歐志敏，徐佳慧，王 瑩

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

響應(yīng)面法優(yōu)化羰基還原酶產(chǎn)生菌BacillusanthracisCGMCC No.12337的培養(yǎng)條件

歐志敏，徐佳慧，王 瑩

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

炭疽芽孢桿菌BacillusanthracisCGMCC No.12337作為生物催化劑可不對稱還原奧卡西平制備抗癲癇藥物醋酸艾司利卡西平的關(guān)鍵中間體S-利卡西平.采用響應(yīng)面優(yōu)化法對B.anthracisCGMCC No.12337發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 4.8，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度33 ℃，接種量10%，培養(yǎng)時間36 h.采用該優(yōu)化培養(yǎng)方法，該炭疽芽孢桿菌產(chǎn)生的羰基還原酶活力達到了775.62 U/L，較優(yōu)化前提高了35.12%.

炭疽芽孢桿菌；生物轉(zhuǎn)化；響應(yīng)面；培養(yǎng)條件

S-利卡西平是醋酸艾司利卡西平的關(guān)鍵手性中間體，同時也是奧卡西平的主要活性代謝產(chǎn)物[1-3].醋酸艾司利卡西平(S-(-)-10-乙酰氧基10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]氮雜-5-甲酰胺)作為鈉離子通道抑制劑可用來治療局限性及全身性的癲癇發(fā)作[4-5]，同時作為第二代抗癲癇藥物，醋酸艾司利卡西平與奧卡西平相比能較好地防止毒性環(huán)氧代謝物的形成，因此醋酸艾司利卡西平擁有更好的穩(wěn)定性和療效[6].

采用立體選擇性羰基還原酶產(chǎn)生菌炭疽芽孢桿菌BacillusanthracisCGMCC No.12337作為催化劑轉(zhuǎn)化奧卡西平制備S-利卡西平具有立體選擇性高、污染小和成本低等特點，符合環(huán)保，綠色的宗旨[7-8].為醋酸艾司利卡西平的合成提供了新的途徑[9-10].本研究采用響應(yīng)面分析方法對炭疽芽孢桿菌B.anthracisCGMCC No.12337的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化.在單因素實驗的基礎(chǔ)上選用PB實驗設(shè)計，以該菌株產(chǎn)生的羰基還原酶活力為響應(yīng)值，對各因素的影響效應(yīng)進行分析.采用最陡爬坡實驗確定最大響應(yīng)區(qū)域，采用響應(yīng)面分析法確定最佳培養(yǎng)基成分和最優(yōu)培養(yǎng)條件，優(yōu)化該炭疽芽孢桿菌的產(chǎn)酶條件，為菌體的擴大培養(yǎng)和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

炭疽芽孢桿菌B.anthracisCGMCC No.12337由本實驗室從浙江工業(yè)大學(xué)校園土壤中篩選得到，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸出粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，瓊脂20 g/L.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母浸出粉3 g/L，硫酸銨5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L.

液體發(fā)酵培養(yǎng)基: 葡萄糖30 g/L，酵母浸出粉10 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L.

1.3 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將接有B.anthracisCGMCC No.12337的斜面試管放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出豐滿的孢子.

種子培養(yǎng)：從斜面培養(yǎng)基中挑取一環(huán)接種到50 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h.

發(fā)酵培養(yǎng)：以10%的接種量將種子培養(yǎng)液接種到400 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h.

1.4 酶活力測定

取10 mL的發(fā)酵液于離心管中，8 000 r/min離心10 min，將離心所得菌體均勻分散在10 mL和pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入10 μmol 的奧卡西平，置于30 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中反應(yīng)1 h.反應(yīng)完成后將反應(yīng)液置于離心管中，8 000 r/min離心10 min，取上清液.

用高效液相色譜法檢測奧卡西平和S-利卡西平的含量，進一步計算B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力.以C-18(4 mm×250 mm×5 μm)作為色譜分析柱，檢測波長215 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，流動相為V(乙腈)∶V(0.1%乙醇水)=40∶60.

B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力定義為在一定條件下，1 min內(nèi)能將1 μmol的奧卡西平還原為S-利卡西平所需酶量為一個酶活力單位(U).

1.5 實驗設(shè)計

1.5.1 單因素實驗

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別用30 g/L蔗糖、淀粉、乙醇等代替葡萄糖，其他成分不變.以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，120 r/min的搖床中恒溫培養(yǎng)24 h，選擇最佳碳源.在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別用10 g/L蛋白胨、硫酸銨、尿素等代替酵母浸出粉，其他條件不變，以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，120 r/min的搖床中恒溫培養(yǎng)24 h，選擇最佳氮源.

1.5.2 Placket-Burman 實驗設(shè)計

Placket-Burman實驗是一種兩水平的實驗設(shè)計方法，以期在眾多的影響因素中找到少數(shù)幾個重要的影響因子[11].本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，初步確定葡萄糖質(zhì)量濃度(A)、蛋白胨質(zhì)量濃度(B)、初始pH(D)、轉(zhuǎn)速(E)、溫度(F)、接種量(H)、培養(yǎng)時間(J)和磷酸鹽質(zhì)量濃度(L)8個因素以及它們的取值范圍，利用Placket-Burman實驗設(shè)計，以期找到對酶活影響最大的3個因素.

1.5.3 最陡爬坡實驗

為確保響應(yīng)面擬合的準(zhǔn)確性，需要找到最佳區(qū)域值[12-13]，顯著因素根據(jù)一階模型的回歸系數(shù)的大小和符號確定爬坡梯度和方向[14].不顯著因素則依據(jù)正效應(yīng)因素取最高值，負(fù)效應(yīng)因素取最低值的原則設(shè)計最陡爬坡實驗.

1.5.4 Box-Benhnken實驗設(shè)計

根據(jù)單因素和Placket-Burman篩選的3個重要因素以及最陡爬坡實驗確定的中心范圍，采用Box-Benhnken實驗設(shè)計對B.anthracisCGMCC No.12337的產(chǎn)酶條件進行3因素3水平的響應(yīng)面分析，確定B.anthracisCGMCC No.12337的最佳產(chǎn)酶條件.

1.5.5 驗證實驗

響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方被用于配制炭疽芽孢桿菌B.anthracisCGMCC No.12337培養(yǎng)基并按優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行實驗.檢驗發(fā)酵液中該炭疽芽孢桿菌的酶活性，并與理論值相比較，驗證模型的有效性.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 碳源對B.anthracisCGMCC No.12337產(chǎn)羰基還原酶的影響

分別以30 g/L蔗糖、淀粉、乙醇、葡萄糖、β-環(huán)糊精為碳源，在其他培養(yǎng)基成分不變的情況下研究碳源的種類對B.anthracisCGMCC No.12337所產(chǎn)羰基還原酶活力的影響.實驗結(jié)果如圖1所示，當(dāng)采用葡萄糖為碳源時，羰基還原酶的活力最高，因此選擇葡萄糖為最佳碳源[15-16].

圖1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶活力影響Fig.1 Influence of different carbon sources on enzyme activity

2.1.2 氮源對B.anthracisCGMCC No.12337產(chǎn)羰基還原酶的影響

分別以10 g/L酵母浸出粉、牛肉膏、尿素、蛋白胨、硫酸銨為氮源，在其他培養(yǎng)基成分不變的情況下研究氮源的種類對B.anthracisCGMCC No.12337生產(chǎn)羰基還原酶酶活力的影響，實驗結(jié)果如圖2所示.當(dāng)采用蛋白胨為氮源時，羰基還原酶的活力最高，因此選擇蛋白胨為最佳氮源[17].

圖2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶活力影響Fig.2 Influence of different nitrogen sources on enzyme activity

2.2 Placket-Burman實驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用試驗次數(shù)N=12的實驗設(shè)計,對葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度、培養(yǎng)時間、接種量和磷酸鹽質(zhì)量濃度等8個因素進行考察，每個因素選取2個水平，實驗結(jié)果見表1.

運用DX8.0對表1中的實驗結(jié)果進行影響因子的顯著性分析，分析結(jié)果如表2所示.結(jié)果表明：對B.anthracisCGMCC No.12337生產(chǎn)羰基還原酶影響最大的三個因素分別為葡萄糖質(zhì)量濃度(A)，初始pH(D)和磷酸鹽質(zhì)量濃度(L)，得到一次線性回歸方程式.

表1 Placket-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

表2 各因素顯著性分析結(jié)果

以B.anthracisCGMCC No.12337所產(chǎn)羰基還原酶活力為響應(yīng)值的線性回歸方程為

酶活力=850.333+6.907A-65.042D-10.017L

(1)

其中：A為葡萄糖質(zhì)量濃度；D為初始pH；L為磷酸鹽質(zhì)量濃度.

由表3可看出：方差分析模型的Prob(P)>F的值小于0.000 1，表示該模型在回歸區(qū)域有較好的擬合性.PB實驗的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.926 5，表明實驗數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性較好；變化系數(shù)CV為9.57%，表明數(shù)據(jù)的可信度較高.校正決定系數(shù)R2=0.899，表示此回歸模型可用來解釋89.9%數(shù)據(jù)的變異性；精密度(Adeq precision)是有效信號和噪聲的比值，超過4.0即為合理，實驗精密度為16.762.

表3 回歸方程的方差分析

2.3 最陡爬坡實驗結(jié)果及分析

由Placket-Burman實驗結(jié)果可知，葡萄糖質(zhì)量濃度(A)，初始pH(D)，磷酸鹽質(zhì)量濃度(L)這三個因素對B.anthracisCGMCC No.12337生產(chǎn)羰基還原酶的影響顯著.其中初始pH和磷酸鹽質(zhì)量濃度存在負(fù)顯著效應(yīng)，該結(jié)果表明B.anthracisCGMCC No.12337是一種嗜酸性的菌株，酸性的培養(yǎng)基有利于其生長和繁殖.葡萄糖質(zhì)量濃度存在正顯著效應(yīng)，但需要考慮實際的生產(chǎn)成本.根據(jù)這3個因素的效應(yīng)值大小和符號來設(shè)計最陡爬坡實驗.實驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示，羰基還原酶活力在0+4x條件下達到最大值，之后開始降低，故最佳組合條件在0+4x附近，因此以0+4x的實驗條件可作為響應(yīng)面實驗的中心點.

表4 最陡爬坡實驗及結(jié)果

2.4 Box-Benhnken實驗結(jié)果

根據(jù)Placket-Burman實驗確定的影響B(tài).anthracisCGMCC No.12337發(fā)酵的3個重要因素以及最陡爬坡實驗確定的最優(yōu)水平，以B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力為響應(yīng)值進行3因素3水平的Box-Benhnken響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果見表5.

表5 Box-Benhnken實驗設(shè)計及結(jié)果

采用DX8.0軟件對響應(yīng)值以及各因素進行回歸擬合分析，得到回歸方程為

y=683.02+18.45A-57.36B-16.71C+51.22AB-18.22AC+6.01BC+42.60A2-29.90B2-4.58C2

(2)

其中：y為B.anthracisCGMCC No.12337的羰基還原酶活力；A，B，C分別為葡萄糖質(zhì)量濃度、初始pH和磷酸鹽質(zhì)量濃度.根據(jù)式(2)，得到最佳酶活力為776.98 U/L.

表6為響應(yīng)面方差分析，R2=0.973 2表示該模型擬合性較好，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系達到顯著.該方差分析結(jié)果還表明初始pH的一次項，葡萄糖質(zhì)量濃度的二次項均達到了極顯著水平(P<0.01).此外，葡萄糖質(zhì)量濃度和初始pH的交互作用也很顯著.

表6 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析1)

注：1)*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01.

根據(jù)響應(yīng)面分析和回歸方程利用DX8.0軟件繪制出響應(yīng)面分析圖，見圖3.

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度、初始pH和磷酸鹽質(zhì)量濃度對菌株酶活力影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface of interactive effects of glucose, initial pH and phosphate concentration

由響應(yīng)面圖3可知：葡萄糖質(zhì)量濃度，初始pH和磷酸鹽質(zhì)量濃度存在顯著相關(guān)性并且都存在極值.采用DX8.0軟件對B.anthracisCGMCC No.12337所產(chǎn)的羰基還原酶活力進行分析，當(dāng)酶活力達到最大值776.98 U/L時，葡萄糖質(zhì)量濃度為41.97 g/L，初始pH 4.83，磷酸鹽質(zhì)量濃度為0.5 g/L.

2.5 培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件的最優(yōu)組合

通過單因素實驗，Placket-Burman實驗設(shè)計，響應(yīng)面回歸分析和實際因素分析，確定最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 4.8，磷酸氫二鉀0.5 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L.最優(yōu)發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度33 ℃，接種量10%，培養(yǎng)時間36 h.

2.6 發(fā)酵條件驗證實驗結(jié)果

為了驗證回歸模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在此優(yōu)化條件下共進行3次發(fā)酵實驗，B.anthracisCGMCC No.12337發(fā)酵液的平均酶活力達到了775.62 U/L，與理論值相比，其相對誤差為1.75%，表明該模型能較好地模擬和預(yù)測實驗結(jié)果.因此，響應(yīng)面優(yōu)化得出的對B.anthracisCGMCC No.12337發(fā)酵培養(yǎng)條件的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，證實了模型的有效性[18].

3 結(jié) 論

利用單因素實驗和Placket-Burman實驗設(shè)計，得到葡萄糖質(zhì)量濃度，初始pH和磷酸鹽質(zhì)量濃度是影響B(tài).anthracisCGMCC No.12337發(fā)酵產(chǎn)酶的三個顯著因素.通過最陡爬坡實驗確定這3個因素的最優(yōu)值范圍.采用BBD設(shè)計和DX8.0軟件進行分析，得到B.anthracisCGMCC No.12337的最佳培養(yǎng)條件：葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH4.8，磷酸氫二鉀0.5 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L，轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度33 ℃，接種量10%，培養(yǎng)時間36 h.在此優(yōu)化條件下，B.anthracisCGMCC No.12337的羰基還原酶活性達到了775.62 U/L，較優(yōu)化前提高了35.12%.表明采用響應(yīng)面優(yōu)化法是尋找菌株最佳產(chǎn)酶條件的有效途徑.本研究的實驗結(jié)果為B.anthracisCGMCC No.12337不對稱還原奧卡西平制備S-利卡西平奠定了基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：劉 巖)

Optimization of fermentation condition for stereoselectivity carbonyl reductase producing strainBacillusanthracisCGMCC No.12337 by response surface methodology

OU Zhimin, XU Jiahui, WANG Yin

(College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

S-licarbazepine was synthesized by asymmetric reduction of oxcarbazepine withBacillusanthracisCGMCC No.12337 as catalyst. S-licarbazepine is the key intermediate of antiepileptic drug eslicarbazepine acetate. Response surface analysis method was used to optimize fermentation medium and conditions forB.anthracisCGMCC No.12337. The optimum fermentation conditions were finally conformed as: 42 g/L glucose, 20 g/L peptone, pH 4.8, K2HPO40.5 g/L, KH2PO40.5 g/L, 120 r/min, 33 ℃, 10% inoculation and 36 h. Under the optimum conditions, the maximum enzyme activity ofB.anthracisCGMCC No.12337 reached 775.62 U/L, with an increase of 35.12% compared to the original fermentation condition.

BacillusanthracisCGMCC No.12337; biotransformation; response surface; fermentation conditions

2016-10-25

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY15B060005)

歐志敏(1973—)，女，遼寧鐵嶺人，教授，博士，研究方向為生化制藥和酶工程，E-mail:oozzmm@zjut.edu.cn.

R971.6

A

1006-4303(2017)03-0279-06