔料進(jìn)行比較，研究其共有的吸收峰峰位和峰強(qiáng)度。結(jié)果：在（0.008～0.04）g/L，綠原酸的峰面積與濃度有良好的線性相關(guān)，r=0.9998，企業(yè)A、B、C、D、E、F的金銀花配方顆粒綠原酸的含量分別為4.00%、3.98%、2.81%、2.73%、2.62%、2.23%；6家不同企業(yè)的金銀花配方顆粒紅外光譜圖有一定差異，檢測(cè)出各企業(yè)使用了不同的輔料，主要為淀粉和蔗糖；金銀花配方顆粒的指標(biāo)峰為1692 cm-1、1606 cm-1、1522 cm-1、817 cm-1、602 cm-1。結(jié)論：不同企業(yè)的金銀花配方顆粒中，綠原酸的含量及指標(biāo)峰的峰高均存在差異。采用FTIR對(duì)金銀花配方顆粒中添加的輔料品種和比例進(jìn)行檢測(cè)，可以排除輔料對(duì)質(zhì)量控制方法的干擾。

金銀花配方顆粒；高效液相色譜法；傅里葉變換紅外光譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

金銀花配方顆粒以符合炮制規(guī)范的金銀花為原料，經(jīng)現(xiàn)代工業(yè)化提取、濃縮、噴霧干燥而制成的顆粒[1-2]。通過(guò)生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范認(rèn)證，成為國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的中藥配方顆粒試點(diǎn)的生產(chǎn)企業(yè)共6家，但不同企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒沒(méi)有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題[3]。故本文以綠原酸為指標(biāo)，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）和傅里葉變換紅外光譜法（fourier transform infrared spectrometer,FTIR），對(duì)6家企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒進(jìn)行分析，為保證金銀花配方顆粒臨床應(yīng)用的安全性、有效性提供客觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀（Waters 515，美國(guó)Waters公司），分析天平（BP211D，德國(guó)賽多利斯公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司），恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（KQ-700GDV，昆山市超聲儀器有限公司）。傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum GX，Perkin-Elmer公司），金銀花標(biāo)準(zhǔn)藥材（121060-201107），購(gòu)自天津市藥檢所。對(duì)照品綠原酸（110753-200413），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。金銀花配方顆粒分別購(gòu)自企業(yè)A，批號(hào)1306002H；企業(yè)B，批號(hào)1402053；企業(yè)C，批號(hào)404313L；企業(yè)D，批號(hào)13060126；企業(yè)E，批號(hào)15022091；企業(yè)F，批號(hào)A1301024。甲醇為色譜純（天津市西華特種試劑廠）；溴化鉀為光譜純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙腈為色譜純購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司；磷酸為分析純購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠；水為娃哈哈純凈水。

1.2 金銀花配方顆粒的含量測(cè)定 （1）液相色譜條件：色譜柱Inertex C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm天津開(kāi)發(fā)區(qū)色譜分析儀器有限公司)；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相乙腈(A)和0.4%磷酸水溶液(B)。流速1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。（2）對(duì)照品溶液制備：精密稱定綠原酸對(duì)照品，置棕色容量瓶?jī)?nèi)，加50%甲醇制成40 μg/mL的溶液，保存于10℃以下。（3）供試品溶液制備：精密稱定本品約0.2 g，研細(xì)，置50 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)，加入50%甲醇25 mL，稱定重量。功率240 W、頻率45 kHz條件下超聲處理30 min，放冷，再稱定重量。用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液2，4，6，8，10 mL置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，制成濃度分別為8，16，24，32，40 μg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液；精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀中，按（1）項(xiàng)下的HPLC條件測(cè)定峰面積，以綠原酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸計(jì)算得回歸方程和線性范圍。

1.3 應(yīng)用FTIR評(píng)價(jià)不同企業(yè)的金銀花顆粒劑的質(zhì)量 （1）金銀花飲片提取物的制備：煎煮開(kāi)始時(shí)用水量一般以浸過(guò)藥面2～5 cm，金銀花應(yīng)當(dāng)酌量加水。煎前應(yīng)先浸泡30 min，煮沸后繼續(xù)煎煮15～20 min。煎藥過(guò)程中需攪拌2～3次。每劑藥一般煎煮兩次，合并兩煎藥汁，濃縮得粉末。（2）供試品的制備：將顆粒劑樣品研磨為粉末，取2 mg粉末，加入約200 mg在120℃干燥4 h的KBr粉末，在研缽中研磨、混勻，轉(zhuǎn)移到模具中。在30 MPa左右的壓力，經(jīng)1～2 min將樣品壓成透明的薄片[4]。壓片的厚度約1～2 mm。（3）光譜測(cè)定：將上述樣品置于傅里葉變換紅外光譜儀（DTGS檢測(cè)器，光譜分辨率4 cm-1，掃描信號(hào)累加32次，掃描時(shí)即時(shí)去除水和CO2的干擾）中，測(cè)定光譜范圍在4000～400 cm-1之間的紅外光譜圖。應(yīng)用PerkinElmer公司的Spectrum One軟件進(jìn)行分析；采用Savitzky-Golay方法獲得二階導(dǎo)數(shù)譜,平滑點(diǎn)數(shù)為13點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 HPLC測(cè)定不同企業(yè)金銀花配方顆粒中綠原酸的含量 （1）系統(tǒng)適用性：在本實(shí)驗(yàn)條件下，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和不同企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒中所含的綠原酸峰形良好。見(jiàn)圖1。（2）線性關(guān)系：按“1.2”項(xiàng)下（4）中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算得綠原酸的回歸方程分別為：Y=15136X-74075，r= 0.9998，綠原酸在8～40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。（3）樣品含量測(cè)定：采用已建立的分析方法對(duì)6家企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒樣品進(jìn)行含量測(cè)定，取6家企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒按照“1.2”項(xiàng)下（3）所述的方法制備樣品提取液，分別進(jìn)樣20 μL，按照以上色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各個(gè)成分含量。根據(jù)不同企業(yè)的金銀花配方顆粒中綠原酸的峰面積，計(jì)算各企業(yè)樣品中綠原酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6家企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒中綠原酸的含量測(cè)定（mg/g）

2.2 利用FTIR對(duì)不同企業(yè)金銀花配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià) （1）金銀花原藥材與提取物的紅外光譜特征（見(jiàn)圖2）。共有峰的確定：對(duì)于一組吸收峰，若組內(nèi)吸收峰的最大波數(shù)差異顯著小于其與相鄰組之間的平均波數(shù)差，則確定該組峰是一組共有峰。由圖2可知，金銀花原藥材與綠原酸的共有峰為1634/ 1639 cm-1、1527/1527 cm-1、815/818 cm-1、610/613 cm-1，共四組；金銀花提取物與綠原酸的共有峰為1692/ 1687 cm-1，1606/1601 cm-1，1522/1517 cm-11，1273/ 1288 cm-1，817/818 cm-1，602/603 cm-1，共六組；金銀花提取物的共有峰的峰型、峰位與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖更接近，說(shuō)明金銀花提取物中綠原酸的含量增加。（2）特征峰的確定：①金銀花配方顆粒與金銀花原藥材、金銀花提取物的關(guān)系。制粒過(guò)程中加入藥用輔料，如淀粉、糊精、蔗糖等，均含C-O鍵，主要振動(dòng)吸收峰在1200～800 cm-1區(qū)域，對(duì)配方顆粒樣品的紅外譜圖分析造成干擾。故選擇1800～1200 cm-1區(qū)域進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析。結(jié)果見(jiàn)表2。在1800～1200 cm-1區(qū)域，不同企業(yè)的配方顆粒的紅外光譜圖與金銀花原藥材的相關(guān)系數(shù)在0.72～0.78；與金銀花提取物的相關(guān)系數(shù)在0.86～0.94；前者的相關(guān)系數(shù)值明顯低于后者，說(shuō)明不同企業(yè)金銀花配方顆粒的紅外光譜圖與金銀花提取物的譜圖更相近。②常用輔料對(duì)指標(biāo)峰的干擾。淀粉的特征峰為1154 cm-1、1079 cm-1、1018 cm-1、860 cm-1、766 cm-1等；蔗糖的特征峰在3600～2800 cm-1、1400～700 cm-1兩個(gè)區(qū)域；金銀花提取物的特征峰為1692 cm-1、1606 cm-1、1522 cm-1、1273 cm-1、817 cm-1、602 cm-1；淀粉與金銀花提取物的吸收峰無(wú)干擾，但蔗糖的1280 cm-1吸收峰，與金銀花的1273 cm-1存在干擾。綜上所述，金銀花樣品的特征峰波數(shù)確定為1692 cm-1、1606 cm-1、1522 cm-1、817 cm-1、602 cm-1。見(jiàn)圖3。③不同企業(yè)的金銀花配方顆粒的紅外圖譜的特征見(jiàn)圖4。6家企業(yè)在特征峰處的峰高，隨綠原酸含量增加而增加，說(shuō)明可以通過(guò)配方顆粒的多個(gè)特征峰的峰高，檢測(cè)配方顆粒的質(zhì)量。見(jiàn)表3。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和6家企業(yè)生產(chǎn)的金銀花配方顆粒的HPLC圖譜

圖2 金銀花原藥材、提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收譜圖

表2 不同企業(yè)配方顆粒的紅外光譜圖分別與金銀花原藥材、金銀花提取物的相關(guān)系數(shù)

圖3 蔗糖、淀粉、金銀花提取物的紅外光譜圖

圖4 不同企業(yè)的金銀花配方顆粒的紅外圖譜

表3 不同企業(yè)金銀花配方顆粒的相對(duì)峰高

3 討論

中藥配方顆粒遵循中醫(yī)基本理論的指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代制藥工藝，將符合炮制規(guī)范的單味中藥飲片經(jīng)過(guò)加工煎煮、過(guò)濾濃縮、噴霧干燥等程序，制備成供中醫(yī)臨床上可隨機(jī)組方、即沖即飲的顆粒劑型[4-5]。保留了原中藥飲片的藥性藥效，具有無(wú)需煎煮，易于調(diào)劑，便于攜帶、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、服用等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)大量的臨床觀察，其療效顯著，與傳統(tǒng)湯劑相比基本一致[6]。中藥配方顆粒的療效得到認(rèn)可，但是國(guó)內(nèi)6家生產(chǎn)企業(yè)的中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，市場(chǎng)流通產(chǎn)品規(guī)格不同、質(zhì)量差異較大。因此，建立統(tǒng)一的中藥配方顆粒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范至關(guān)重要。

HPLC法用于中藥的含量測(cè)定，由于它不受沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、相對(duì)分子質(zhì)量、有機(jī)物或無(wú)機(jī)物等的限制，故其適用范圍更廣泛。中藥配方顆粒經(jīng)提取，由于失去原有藥材的一些特征后，現(xiàn)行的原藥材顯微鑒別、理化鑒別和含量測(cè)定等方法，都不足對(duì)其進(jìn)行有效鑒別。因此，采用專屬性強(qiáng)的整體質(zhì)控評(píng)價(jià)方法，對(duì)中藥配方顆粒質(zhì)量進(jìn)行控制具有重要意義。本文采用HPLC法測(cè)定6家企業(yè)的金銀花配方顆粒中綠原酸的含量，不同企業(yè)的金銀花配方顆粒中綠原酸的含量差異較大，可能與提取的溶劑、提取的溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)等相關(guān)。

紅外光譜是由分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)引起偶極矩的凈變化產(chǎn)生，分子內(nèi)各原子的振動(dòng)、分子整體的平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)都有相應(yīng)的能級(jí)[7]。FTIR具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、分辨率高、無(wú)損、簡(jiǎn)便、真實(shí)宏觀等[8]優(yōu)點(diǎn)，在食品[9-10]、中藥[11-12]等質(zhì)量控制領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。紅外光譜法在中藥領(lǐng)域中的應(yīng)用包括藥材真?zhèn)渭耙谆焖幉牡蔫b別、不同產(chǎn)地的鑒別、不同炮制品的鑒別、野生與栽培的鑒別、對(duì)民族藥的鑒別以及同種藥材不同部位的鑒別[13-14]。本文將FTIR應(yīng)用于評(píng)價(jià)6家企業(yè)的金銀花配方顆粒的質(zhì)量，金銀花配方顆粒的指標(biāo)峰為1692 cm-1、1606 cm-1、1522 cm-1、817 cm-1、602 cm-1；6家企業(yè)生產(chǎn)的配方顆粒指標(biāo)峰的峰高存在差異，表明不同企業(yè)生產(chǎn)的配方顆粒所含的有效成份存在差異。淀粉的特征峰為1154 cm-1、1079 cm-1、1018 cm-1、860 cm-1、766 cm-1等；蔗糖的特征峰在3600～2800 cm-1、1400～700 cm-1兩個(gè)區(qū)域；金銀花提取物的特征峰為1692 cm-1、1606 cm-1、1522 cm-1、1273 cm-1、817cm-1、602 cm-1；淀粉與金銀花提取物的吸收峰無(wú)干擾，但蔗糖的1280 cm-1吸收峰，與金銀花的1273 cm-1存在干擾。因此，不同企業(yè)的金銀花配方顆粒所用輔料的不同對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立存在干擾。

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（收稿：2017-01-26 修回：2017-05-20）

（責(zé)任編輯 劉洪斌）

Study on Quality Standard of Honeysuckle Formula Granules

XIA Ya-fei，YAN Shu，YANG Yan.
De?partment of Pharmacology,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo establish a quality control method and provide a reference basis on the quality control of Honeysuckle Formula Granules through the means of High Performance Liquid Chromatography (HPLC)and Fourier Transform Infrared Spectrometer（FTIR）.MethodsHoneysuckle Formula Granules from different pharmaceutical companies were scanned by FTIR,and the contents of chlorogenic acid was determined by HPLC.Comparing the infrared spectrogram with the contrast medicinal materials and research the same peak position and peak intensity of absorption peak among them.ResultsIn the range of 0.008～0.04 g/L, the peak area and the concentration of chlorogenic acid had a good linear,r=0.9998.In Honeysuckle Formula Granules from 6 manufacturers namely A,B,C,D,E,F,the content of chlorogenic acid were 4.00%,3.98%, 2.81%,3.98%,2.62%and 2.23%,respectively.The IR spectra of Honeysuckle Granules of six different produc?ers were different,because of using different excipients,mainly starch and sucrose;the peak indicators of Honey?suckle Formula Granules is 1692 cm-1,1606 cm-1,1522 cm-1,817 cm-1and 602 cm-1.ConclusionThe con?tent of chlorogenic acid and the height of the peak exist differences in Honeysuckle Formula Granules from dif?ferent enterprises.Detecting the varieties and proportion of materials added in Honeysuckle Formula Granules by FTIR could eliminate the interference of auxiliary materials to the quality control method.

Honeysuckle formula granules;high performance liquid chromatography;fourier transform in?frared spectrometer;ouality standard

R285.6

A

1007-6948(2017)03-0287-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.03.017

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合基金資助項(xiàng)目（13038）

天津市南開(kāi)醫(yī)院藥學(xué)部（天津 300100）

閻姝，E-mail:13389989966@163.com