杜理華，沈 樂，蔣志鵬

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

一種脂肪酶催化合成蔗糖酯反應(yīng)的工藝優(yōu)化

杜理華，沈 樂，蔣志鵬

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

以脂肪酶TL IM(Thermomyceslanuginosus)為催化劑，以DMSO/叔戊醇為溶劑催化合成蔗糖與乙酸乙烯酯反應(yīng).實驗系統(tǒng)地研究了脂肪酶催化合成蔗糖酯的影響因素，對溶劑比、底物的摩爾比、反應(yīng)溫度和時間進行探討.研究結(jié)果表明：溶劑、底物摩爾比、溫度及反應(yīng)時間等方面對蔗糖酯化反應(yīng)有不同程度上的影響.

脂肪酶；蔗糖酯；酯化反應(yīng)；催化

表面活性劑，是指加入一定量就可以使溶液界面的狀態(tài)發(fā)生明顯變化，是能夠產(chǎn)生潤濕、乳化、起泡和增溶等作用的物質(zhì)[1].蔗糖脂肪酸酯簡稱蔗糖酯，以蔗糖作為親水基團，脂肪酸或脂肪醇作為親油基團，這些特殊的基團能使其在溶液的表面鋪張排列，因此蔗糖酯是一種天然的表面活性劑.除了能使溶液界面狀態(tài)發(fā)生明顯改變外，以糖酯作為表面活性劑還具有許多獨特的作用[2]：糖基具有許多個羥基的極性，具有較強的親水性；可降解有機物，使表面活性劑具有良好的生物降解性能；具有一定絡(luò)合金屬離子的作用，使得糖基非離子表面活性劑能夠抗硬水；使表面活性劑具有一定的抑菌作用等.當前以糖為親水基團開發(fā)的糖類表面活性劑已成為研究的熱點領(lǐng)域[3]，已廣泛應(yīng)用于石化能源、食品醫(yī)藥和化工材料等行業(yè)[4].研究發(fā)現(xiàn)：在藥物衍生物結(jié)構(gòu)修飾設(shè)計上加入糖基能改善藥物親疏平衡性，能加強藥物對生物膜的吸附作用，提高藥物生物利用度.為開發(fā)藥物的新療效和新型藥物的研究提供了思路與方法.

過去糖酯多采用化學(xué)法合成，在高溫高壓下對羥基修飾合成，條件苛刻，對設(shè)備反應(yīng)器要求比較高[5].自從Klibanov[6]開辟了非水酶學(xué)的研究領(lǐng)域以來,非水介質(zhì)中的酶促催化合成的方法已經(jīng)成為有機合成中一種非常重要的工具[7].酶催化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、無污染、反應(yīng)專一性和高效選擇性等優(yōu)點.使用酶催化合成蔗糖酯[8-9]能節(jié)約反應(yīng)原料，提高篩選效率，從而能夠節(jié)約成本，符合綠色化學(xué)思路[10].

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

蔗糖(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，月桂酸乙烯酯(AR，東京仁成工業(yè)株式會社)，棕櫚酸乙烯酯(AR，東京仁成工業(yè)株式會社)，乙酸乙烯酯(AR，江蘇永華精細化學(xué)品有限公司)，叔戊醇(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，DMSO(AR，無錫海碩生物有限公司)，甲醇(AR，衢州巨化試劑有限公司)，乙酸乙酯(AR，杭州雙林化工試劑廠)，Lipozyme TL IM(Novo Nordisk)，硅膠薄板(G60，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，柱層析硅膠(300～400目，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，玻璃點樣毛細管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，其他主要試劑都為分析純.

1.2 實驗器材

電子天平(BS224，賽多利斯科學(xué)儀器廠)，數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(SHA-C，金壇市江南儀器廠)，真空干燥箱(XMTD-8222，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，三用紫外分析儀(ZF-I，上海顧村電光儀器廠)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III-A，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司)，低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-200，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司)，磁力攪拌器(85-1，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000，上海亞榮生化儀器廠)，核磁共振儀NRM(AVANCE Ⅲ，瑞士Bruker公司，TMS內(nèi)標)，三用紫外分析儀(ZF-I，上海顧村電光儀器廠).

1.3 實驗方法

稱取0.034 g(0.1 mmol)蔗糖放入25 mL圓底燒瓶中，加入0.5 mL的DMSO，使其完全溶解后，加入0.5 mmol的乙烯酯類(月桂酸乙烯酯，乙酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯)和5 mL叔戊醇.混合均勻，加入0.2 g的TL IM酶.將該圓底燒瓶貼標簽后，放入50 ℃恒溫振蕩箱中以200 r/min的速度振蕩反應(yīng)24 h.用TLC跟蹤監(jiān)測反應(yīng)，展開劑比例為V(乙酸乙酯)︰V(甲醇)︰V(水)=25︰3.6︰1.

點板確定反應(yīng)完全后，過濾脂肪酶.用冰水和乙酸乙酯萃取，取上層有機相，減壓蒸餾.將反應(yīng)產(chǎn)物用柱層析分離提純，最后通過1H NMR表征分析.其反應(yīng)式為

式中：R1=CH3(CH2)10為月桂酸乙烯酯；R2=CH3(CH2)14為棕櫚酸乙烯酯；R3=CH3為乙酸乙烯酯.

通過上述實驗方法分別對反應(yīng)溶劑、反應(yīng)底物濃度、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間等條件進行探究，系統(tǒng)了解這些條件對酶促蔗糖酯化反應(yīng)產(chǎn)率的影響，對比總結(jié)得出最佳條件，從而得到最佳產(chǎn)率.

2 實驗結(jié)果及分析

以下實驗以蔗糖與月桂酸乙烯酯的反應(yīng)為模型，對反應(yīng)溶劑、底物濃度比、溫度以及酶的選擇等條件進行優(yōu)化.

2.1 溶劑對酶促蔗糖酯化反應(yīng)的影響

蔗糖為多羥基化合物，極性較強，只能溶于強極性有機溶劑中，但強極性溶劑會使酶部分或全部失活，從而降低酶的催化作用[11-12].因此，本實驗采用多相合成的方法.利用DMSO將蔗糖溶解后，加入叔戊醇與其構(gòu)成低共熔物，再進行酶促蔗糖酯化反應(yīng).實驗選取DMSO與叔戊醇的溶劑比為1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，探究酶促蔗糖酯化反應(yīng)的最佳溶劑比.

實驗結(jié)果如圖1所示，叔戊醇與DMSO的溶劑比對于酯交換產(chǎn)率的影響較小.結(jié)合DMSO極性較大且不易去除的因素，得出DMSO與叔戊醇的最佳比值為1∶9，產(chǎn)率為86%.

圖1 反應(yīng)溶劑比對蔗糖酯化反應(yīng)的影響Fig.1 The influence of solvent ratio of on the reaction

2.2 底物濃度比對酶促蔗糖酯化反應(yīng)的影響

兩種反應(yīng)物摩爾比不同可能會影響反應(yīng)體系的整體極性，影響反應(yīng)底物在酶催化活性中心附近的分布，從而影響反應(yīng)速率和產(chǎn)率.實驗選取蔗糖與月桂酸乙烯酯摩爾比為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，探究底物比對酶促蔗糖酯化反應(yīng)的影響.

實驗結(jié)果如圖2所示，隨著月桂酸乙烯酯用量的增加，反應(yīng)的產(chǎn)率也隨之增高.當?shù)孜锬柋葹?∶5時，反應(yīng)的產(chǎn)率為85%.繼續(xù)增加月桂酸乙烯酯的用量，產(chǎn)率降低.得出最佳底物濃度比為1∶5，產(chǎn)率為85%.

圖2 底物摩爾比對蔗糖酯化反應(yīng)的影響Fig.2 The influence of substrate ratio of on the reaction

2.3 溫度對酶促蔗糖酯化反應(yīng)的影響

在一定范圍內(nèi)，酶催化作用會隨溫度的升高而變強，而溫度過高會導(dǎo)致酶失活，從而影響酶催化作用.實驗選取35，40，45，50，55 ℃等5個溫度，探究該脂肪酶的最適宜溫度，使其對蔗糖酯化反應(yīng)的催化效率達到最高.

實驗結(jié)果如圖3所示，當反應(yīng)溫度達到50 ℃時，反應(yīng)的產(chǎn)率為86%，繼續(xù)升高溫度，產(chǎn)率明顯下降.得出最佳溫度為50 ℃，產(chǎn)率為86%.

圖3 反應(yīng)溫度對蔗糖酯化反應(yīng)的影響Fig.3 The influence of reaction temperature on the reaction

2.4 時間對酶促蔗糖酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時間過短，會導(dǎo)致反應(yīng)不充分，影響反應(yīng)產(chǎn)率；反應(yīng)時間過長，則增加了副反應(yīng)產(chǎn)生的可能性，也會導(dǎo)致產(chǎn)率降低.實驗選取反應(yīng)時間為2，4，6，8，10 h，探究酶促蔗糖酯化反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間.

實驗結(jié)果如圖4所示，當反應(yīng)時間達到8 h時，反應(yīng)的產(chǎn)率為92%，繼續(xù)反應(yīng)，產(chǎn)率下降.得出最佳時間為8 h，產(chǎn)率為92%.

圖4 反應(yīng)時間對蔗糖酯化反應(yīng)的影響Fig.4 The influence of reaction time on the reaction

2.5 不同酶對酶促蔗糖酯化反應(yīng)的影響

改變酶促蔗糖酯化反應(yīng)中的催化劑，分別改為脂肪酶Lipozyme RM IM、脂肪酶Novozym 435以及枯草桿菌堿性蛋白酶，結(jié)果如表5所示.

表5 酶對蔗糖酯化反應(yīng)的影響

實驗結(jié)果表明：對于蔗糖酯化反應(yīng)而言，不同的酶對反應(yīng)有著十分明顯的影響.利用脂肪酶Lipozyme RMIM催化反應(yīng)，蔗糖轉(zhuǎn)化率為38%.而利用枯草桿菌堿性蛋白酶催化該反應(yīng)，蔗糖轉(zhuǎn)化率僅為5%.從表5的結(jié)果看出：對于酶促蔗糖的區(qū)域選擇性酯化反應(yīng)而言，最有效的催化劑為脂肪酶Lipozyme TLIM，蔗糖的轉(zhuǎn)化率為80%，選擇性為98%.

3 蔗糖區(qū)域選擇性酯化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

本實驗探究了由脂肪酶催化的蔗糖與乙烯酯類化合物(乙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和棕櫚酸乙烯酯)的酯化反應(yīng).經(jīng)柱層析分離提純得到3個酯化產(chǎn)物，并且每個化合物都通過1H NMR表征數(shù)據(jù)分析及驗證.

3.1 蔗糖和月桂酸乙烯酯反應(yīng)

1H-NMR(DMSO-d6，δ，10-6):5.18～5.14(m，3H，蔗糖2β-OH，3α-OH和4β-OH)，5.03(d，1H，J=5.5 Hz，蔗糖 3'β-OH)，4.90(s，1H，蔗糖4'α-OH)，4.83～4.80(t，1H，J=6.5 Hz，蔗糖 5'β-OH)，4.58(d，1H，J=8.0 Hz，蔗糖1'β-OH)，4.41～4.39(t，1H，J=5.0 Hz，蔗糖Hα-6α)，4.24(d，1H，J=10.5 Hz，蔗糖 Hb-6α)，4.04～3.99(m，1H，蔗糖 H-5β)，3.92～3.86(m，2H，蔗糖 H-5'α和Hα-1'α)，3.73(d，1H，J=6.0 Hz，蔗糖 Hb-1'α)，3.60～3.47(m，4H，蔗糖H-3'α，H-4'β，Ha-6'β和Hb-6'β)，3.35(m，1H，蔗糖 H-3β)，3.22～3.19(m，1H，蔗糖 H-2β)，3.09～3.04(m，1H，蔗糖 H-4β)，2.31～2.29 (m，2H，a-CH2)，1.52～1.50(t，2H，J=7.0 Hz，β-CH2)，1.25 (m，16H，n-CH2)，0.86(t，3H，J=7.0 Hz，CH3).產(chǎn)率為78%.

蔗糖和月桂酸乙烯酯反應(yīng)式為

3.2 蔗糖和棕櫚酸乙烯酯反應(yīng)

蔗糖和棕櫚酸乙烯酯反應(yīng)式為

1H-NMR(DMSO-d6,δ,10-6)：5.18～5.14(m，3H，蔗糖 2β-OH，3α-OH和4β-OH)，5.03(d，1H，J=5.5 Hz，蔗糖 3'β-OH)，4.90(s，1H，蔗糖 4'α-OH)，4.83～4.80 (t，1H，J=6.5 Hz，蔗糖5'β-OH)，4.58 (d，1H，J=8.0 Hz，蔗糖 1'β-OH)，4.41～4.39 (t，1H，J=5.0 Hz，蔗糖 Hα-6α)，4.24 (d，1H，J=10.5 Hz，蔗糖 Hb-6α)，4.04～3.99 (m，1H，蔗糖 H-5β)，3.92～3.86 (m，2H，蔗糖的H-5'α和Hα-1'α)，3.73 (d，1H，J=6.0 Hz，蔗糖 Hb-1'α)，3.60～3.47 (m，4H，蔗糖 H-3'α，H-4'β，Ha-6'β和Hb-6'β)，3.35 (m，1H，蔗糖 H-3β)，3.22～3.19 (m，1H，蔗糖 H-2β)，3.09～3.04 (m，1H，蔗糖 H-4β)，2.27 (m，1H，a-CH2)，2.28～2.25 (m，2H，a-CH2)，1.52～1.50 (t，2H，J=7.0 Hz，β-CH2)，1.25 (m，24H,n-CH2)，0.86 (t，3H，J=7.0 Hz，CH3).產(chǎn)率為80%.

3.3 蔗糖和乙酸乙烯酯反應(yīng)

蔗糖和乙酸乙烯酯反應(yīng)式為

1H-NMR (DMSO-d6，δ，10-6)：5.18～5.14 (m，3H，蔗糖 2β-OH，3α-OH和4β-OH)，5.03 (d，1H，J=5.5 Hz，蔗糖 3'β-OH)，4.90 (s，1H，蔗糖 4'α-OH)，4.83～4.80 (t，1H，J=6.5 Hz，蔗糖5'β-OH)，4.58 (d，1H，J=8.0 Hz，蔗糖 1'β-OH)，4.41～4.39 (t，1H，J=5.0 Hz，蔗糖Hα-6α)，4.24 (d，1H，J=10.5 Hz，蔗糖 Hb-6α)，4.04～3.99 (m，1H，蔗糖 H-5β)，3.92～3.86 (m，2H，蔗糖H-5'α和Hα-1'α)，3.73 (d，1H，J=6.0 Hz，蔗糖 Hb-1'α)，3.60～3.47 (m，4H，蔗糖H-3'α，H-4'β，Ha-6'β和Hb-6'β)，3.35 (m，1H，蔗糖 H-3β)，3.22～3.19 (m，1H，蔗糖 H-2β)，3.09～3.04 (m，1H，蔗糖 H-4β)，2.00 (3H，s，CH3).產(chǎn)率為82%.

4 結(jié) 論

本實驗主要對固定化脂肪酶TL IM催化蔗糖與乙烯酯類化合物酯化反應(yīng)的最適條件進行了研究，即在DMSO/叔戊醇為1︰9的兩相非水介質(zhì)中，蔗糖與乙烯酯類化合物的底物比為1︰5，反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時間為8 h等條件時，反應(yīng)達到最高產(chǎn)率.也由此可知：固定化脂肪酶TL IM催化蔗糖與乙烯酯類反應(yīng)可行，也能得到較為理想的效果.

[1] KARLHEINZ H, OLIVER R. Sugar surfactants for consumer products and technical applications[J]. Fett lipid，1999，101(1):25-33.

[2] PUTERKA G J, FARONE W, PALMER T. Struc-functiona relationships affecting the insecticidal and miticidal activity of sugar ester[J]. Ecotoxicology，2003，96(3):636-644.

[3] UPPGARD L, STROM M, WOLD S. Multivariate quantiative structure activity relationships for the aquatic toxicity of alkyl polyglucosides[J]. Tenside surfactants detergents，2000，37(2):131-138.

[4] SHINODA K, CARLSSON A, LINDMAN B. On the importance of hydroxyl groups in the polar headgroup of nonionix surfactants and membrane lipids[J]. Advances in colloid and interface science，1996，64:253-271.

[5] FEUGE R O, ZERINGUE H J, WESSIN T, et al. Preparation of sucrose esters by interesterification[J]. American oil chemists society，1970，47(2):56-60.

[6] ZAKS A, KLIBANOV A M. Enzymatic catalysis in non-aqueous solvents[J]. Biological chemistry，1988，263(7):3194-3201.

[7] KRISHNA S H, KARANTH N G. Lipase and lipase-catalyzed esterification in nonaqueous media[J]. Catalysis reviews-science and engineering，2002，44(4):499-591.

[8] 寇秀芬，徐家立．酶法合成糖及糖醇酯[J].微生物學(xué)報，2000，40(2):193-197.

[9] 萬會達，夏詠梅.酶催化區(qū)域選擇性合成蔗糖酯的研究進展[J].日用化學(xué)工業(yè)，2010,40(1):48-53.

[10] 李美超，徐志花，馬淳安，等.有機合成中的綠色化學(xué)[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002,30(5):500-504.

[11] 王萍，杜理華，何秀娟，等.蔗糖棕櫚酸單酯的選擇性酶促合成及其性能研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,40(5):488-492.

[12] 錢俊青，宋大威，單昱東.微水相酸性蛋白酶催化蔗糖乙酸酯合成研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,41(2):119-121.

(責(zé)任編輯：陳石平)

A study on a lipase catalyzed synthesis of sucrose ester reaction

DU Lihua, SHEN Le, JIANG Zhipeng

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Experiment with lipase TL IM as catalyst, DMSO and tert-amyl alcohol as the reaction system catalytic synthesis of sucrose and vinyl acetate. The influencing factors of lipase catalyzed synthesis of sucrose esters were studied in the experiment.The molar ratios of solvents and substrates, reaction temperature and time were investigated.The results show that all the molar ratios of bothsolvents and substrates, temperature and reaction time have different degree of influenceon the sucrose esterification reaction.

lipase; sucrose ester; esterification reaction; catalyze

2016-09-14

國家自然科學(xué)基金資助項目(21306172)；國家948計劃資助項目(2014-4-29)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY17B020010)；浙江省公益農(nóng)業(yè)計劃項目(2014C32094)

杜理華(1979—)，女，河南安陽人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為藥物合成新技術(shù),E-mail:orgdlh@zjut.edu.cn.

R931.6

A

1006-4303(2017)03-0285-04