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        HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地龍血竭中3種黃酮類成分

        2017-06-28 16:23:32朱功俊劉向明李蕓芳楊光忠
        關(guān)鍵詞:劍葉血竭項(xiàng)下

        李 竣,朱功俊,陳 素,劉向明,李蕓芳,楊光忠

        (1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,武漢 430074;2 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,武漢 430074 )

        HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地龍血竭中3種黃酮類成分

        李 竣1,朱功俊1,陳 素2,劉向明2,李蕓芳1,楊光忠1

        (1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,武漢 430074;2 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,武漢 430074 )

        為建立HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地龍血竭中3種黃酮類成分的方法,選擇了廣西、云南產(chǎn)9個(gè)批次的龍血竭,測(cè)定了其中龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B的含量. 采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相乙腈-1%冰醋酸,梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1,柱溫40℃,檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm.3個(gè)藥效成分在45 min內(nèi)達(dá)到基線分離,線性關(guān)系良好.9個(gè)批次龍血竭中龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B的平均含量分別為:0.47%,0.96%,0.44%;平均加樣回收率分別為:99.6%,103.2%,100.5%;RSD分別為:1.20%,0.65%,1.30%.該實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,可為龍血竭的質(zhì)量控制提供參考.

        龍血竭;龍血素A;龍血素B;劍葉龍血素B ;HPLC法

        龍血竭是百合科龍血樹屬劍葉龍血樹Dracaenacochinchinensis(Lour.) S. C. Chen的含脂的木材經(jīng)提取得到的樹脂[1],主要產(chǎn)于東南亞和我國(guó)西南地區(qū)包括云南、廣西等地.其富含有查爾酮、黃酮、高異黃烷和二苯乙烯類等成分[2],具有活血化瘀、止血、止痛,生肌等功效,臨床上用于治療外傷出血、瘡瘍不斂、跌打損傷、淤滯作痛等癥[3].在對(duì)龍血竭研究的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)龍血素A,B和劍葉龍血素B的配伍組合是其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用藥效物質(zhì)[4].

        為了確定其3種藥效物質(zhì)在龍血竭中的比例關(guān)系,使用HPLC法測(cè)定其含量.目前,采用HPLC法對(duì)龍血竭進(jìn)行含量測(cè)定方法有單一化合物的含量測(cè)定[5,6],也有多個(gè)化合物的含量測(cè)定[7,8].本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定龍血竭中3種藥效成分龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的含量,對(duì)3個(gè)廠家和9個(gè)批次的龍血竭中3種藥效成分進(jìn)行了分析比較,為龍血竭質(zhì)量控制方法提供參考依據(jù).

        1 材料

        1.1 試藥

        龍血素A對(duì)照品(批號(hào)111660-200402)、龍血素B對(duì)照品(批號(hào)111558-201407)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院,劍葉龍血素B對(duì)照品(自制,純度≥98%).乙腈為色譜純(Tedia company),水為超純水,其他試劑均為分析純.

        9批龍血竭分別購(gòu)自于西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)120127、111015、150702、100420)、廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠(批號(hào)20131002、20131003、20140707)和云南普洱丹州制藥股份有限公司(批號(hào)20150303、20140801).

        1.2 儀器

        高效液相色譜儀(Ultimate 3000型, 美國(guó)戴安),粉碎機(jī)(YB-2000A型, 浙江永康市速峰工貿(mào)),電子天平(AUW120D型,島津),超聲波清洗器(KQ-500E型, 昆山市超聲儀器),分光光度計(jì)(UEC1312028型, 上海美譜達(dá)儀器).

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相乙腈(A)-1%冰醋酸水溶液(B),梯度洗脫,0~10 min,20%~35%A;10~35 min,35%~36%A;35~45 min,36%~37%A;流速1.0 mL·min-1;柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm.按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)與其他峰分離良好,分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均不低于1萬(wàn).依據(jù)對(duì)3個(gè)對(duì)照品,在供試品溶液的色譜圖中找到3個(gè)對(duì)照品相應(yīng)的色譜峰(見(jiàn)圖1).

        2.2 對(duì)照品溶液的制備

        分別精密稱取龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B對(duì)照品3.71,3.05,3.86 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,加適量無(wú)水乙醇超聲使其溶解,并定容至刻度線,搖勻,即得到混合對(duì)照品溶液.

        2.3 供試品溶液的制備

        取龍血竭粉末(過(guò)60目篩),約0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50 mL,密封,稱定質(zhì)量,室溫下超聲(250 W,40 kHz)提取30 min,取出放冷,再稱定質(zhì)量,用70%乙醇補(bǔ)足失重,搖勻,用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),即得龍血竭供試品溶液.

        1) 劍葉龍血素B;2) 龍血素A;3) 龍血素B圖1 龍血竭供試品(a)和對(duì)照品(b)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Resina Draconis and reference substances

        2.4 線性關(guān)系的考察

        精密量取2.2項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1,2,3,5,7,9,10 mL,分別置于10 mL棕色容量瓶中,用無(wú)水乙醇定容,搖勻,按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,記錄峰面積.以對(duì)照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo),色譜峰峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表1.

        表1 對(duì)照品的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

        2.5 精密度考察

        精密吸取2.3項(xiàng)下同一濃度的供試品溶液20 μL,按照2.1項(xiàng)下的色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B的色譜峰峰面積,計(jì)算其RSD分別為0.65%, 0.27%, 0.58%,表明儀器精密度良好,結(jié)果見(jiàn)表2.

        2.6 穩(wěn)定性考察

        取龍血竭供試品溶液,分別于0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 h進(jìn)樣20 μL,按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,并記錄峰面積.龍血竭供試品溶液中的龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B峰面積的RSD分別為0.62%, 0.37%, 1.85%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,結(jié)果見(jiàn)表3.

        表2 儀器精密度考察

        表3 供試品穩(wěn)定性考察

        2.7 重復(fù)性考察

        取同一批龍血竭樣品,按照2.3項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液,進(jìn)樣20 μL,按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的含量,RSD分別為1.84%, 1.61%, 1.65%,表明該方法重復(fù)性良好,見(jiàn)表4.

        表4 供試品重復(fù)性考察

        2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

        分別精密稱取已知含量的龍血竭樣品6份,每份約12.5 mg,精密稱定,置于具塞錐形瓶中.取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液15 mL于50 mL容量瓶中,并用無(wú)水乙醇定容至刻度線,取該溶液6份,每份5 mL,溶解上述6份龍血竭樣品.室溫下超聲30 min后,放冷,再稱定質(zhì)量,用無(wú)水乙醇補(bǔ)足失重,取該液體用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣量10 μL,記錄對(duì)應(yīng)各峰峰面積,計(jì)算3個(gè)藥效成分的回收率,結(jié)果見(jiàn)表5.

        表5 龍血竭中3個(gè)藥效成分的加樣回收率

        2.9 樣品含量測(cè)定

        取不同廠家和批次的龍血竭,按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,并按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,進(jìn)樣量20 μL、平行測(cè)3次,龍血竭中龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6.

        表6 不同廠家和批次龍血竭中3個(gè)藥效成分的測(cè)定

        3 討論

        本文建立了用HPLC法同時(shí)測(cè)定龍血竭中3種藥效成分的含量,該方法能使3個(gè)成分獲得基線分離(分離度大于1.5),具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn).實(shí)驗(yàn)使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別對(duì)3個(gè)對(duì)照品溶液在190~700 nm進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果顯示:龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的最大吸收波長(zhǎng)分別為278,278,287 nm;龍血素A、龍血素B最大吸收波長(zhǎng)一致,且劍葉龍血素B的最大吸收波長(zhǎng)和278 nm相近,選擇278 nm作為檢測(cè)器的波長(zhǎng).

        龍血素A、龍血素B具有較強(qiáng)的抗血栓、抗凝血等活血化瘀藥理作用[9,10],是龍血竭中重要的藥效組成成分.龍血素B有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng),且龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B有協(xié)同效應(yīng)[11,12].因此本實(shí)驗(yàn)選擇以龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B為考察指標(biāo).

        龍血素A、B和劍葉龍血素B的聯(lián)合使用與龍血竭有相同的藥效作用[13],明確這3種有效成分的含量對(duì)龍血竭質(zhì)量控制十分重要.文中HPLC法測(cè)定龍血竭中3種藥效成分,可為龍血竭的質(zhì)量控制提供參考,保證龍血竭的臨床治療效.不同廠家和批次的龍血竭中龍血素A、B和劍葉龍血素B含量存在差異,9批龍血竭藥材龍血素A、B和劍葉龍血素B的平均含量分別為0.47%,0.96%,0.44%,3種成分協(xié)同作用下治療疼痛的比例關(guān)系,為龍血竭在藥物的二次開發(fā)提供一定思路.

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        Simultaneous Determination of Three kinds of Flavonoids inResinaDraconisfrom Different regions by HPLC

        LiJun1,ZhuGongjun1,ChenSu2,LiuXiangming2,LiYunfang1,YangGuangzhong1

        (1 College of Pharmaceutical Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China;2 College of Biomedical Engineering, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China )

        To establish a method for the determination of loureirin A, loureirin B and cochinchinenin B inResinaDraconisfrom Guangxi and Yunnan Province in China, HPLC testing was performed on a Thermo BDS Hypersil C18column (4.6 mm×250 mm) with mobile phases of acetonitrile-1% acetic acid solution in a gradient mode, with a flow rate of 1.0 mL·min-1, column temperature of 40℃, and detection wavelength of 278 nm. The three components were baseline separated in 45 mins and showed good linear relationship. The average content of loureirin A, loureirin B and cochinchinenin B in the nine batches ofResinaDraconiswere 0.47%, 0.96%, 0.44%, and the average recover rates were 99.6% (RSD=1.20%), 103.2% (RSD=0.65%), 100.5% (RSD=1.30%), respectively. This method was convenient, accurate and reliable, which could provide reference for the quality control ofResinaDraconis.

        ResinaDraconis; loureirin A; loureirin B; cochinchinenin B; HPLC

        2016-11-02

        李 竣(1975-),男,副教授,博士,研究方向:天然藥物化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,E-mail:lijun-pharm@hotmail.com

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81403186),湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助項(xiàng)目(T201220),中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(3212015CZW15029, 3212015YCZW15095),中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放與技改資助項(xiàng)目(KF2016005, JG2016004)

        TQ460.7+2;R927.2

        A

        1672-4321(2017)02-0045-04

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