陳影 謝榮理 王金龍 祁夢之 楊之濤 許志偉 費健 毛恩強 陳爾真

·論著·

水通道蛋白在大鼠急性壞死性胰腺炎結腸中的表達及意義

陳影 謝榮理 王金龍 祁夢之 楊之濤 許志偉 費健 毛恩強 陳爾真

目的 觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠結腸組織內水通道蛋白(AQP)表達的變化。方法 采用經胰膽管逆行注射?；悄懰徕c的方法建立ANP大鼠模型。制模后4、8、12、24 h處死大鼠，每個時間點6只，取結腸組織行病理學檢查，采用 RT-PCR 法檢測近端及遠端結腸組織IL-6、TNF-α mRNA和AQP(AQP-3、AQP-4、AQP-8)mRNA的表達；采用免疫組織化學染色方法檢測結腸組織中AQP的表達。結果 制模后SD大鼠結腸黏膜連續(xù)性被破壞，上皮細胞結構模糊，絨毛斷裂、脫落，黏膜下層炎性細胞浸潤，病理評分隨造模時間延長而升高。除造模后4 h遠端結腸組織的AQP-4 mRNA無顯著變化外，其他時間點ANP大鼠近端及遠端結腸組織的IL-6、TNF-α mRNA表達，AQP-3、AQP-4、AQP-8 mRNA及蛋白表達均較假手術組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。ANP大鼠近端結腸AQP-3、AQP-8的mRNA表達在造模后8 h時達峰值，AQP-4 mRNA表達在24 h達峰值；遠端結腸AQP-3、AQP-4 mRNA表達在8 h時達峰值，AQP-8 mRNA表達在24 h達峰值；近端及遠端結腸AQP-3、AQP-4、AQP-8蛋白表達在12、24 h時最強。結論 ANP大鼠近端及遠端結腸AQP-3、AQP-4、AQP-8 mRNA和蛋白表達均出現(xiàn)不同程度的上調，并隨著病程的進展逐步升高，提示其可能參與ANP時結腸的水代謝過程。

胰腺炎，急性壞死性； 水通道蛋白； 結腸； 膜蛋白類

Fund program：This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81600501, 81670581, 81671901, 81571931)

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一類位于細胞膜上的整合膜蛋白，屬于主要內源性蛋白(major intrinsic protein，MIP)家族。它在細胞膜上組成“孔道”，控制水在細胞內的進出，且不允許離子或其他小分子物質(包括蛋白質)通過[1-2]。AQP廣泛分布于人體各個臟器組織的細胞膜上，參與機體幾乎所有的生理與病理過程，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[2-3]。結腸最重要的生理功能之一是液體的吸收與分泌。近年來研究發(fā)現(xiàn)，結腸大量表達AQP[4-5]，AQP的異常表達可導致結腸對水的吸收與分泌紊亂[6-8]。重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病早期釋放大量炎癥因子，增加毛細血管通透性，導致大量體液滲漏，進而減少有效循環(huán)血量，從而影響結腸黏膜上皮的通透性及水代謝。本研究通過構建急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠模型，觀察ANP大鼠結腸中AQP的表達，探討其對ANP時結腸水代謝的影響。

材料與方法

一、實驗動物及分組

30只健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠購于上海斯萊克實驗動物公司，清潔級。于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院動物實驗中心適應性喂養(yǎng)2周后按數(shù)字表法隨機分為ANP組(24只)和假手術組(6只)。采用經胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉溶液(Sigma-Aldrich公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備ANP模型[9]，制模后4、8、12、24 h分批處死大鼠，每個時間點6只，取結腸組織。假手術組開腹后翻動胰腺和十二指腸組織后關腹，12 h后處死大鼠，取結腸組織。部分結腸組織置4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)制備石蠟切片；部分結腸組織即刻置液氮中凍存。

二、結腸組織病理學檢查

取4%多聚甲醛固定的結腸組織，經脫水、透明、透蠟、包埋、切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡(100×)下觀察組織的病理變化，并參考文獻[10]進行病理評分。

三、RT-PCR法檢測結腸組織AQP、IL-6、TNF-α mRNA的表達

取小塊液氮凍存的大鼠結腸組織，在研缽中加入液氮碾磨，加入500 μl Trizol(Invitrogen公司)反復抽吸混勻，裝入DEPC水處理過的1.5 ml離心管中。每管加入預冷的氯仿200 ml，顛倒混勻多次，室溫靜置5 min后于4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，加入等容積異丙醇混勻，室溫靜置5 min后于4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清。用1 ml預冷的75%乙醇洗滌沉淀后于4℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清，置室溫下待乙醇完全揮發(fā)后加入DEPC水，混勻后于65℃加熱5 min以充分溶解RNA。采用生物分光光度法分析RNA純度及濃度，置-80℃冰箱保存。采用RT-PCR方法檢測組織AQP、IL-6、TNF-α mRNA表達，以β-actin為內參。各引物序列見表1，由Invitrogen公司設計并合成。RT試劑盒及熒光定量PCR反應試劑盒均購自TaKaRa公司，嚴格按說明書操作。

表1 AQP、IL-6、TNF-α基因及內參β-actin的引物序列

四、免疫組織化學染色檢測結腸組織中AQP蛋白的表達

采用免疫組織化學試劑盒(Histostain-Plus IHC Kit, Life technologies公司)檢測，嚴格按照說明書操作。兔抗大鼠AQP-3、AQP-4抗體和山羊抗大鼠AQP-8抗體分別購自Abcam公司及Santa Cruz Biotechnology有限公司，工作濃度均為1∶500。以胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。每張切片在光鏡下觀察6個高倍鏡視野，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、大鼠結腸組織的病理變化

假手術組大鼠近端結腸黏膜上皮完整、無明顯水腫，上皮細胞排列整齊，黏膜下層見少量炎性細胞浸潤(圖1A)。ANP 4 h組大鼠結腸上皮病理表現(xiàn)與假手術組基本相似，黏膜上皮基本完整，無明顯水腫，上皮細胞偶見結構模糊；8、12 h起病變逐漸加重，上皮細胞排列紊亂，黏膜上皮不完整，絨毛萎縮、斷裂、脫落，黏膜下層大量炎性細胞浸潤(圖1B)；造模后24 h的結腸病理損傷最明顯。各組大鼠遠端結腸病變基本同近端結腸相似，略輕于近端結腸(1C、1D)。造模后8 h起黏膜連續(xù)性被破壞，上皮細胞結構模糊，絨毛斷裂、脫落，黏膜下層炎性細胞浸潤明顯，造模后24 h病變最嚴重。大鼠近端、遠端結腸病理評分隨造模時間延長而升高，以24 h的評分最高(表2)。

二、各組大鼠結腸組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平的變化

ANP大鼠近端及遠端結腸組織IL-6 mRNA表達顯著高于假手術組(P值均<0.05)。近端結腸IL-6 mRNA表達在24 h達到峰值，其中8、24 h的表達顯著高于4 h，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；遠端結腸在12 h達到峰值，其中8 h的表達顯著高于4 h，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表2 各組大鼠近端及遠端結腸組織的病理評分

注：與假手術組比較，aP<0.05;與ANP 4 h組比較，bP<0.05；與ANP 8 h組比較，cP<0.05

圖1 假手術組、ANP 12 h組大鼠近端((1A、1B)及遠端結腸組織(1C、1D)的病理變化(HE ×100)

ANP大鼠近端及遠端結腸組織TNF-α mRNA表達顯著高于假手術組(P值均<0.05)。近端結腸TNF-α mRNA表達在24 h達到峰值，但各時間點的差異無統(tǒng)計學意義；遠端結腸TNF-α mRNA表達在12 h達到峰值，隨后降低，其中12 h的表達顯著高于4 h及24 h，8 h的表達顯著高于24 h，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表4)。

三、各組大鼠結腸組織AQP mRNA表達水平的變化

ANP大鼠近端結腸AQP-3、AQP-8 mRNA表達顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。AQP-3、AQP-8 mRNA表達在8 h時達峰值，12、24 h時的表達較8 h時顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，但12 h與24 h間的差異無統(tǒng)計學意義。近端結腸AQP-4 mRNA表達顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，24 h達峰值，但各時間點的差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

ANP大鼠遠端結腸AQP-3、AQP-8 mRNA表達顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。AQP-3 mRNA表達在8 h時達峰值，以后開始下降，但各時間點的差異無統(tǒng)計學意義；AQP-8 mRNA表達于24 h達峰值，顯著高于其他時間點的水平，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。AQP-4 mRNA表達在4 h點略低于假手術組，差異無統(tǒng)計學意義；8 h 時升高達峰值，顯著高于假手術組及ANP12、24 h組，而12、24 h的表達仍顯著高于假手術組和4 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表4)。

表3 各組大鼠結腸組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平的變化

注：與假手術組比較，aP<0.05;與ANP 4 h組比較，bP<0.05；與ANP 24 h組比較，cP<0.05

表4 各組大鼠結腸組織AQP mRNA表達水平的變化

注：與假手術組比較，aP<0.05;與ANP 4 h組比較，bP<0.05；與ANP 8 h組比較，cP<0.05；與ANP 12 h組比較，dP<0.05

四、各組大鼠結腸組織AQP蛋白表達水平的變化

AQP蛋白主要表達于結腸上皮細胞胞質，表現(xiàn)為出現(xiàn)棕黃色顆粒。假手術組大鼠近端及遠端結腸均可見AQP-3表達；ANP組4、8 h時表達略增加，12、24 h時表達進一步增加(圖2)。

假手術組大鼠近端結腸上皮細胞僅少量AQP-4表達；ANP組4、8 h時表達無顯著增加，12、24 h表達顯著增加；遠端結腸上皮細胞AQP-4表達均高于近端結腸，變化趨勢同近端結腸(圖3)。

假手術組大鼠近端及遠端結腸均表達大量 AQP-8，ANP組4、8 h時的表達無明顯變化，12、24 h的表達較假手術組增加(圖4)。

討 論

SAP是一種嚴重的全身性疾病，涉及多器官功能損害。SAP早期，一方面由于大量炎癥遞質的釋放及血容量不足引起腸道缺血缺氧損傷，另一方面由于胰腺的特殊解剖位置，胰周的空腸、回腸及橫結腸等為首要受累臟器，發(fā)生急性胃腸功能損傷(acute gastrointestinal injury，AGI)[11-12]。本研究結果顯示，ANP大鼠的近端、遠端結腸由于組織缺血缺氧、炎癥打擊，出現(xiàn)黏膜、絨毛的斷裂、脫落，且結腸上皮細胞IL-6、TNF-α mRNA表達顯著增加。結腸平均每日吸收1.3～2 L水[4-5,13]，結腸內的水分實際上是逆滲透壓梯度從管腔進入血管從而完成吸收這一生理功能的，但其具體機制并不十分明確。以往的研究表明，結腸內水分的吸收屬于被動轉運，各種溶質(特別是NaCl)主動吸收所產生的滲透壓梯度促使水分吸收進入腸上皮細胞[14]。但隨著生物化學技術的發(fā)展進步，越來越多的證據(jù)表明結腸水分的轉運不僅僅依賴Na+等溶質的易化擴散方式，還可能存在細胞旁路、載體系統(tǒng)、通道等其他主動轉運機制[14-16]，它們可能在機體炎癥、缺血缺氧等病理狀態(tài)下對結腸水代謝起不可或缺的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)消化道有大量AQP表達[4-5,17]，提示經細胞途徑的水分吸收機制除了簡單擴散外還存在特殊的跨膜轉運蛋白的快速水轉運機制[4,18]。

圖2 假手術組、ANP12 h組大鼠近端(2A、2B)及遠端結腸組織(2C、2D)的AQP-3蛋白表達(免疫組化 ×100)

圖3 假手術組、ANP12 h組大鼠近端(3A、3B)及遠端結腸(3C、3D)的AQP-4蛋白表達(免疫組化 ×100)

圖4 假手術組、ANP12 h組大鼠近端(4A、4B)及遠端結腸(4C、4D)的AQP-8蛋白表達(免疫組化 ×100)

Silberstein等[19]最初發(fā)現(xiàn)，AQP-3局限在結腸絨毛上皮細胞表達，并優(yōu)勢表達于結腸絨毛上皮細胞的頂膜，提示AQP-3與人類結腸上皮細胞對水分的吸收有一定的相關性。Ikarashi等[20]發(fā)現(xiàn)抑制結腸AQP-3功能可引起糞便含水量增加而導致腹瀉。此外，有研究顯示，腹瀉型腸易激綜合征患者AQP-8表達下降，導致結腸吸收功能障礙，可能與大便稀溏、腹瀉等有關[21]。AQP-4主要表達于人的升結腸，有學者應用AQP-4基因敲除小鼠進行研究，結果發(fā)現(xiàn)小鼠結腸對水的通透性與AQP-4在結腸的表達與否及表達量的多少呈正相關。本研究結果顯示，正常SD大鼠的結腸，無論近端或是遠端，均有AQP-3、AQP-8表達，而AQP-4在近端結腸僅有少量表達。ANP大鼠近端及遠端結腸AQP-3、AQP-4、AQP-8 mRNA和蛋白表達均出現(xiàn)不同程度的上調，并隨著病程的進展逐步升高，提示AQP可能參與了ANP早期結腸的水吸收與分泌等轉運機制。

本課題組在臨床治療SAP患者時觀察到灌入患者直腸內的生理鹽水均被吸收，每小時吸收的生理鹽水可高達500 ml，而心率、血壓等指標均有改善，患者每小時尿量亦可達到25～150 ml，且未見患者發(fā)生腹腔壓力升高以及嚴重的組織水腫。對ANP大鼠經直腸持續(xù)勻速輸入生理鹽水8 h，大鼠的平均動脈壓逐漸升高，并可回復到對照組大鼠的水平[22]。因此筆者認為，在SAP早期由于有效循環(huán)血量不足使機體處于“缺水”狀態(tài)，除通過各種神經-內分泌調節(jié)來減少水分丟失外，亦通過一切可能途徑吸收水分。經結腸吸收水分可有效地補充血容量，改善血流動力學紊亂，是機體的一種主動調節(jié)的自我保護機制。ANP大鼠結腸上皮細胞AQP-3、AQP-4、AQP-8表達上調可能是結腸主動增加水吸收的重要機制之一。

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(本文編輯：呂芳萍)

Expression and role of aquaporin in the colon of acute necrotizing pancreatitis rats

ChenYing,XieRongli,WangJinlong,QiMengzhi,YangZhitao,XuZhiwei,FeiJian,MaoEnqiang,ChenErzhen.

DepartmentofEmergency,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

XuZhiwei,Email:xzw10800@163.com

Objective To investigate the expression variation of aquaporin in colon tissues in acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods ANP rat model was induced by the retrograde injection of sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The rats were killed at 4 h, 8 h, 12 h and 24 h after modeling with 6 rats for each time point. The pancreas and colon tissues were harvested for pathological examination. The levels of IL-6, TNF-α mRNA expression and AQR (aquaporin-3, aquaporin-4, aquaporin-8) mRNA expression in proximal and distant colon were detected by RT-PCR. The levels of aquaporin protein in colon were examined by immunohistochemistry. Results After the establishment of ANP SD rat model, the integrity of colonic mucosa was continuously damaged, the structure of epithelial cells was unclear and the colonic villus were broken and destroyed, and inflammatory cell infiltration in submucosa was observed. The pathological score increased with the time of modeling. In 4 h, except that the mRNA levels of AQP-4 in distal colon was not obviously changed, mRNA levels of IL-6 and TNF-α, mRNA and protein expression of AQP-3 and AQP-8 in the proximal and distal colon of ANP rats were significantly elevated compared with shame group (P<0.05). AQP-3 and AQP-8 mRNA in proximal colon of ANP rats reached its peak in 8 h after the establishment and AQP-4 mRNA peaked at 24 h. AQP-3 and AQP-4 mRNA in distant colon of ANP rats reached its peak in 8 h after the establishment and AQP-8 mRNA peaked at 24 h. Protein expression of AQP-3, AQP-4 and AQP-8 in proximal and distant colon was strongest in 12 h and 24 h after the establishment. Conclusions With the progression of the ANP, the expression levels of AQP-3, AQP-4 and AQP-8 in both proximal and distal colons were elevated in various degrees, indicating that the aquaporins may participate in water metabolism of colon during ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Aquaporin; Colon; Membrane proteins

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.03.005

200025 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院急診科(陳影、王金龍、祁夢之、楊之濤、毛恩強、陳爾真)，普通外科(謝榮理、許志偉、費健)

并列第一作者：謝榮理

許志偉，Email: xzw10800@163.com

國家自然科學基金(81600501、81670581、81671901、81571931)

2016-11-21)