李文暢，張桂賢，劉大衛(wèi)，趙秀梅，張 一，劉洪斌

嘌呤能2X7受體-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3信號通路活化在慢性胰腺炎纖維化中的作用

李文暢1，張桂賢1，劉大衛(wèi)1，趙秀梅1，張 一2，劉洪斌1

目的：探討嘌呤能2X7受體（P2X7R）-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLRP3）炎性體信號通路在小鼠慢性胰腺炎模型胰腺纖維化進程中的作用。方法：通過反復(fù)腹腔注射雨蛙素造成小鼠慢性胰腺炎模型,分別用P2X7R拮抗劑氧化三磷酸腺苷（OxATP）和亮藍G（BBG）進行干預(yù)，處死后觀察胰腺組織病理學(xué)變化，并用Western Blot及RT-PCR法對P2X7R、NLRP3和半胱天冬酶1（caspase-1）的含量進行檢測，比較各組的變化。結(jié)果：正常對照組的P2X7R、NLRP3和caspase-1的蛋白表達水平分別為0.85±0.18,、0.93±0.16和1.02±0.06，模型組分別是1.55±0.22、2.00±0.35和2.23±0.56，二組比較，均有差異。OxATP組分別為1.02±0.26、1.01±0.09和0.95±0.04，BBG組分別為0.97±0.17、0.96±0.14和2.07±0.33，與模型組相比，無論是OxATP組還是BBG組，P2X7R、NLRP3和caspase-1在胰腺組織中的表達均顯著降低（P＜0.05）。病理結(jié)果顯示，模型組出現(xiàn)了明顯的胰腺纖維化，而OxATP組和BBG組的慢性胰腺炎和纖維化指標明顯改善。結(jié)論：OxATP和BBG能夠降低慢性胰腺炎模型的慢性炎癥和纖維化程度，其機制與抑制P2X7R-NLRP3-caspase1信號通路的活化有關(guān)。

慢性胰腺炎；胰腺纖維化；嘌呤能2X7受體；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎性體

胰腺纖維化是多種慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）的共同組織病理學(xué)特征，但其發(fā)病機制迄今為止還未明確[1]。多數(shù)研究者普遍認為，胰腺纖維化是由胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells, PSCs）激活引起的[2-3]。嘌呤能2X7受體（purinergic 2X receptor 7,P2X7R）作為一個關(guān)鍵調(diào)控元件，監(jiān)控細胞損傷導(dǎo)致的ATP等分子釋放激活胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 inflammasome,NLRP3）炎癥小體，在信號級聯(lián)反應(yīng)中受到了特別的重視[4-5]。然而，P2X7R在CP及其纖維化進程中發(fā)揮的作用尚未見報道。我們利用小鼠CP模型進行了一系列研究，探討了P2X7R拮抗劑對胰腺纖維化及其下游NLRP3炎性體活化的阻斷作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g（6周齡）。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。許可證號SCXK（京）2012-0001，批號11400700097218。實驗前進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，于動物中心屏障級動物室內(nèi)飼養(yǎng)（許可證號SYXK(津)2011-0003），每籠5只。飼喂普通大、小鼠生長維持顆粒飼料，飲水則給予純凈水。整個實驗過程中，動物自由攝食、飲水，12 h/d交替照明，室溫（23±2）℃，相對濕度（55±5）%。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 試驗樣品與試劑：雨蛙素、氧化三磷酸腺苷（oxidized ATP,OxATP）及亮藍G（brilliant blue G,BBG），均購自Sigma公司；天狼星紅及天青石藍液購自FLuka公司；所需抗體均購自Santa Cruz公司，主要包括羊多克隆抗體anti-p2x7r、兔多克隆anti-nlrp3、山羊多克隆抗半胱天冬酶1（caspase-1）。

儀器：DM4000B型研究級顯微鏡、RM2235/ 2245型切片機、ASP300全自動組織脫水機及DM750P型偏振光顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 方案 CP小鼠模型是由反復(fù)腹腔注射膽囊收縮素類似物雨蛙素誘發(fā)。40只小鼠，隨機分為4組（每組10只）。正常對照組在整個的8周研究期間里，處理方式為腹腔注射生理鹽水；1～6周時，CP模型組、OxATP組和BBG組按實驗方案注射雨蛙素（CP誘導(dǎo)劑），單次注射劑量為50 μg/kg，1次/h，6次/d，每周一、三、五注射，連續(xù)6周[6]；7～8周時CP模型組腹腔注射生理鹽水，OxATP組腹腔注射OxATP（200 μL, 30 μM），BBG組腹腔注射BBG（200 μL，1 μM）。實驗結(jié)束，頸椎脫臼處死所有動物，迅速剪取胰腺，一部分迅速至于液氮中冷凍，剩余胰腺組織10%甲醛固定、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色（HE染色）后進行組織學(xué)分級以及免疫組化染色。

1.4 胰腺纖維化的組織學(xué)檢查及定量分析 將福爾馬林固定過的胰腺組織進行石蠟包埋，4 μm切片。一部分組織切片按標準方法進行HE染色。CP損傷的嚴重程度，由病理醫(yī)師采用盲法，在未知分組的情況下，對胰腺器官標本的炎性細胞浸潤、腺泡萎縮及纖維化程度進行評分。評分分級方法：炎癥細胞浸潤（0，無；1，＜5%；2，＜10%；3，＜50%；4，≥50%），腺泡萎縮（0，無；1，較少；2，中度；3，較多或嚴重），纖維化（0，無；2，有限的區(qū)域內(nèi)；4，彌漫性）。對于所有的參數(shù)，隨機選取了每只鼠胰腺的任意三個部位作為標本，并隨機選取每個組織切片中10個不同的微視野進行了檢查。

另取部分組織切片用苦味酸-天狼星紅進行染色，以評估胰腺組織膠原含量。切片進行脫蠟處理后，用0.1%（W/V）天狼星紅飽和苦味酸溶液在室溫下染色1 h。而后用蒸餾水沖洗除去浮色、Mayer蘇木精復(fù)染和1%鹽酸分化，自來水堿化后脫水并封片?？辔端崽炖切羌t染色后的切片在偏振光顯微鏡100倍率下進行觀察，通過偏光顏色的差異對胰腺組織膠原纖維的病變程度進行分析。并通過α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）染色使用ABC試劑盒（Vector aboratories）檢測胰腺組織中PSCs的活化。

1.5 Western Blot法檢測胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase-1蛋白水平表達 將胰腺組織勻漿所提蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE進行電泳，并且轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗孵育（一抗稀釋度分別是P2X7R為1∶200、NLRP3為1∶500、Caspase1為1∶1000），4℃過夜；次日加入二抗孵育，二抗稀釋度均為1：10000，室溫孵育1.5 h；洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，結(jié)果用Quantity One分析P2X7R、NLRP3和Caspase1的灰度值，并以GAPDH作為內(nèi)參進行比較。

1.6 胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase1的RT-PCR反應(yīng) 以Trizol試劑(Invitrogen,USA)，從冷凍的胰腺組織中提取總RNA。通過測量260和280 nm處的吸光度來驗證核酸的數(shù)量和純度。用TaqMan?反轉(zhuǎn)錄試劑進行逆轉(zhuǎn)錄(Applied Biosystems,USA)。擴增在Icycler熱循環(huán)儀進行（Bio-Rad）。實時聚合酶鏈反應(yīng)法檢測mRNA的表達水平。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)所需的轉(zhuǎn)錄引物序列如表1所示。閾值循環(huán)數(shù)測定采用iCycler軟件1.0版本（Bio-Rad）。通過熔融曲線對擴增產(chǎn)物進行驗證。以GAPDH作為內(nèi)參基因用2-ΔΔCT方法對每個基因mRNA的相對豐度變化進行計算。

表1 實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)所需引物序列

1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以(±s)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05時，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺慢性炎性損傷病理組織學(xué)檢查 與正常對照組比，CP模型小鼠（8周）胰腺慢性炎癥損傷顯著，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)異常、腺泡萎縮、纖維化和炎性細胞浸潤（見表2及圖1A）（均P＜0.05）。經(jīng)OxATP或BBG治療后，胰腺慢性炎癥損傷均明顯減輕（表2及圖1）。

表2 小鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較(±s，n=10，分)

表2 小鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較(±s，n=10，分)

注：與正常對照組比較，aP＜0.01，與CP模型組比較，bP＜0.05

組別正常對照組CP模型組OxATP治療組BBG治療組炎細胞浸潤0 3.49±0.31a2.34±0.28a、b2.52±0.29a、b腺泡萎縮0 2.84±0.36a1.81±0.34a、b1.90±0.33a、b纖維化0 3.27±0.42a2.19±0.36a、b2.03±0.37a、b

圖1 P2X7R拮抗劑OxATP及BBG治療后胰腺損傷及纖維化程度評估

2.2 胰腺纖維化改變 與正常組比較，CP模型小鼠胰腺出現(xiàn)了顯著纖維化，且膠原纖維主要集中在胰腺的導(dǎo)管和血管的周圍，而在OxATP組和BBG組小鼠胰腺纖維化均明顯減輕（圖1）。

采用苦味酸天狼星紅染色法對胰腺中的膠原含量進行定量分析。在偏振光照射下，I型膠原蛋白顯示為黃紅色，Ⅲ型膠原顯示為綠色（圖1C）。用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件（Media Cybernetics， MD，USA）在同一個圖像中，通過量化不同的顏色、分布可以對兩種類型膠原蛋白的成熟度和膠原容積分數(shù)（CVFS）進行計算。CVFS是間質(zhì)膠原染色區(qū)除以整個組織的總和。計算公式：CVFS=(綠色膠原面積+黃紅色膠原面積)/總面積。選取三個不同的胰腺組織區(qū)域進行檢查，以減少抽樣誤差。定量分析結(jié)果表明，CP模型組膠原含量明顯增加，并且以I型膠原蛋白（黃紅色）為主，Ⅲ型膠原蛋白含量相對較少。在OxATP組和BBG組小鼠胰腺CVFS明顯減輕（圖1B、1C），也是以I型膠原蛋白（黃紅色）為主。

用α-SMA免疫組化染色對激活的PSCs進行定量分析，該細胞是目前認為在胰腺纖維化過程中起主導(dǎo)作用的細胞。在CP誘導(dǎo)下，PSCs明顯增多，而經(jīng)OxATP和BBG治療后，PSCs隨之減少（圖1D）。

2.3 胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase-1在蛋白表達水平比較 與對照組相比較，模型組動物P2X7R，NLRP3和Caspase-1三種蛋白的表達量均顯著增高。與模型組相比較，OxATP組和BBG組小鼠胰腺中三種蛋白表達量均明顯下降（見圖2及表3）。

圖2 P2X7R，NLRP3和Caspase-1蛋白在各組小鼠胰腺中的表達

表3 P2X7R、NLRP3和Caspase-1蛋白在各組小鼠胰腺中的表達(±s，n=10)

表3 P2X7R、NLRP3和Caspase-1蛋白在各組小鼠胰腺中的表達(±s，n=10)

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

正常對照組CP模型組OxATP治療組BBG治療組P2X7R/GAPDH 0.85±0.18 1.55±0.22a1.02±0.26b0.97±0.17bNLRP3/GAPDH 0.93±0.16 2.00±0.35a1.01±0.09b0.96±0.14bCaspase-1/GAPDH 1.02±0.06 2.23±0.56a0.95±0.04b2.07±0.33a、b

2.4 胰腺中P2X7R、NLRP3和caspase-1在基因水平表達 用RT-PCR法對正常對照組、模型組以及P2X7R拮抗劑治療組小鼠胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達進行檢測及分析。CP模型組在反復(fù)雨蛙素注射的誘導(dǎo)下，P2X7R、NLRP3和Caspase-1 mRNA的表達顯著增加。與CP模型組相比，OxATP和BBG治療組，P2X7R、NLRP3和Caspase-1 mRNA的表達均顯著降低（圖3）。

3 討論

胰腺纖維化是各種原因所致CP的共同特征，同時也是與其伴隨的組織病理學(xué)特點，表現(xiàn)為大量成纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)（extra-cellular matrix，ECM）在胰腺內(nèi)沉積[7-8]，導(dǎo)致胰腺實質(zhì)纖維化、胰腺組織喪失、腺泡細胞萎縮、胰管狹窄或擴張、胰管結(jié)石以及炎癥細胞浸潤等后果。NLRP3炎癥小體是目前研究得最多的一種炎癥小體，不僅能被許多細菌、病毒等病原體所激活，同時也能被體內(nèi)自身產(chǎn)生的“危險信號”激活。當細胞受到損傷而發(fā)生壞死時，細胞中的ATP等分子會釋放到胞外，ATP激活其細胞表面受體P2X7后，能夠打開其介導(dǎo)的離子通道，使鉀離子外流，并能夠通過胞外的Pannexin-1在細胞膜形成小孔，一些NLRP3的配體通過小孔進入細胞內(nèi)激活NLRP3炎癥小體[9-10]。P2X7R作為一種危險信號“傳感器”，充當了監(jiān)測ATP釋放的報警信號，在器官纖維化中發(fā)揮了重要作用，如肺纖維化，腎間質(zhì)纖維化和肝纖維化等[11-12]。

圖3 各組小鼠胰腺中P2X7R，NLRP3和Caspase-1 mRNA的相對表達量(±s，n=10)

CP是由于各種原因引起的以胰腺細胞破壞、進行性纖維化為主的病變。研究發(fā)現(xiàn)，不同病因所致的CP雖然起始步驟各異，但病理學(xué)改變相似，即持續(xù)進展的慢性炎癥最終導(dǎo)致胰腺腺泡和胰島細胞出現(xiàn)不可逆性損害，并逐漸被纖維組織所取代，致使胰腺內(nèi)、外分泌功能顯著障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。胰腺纖維化已被視為各種原因所致CP的共同病理學(xué)特征，是CP病程中的核心事件及防治的關(guān)鍵靶標。

最近，P2X7R-NLRP3炎性體信號通路作為參與組織或器官纖維化的一個關(guān)鍵調(diào)控元件而備受關(guān)注。本研究首先利用雨蛙素反復(fù)注射造成小鼠胰腺組織腺泡萎縮，組織中出現(xiàn)炎性細胞浸潤，膠原含量和PSCs細胞明顯增多，從而成功構(gòu)建了小鼠CP模型，對模型組胰腺中P2X7R，NLRP3和Caspase-1的基因和蛋白表達水平進行分析，三者的表達均較正常對照組小鼠有明顯增多。這與目前對P2X7R在肺纖維化中的基礎(chǔ)研究亦或臨床研究的報道相互印證，細胞外ATP可能作為一個危險信號，能夠通過激活肺泡巨噬細胞表面P2X7受體引起肺組織炎癥和纖維化[13-14]。

為進一步確定P2X7R、NLRP3和Caspase-1在CP過程中的作用，我們選用了兩種P2X7R拮抗劑—OxATP和BBG作為工具藥進行試驗。結(jié)果顯示，與CP模型組相比使用兩種工具藥阻斷P2X7R后，HE染色的纖維化評分、天狼猩紅染色和α-SMA免疫組化染色后組織病變程度均明顯改善，表明胰腺慢性炎癥和纖維化程度明顯減輕，且其纖維化改善與P2X7R、NLRP3和Caspase-1在組織中的表達呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。有研究人員用二氧化硅誘發(fā)小鼠肺纖維化模型后，將暴露于二氧化硅的P2X7受體進行基因敲除，其結(jié)果不僅減輕了肺部炎癥和纖維化，同時也降低了肺功能損害[15]。這種相關(guān)性在肝纖維化、腎纖維化和心肌纖維化中也有詳細的報道[16-18]。

綜上所述，我們推測此過程可能與CP模型產(chǎn)生損傷時腺泡細胞破壞，胞外ATP引起P2X7R活化，進而級聯(lián)激活NLRP3通路有關(guān)。NLRP3炎性體的活化又為后續(xù)caspase-1激活多種炎性細胞因子提供了基礎(chǔ)。這些證據(jù)為P2X7R及NLRP3炎性體的激活在CP纖維化進程中的重要性提出了新的見解。相信在不久的將來，阻斷P2X7R或許可以成為一種CP治療新的思路，在防止胰腺纖維化方面的發(fā)揮作用。

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（收稿：2016-08-16 修回：2017-03-08）

（責任編輯 王 豐）

Role of Purinergic 2X7 Receptor-Nucleotide-binding Oligomerization Domain Receptor 3 Signal Path?way Activation in the Fibrosis of Chronic Pancreatitis

LI Wen-chang，ZHANG Gui-xian，LIU Da-wei，et al.
Tianjin Institute of Medical and Pharmacological Sciences,Tianjin(300020),China

Objective To investigate the role of purinergic 2X7 receptor(P2X7R)-NLRP3 signaling path? way in the process of pancreatic fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis.MethodsChronic pancre?atitis model was induced by repeated intraperitoneal injections of caerulein.The P2X7R antagonists OxATP and (brilliant blue G,BBG)were given to respective groups.Then,all mice were sacrificed and the histopathological changes of the pancreas，especially the fibrotic degrees，were observed.Caspase-1,NLRP3 and P2X7R were de?tected by Western Blot and RT-PCR and compared among the groups.ResultsThe protein expression levels of P2X7R,NLRP3 and caspase1 in the normal control group were 0.85±0.18,0.93±0.16 and 1.02±0.06,while 1.55±0.22,2.00±0.35 and 2.23±0.56 in the model group.Significant differences were found in these parameters as compared to control values.The respective values for these parameters were 1.02±0.26,1.01±0.09 and 0.95± 0.04 in the OxATP group and 0.97±0.17,0.96±0.14 and 2.07±0.33 in the BBG group.In both OxATP and BBG group,the expression of P2X7R,NLRP3 and caspase1 in pancreatic tissue were significantly decreased,com?pared with the model group(P＜0.05).Pathological results showed that the pancreatic fibrosis was obvious in the model group,while the chronic inflammation and fibrosis indexes of the OxATP and the BBG groups were significantly improved.ConclusionP2X7R antagonists OxATP and BBG significantly decreased pancreatic chronic inflammation and fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis and the mechanism may be associat?ed with an inhibition of the P2X7R-NLRP3-Caspase1 signaling pathway.

Chronic pancreatitis;pancreatic fibrosis;purinergic 2X7 receptor;NLRP3 inflammasome

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2017)03-0278-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.03.015

天津市衛(wèi)生計生委科技基金項目（2014KY39）

1天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（天津 300020）

2天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津 300100）

張桂賢，E-mail:zhangguixian2007@aliyun.com