蘇子毅，班潔靜

(1.湖北省水果湖高級中學(xué)，湖北 武漢 430071；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070)

十字花科蔬菜根腫病菌侵染寄主組織學(xué)觀察

蘇子毅1，班潔靜2

(1.湖北省水果湖高級中學(xué)，湖北 武漢 430071；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070)

十字花科蔬菜根腫病是影響該類蔬菜的重要病害，有效地防治十字花科蔬菜根腫病是對該類蔬菜生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的意義。通過該病害在湖北田間發(fā)病情況的調(diào)查，在實驗室對該病害發(fā)病過程情況的觀察、了解、分析，從而為該類蔬菜抗病品種的鑒定及該類蔬菜病害防治化學(xué)藥劑的篩選提供科學(xué)根據(jù)。

蔬菜；十字花科；根腫病

由蕓薹根腫菌(plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的十字花科蔬菜根腫病是影響蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害，生產(chǎn)上一旦發(fā)病就難以有效防治。結(jié)合該病在湖北省發(fā)生的危害，在田間調(diào)查的基礎(chǔ)上，通過室內(nèi)人工接種，顯微鏡下觀察了病菌侵染過程及組織學(xué)變化，以期為病害的早期防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及來源

供試菌株為蕓薹根腫菌4號小種，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理室提供。

1.1.2 蔬菜品種

供試品種為新選早熟5號小白菜。

1.2 試驗方法

1.2.1 感病寄生癥狀觀察

在根腫病大田發(fā)病期間，通過對長陽縣火燒坪十字花科蔬菜根腫病田間發(fā)生危害情況的調(diào)查，結(jié)合室內(nèi)盆栽試驗，進一步觀察了本病的主要癥狀特點。

1.2.2 根腫菌休眠孢子的提取

根腫組織用自來水洗干凈，7%乙醇表面消毒 30s，加入無菌水充分研磨，經(jīng)8層紗布過濾，裝入50mL離心管中，500rpm離心15min，棄上清，轉(zhuǎn)入新離心管中，400rpm離心10min，加15mL 50%蔗糖溶液混勻，2500rpm離心10min，棄上清，移入新離心管中，加滅菌水至35mL，4000rpm離心10min，沉淀溶于30mL滅菌水，4000rpm離心10min，重復(fù)兩次。沉淀重新溶于50mL無菌水中，獲得休眠孢子懸浮液。

1.2.3 供試品種幼苗培養(yǎng)及接種

幼苗培養(yǎng)：采用沙-營養(yǎng)液培養(yǎng)供試品種新選早熟5號小白菜幼苗。普通沙粒經(jīng)過過濾篩過濾，過濾后的沙粒大小為30～50mm，分別裝入50mL有機玻璃離心管中，然后加入改良的hoagland營養(yǎng)液40mL(表1)，調(diào)節(jié)pH為5.0 .

表1 營養(yǎng)液配方

幼苗接種：預(yù)先提取的根腫菌休眠孢子懸浮液，基質(zhì)為經(jīng)過篩的沙粒，將改良后的營養(yǎng)液裝入50mL有機管內(nèi)，然后將培養(yǎng)的發(fā)芽幼苗植入填充沙粒5mL吸頭中，在幼苗周邊接種休眠孢子懸浮液，最后置于離心濾架內(nèi)種植(圖1)。以未接種的幼苗為對照。

圖1 供試品種幼苗培養(yǎng)情況

1.2.4 根腫菌休眠孢子萌發(fā)觀察

制備的根腫菌孢子懸浮液，接種前用地衣紅染色，觀察休眠孢子萌發(fā)情況。將冰醋酸45mL裝入錐形瓶中加熱煮沸，然后加地衣紅1g，冷卻后加蒸餾水55mL振蕩，過濾備用。染色后的休眠孢子在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)動態(tài)，供接種用。

1.2.5 根腫菌侵染組織的石蠟切片

發(fā)病根組織與健康對應(yīng)組織按下列程序進行切片。

1)固定 分別切取病健組織→FAA中固定2h，使固定液侵透根組織：

2)脫水與透明 從固定液中取出根組織→70%酒精(2h)更換3次→80%酒精(過夜)→85%酒精(2h)→95%酒精+伊紅(2h)→100%酒精(1h)→1/2酒精+1/2二甲苯(1h)更換2次→二甲苯(1h)更換2次。

3)滲蠟 取出脫水透明的根組織置于蠟杯中→加入2/3的碎石蠟(熔點48°～50°)用蓋子蓋好→37°～40°溫箱中溶蠟(24h)移去杯蓋，置于56°恒溫箱3d，使透明劑充分發(fā)揮→取若干小杯放入溶點為60°～62°的石蠟→將根組織轉(zhuǎn)移到杯中→置70°恒溫箱中，間隔2h更換一次石蠟，連續(xù)3次。

4)包埋 用硬質(zhì)紙折疊成2cm×2cm×1cm的紙盒→紙盒中倒入石蠟→將小杯中的根組織轉(zhuǎn)移到紙盒中，豎直排列→待石蠟稍凝固后置于清水徹底冷卻凝固。

5)修蠟與切片 包埋的根組織蠟塊用刀片切割成梯形→將梯形蠟塊固定在木臺上→小木塊固定于切片機上→設(shè)置切片厚度為8mm，切片時保持連續(xù)性，使切出的小片成一片完整的蠟帶。

6)粘片與烘片 在載玻片上均勻涂抹粘片劑→滴上蒸餾水→選擇完好的蠟帶地域小段置于載玻片上→置放在恒溫展片臺上燙片，蠟帶充分燙平烘干→載玻片置31°恒溫箱中1d。

7) 脫蠟及染色 100%二甲苯(20min)→1/2二甲苯+1/2酒精(2S)→100%酒精(2S)→95%、 85% 、50%酒精(2S) →1%甲苯胺藍染液(30min)→蒸餾水(2S)。

8)封片觀察 用蓋玻片蓋好后置入普通光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.2.6 醋酸苯胺藍與醋酸洋紅染色根毛侵染觀察

將苯胺藍溶于50%醋酸中，配制成濃度為125mg/L的染液，對接種后不同時期的幼苗進行根毛染色，顯微鏡下觀察根腫菌侵染過程。

稱取洋紅粉末1g，倒入100mL 45%的醋酸溶液中，容器中煮沸(30s)冷卻后過濾。醋酸洋紅染色的根毛，徒手切片，顯微鏡下觀察根腫菌皮層侵染動態(tài)。

1.3 主要試劑與設(shè)備

試劑：地衣紅，苯胺藍，洋紅，醋酸，MES，蔗糖，酒精等；

設(shè)備：均漿機，pH計，顯微鏡，切片機，培養(yǎng)箱，電子天秤等。

2 結(jié)果與分析

2.1 十字花科蔬菜根腫病癥狀

通過對長陽縣火燒坪高山蔬菜實地調(diào)查根腫病發(fā)生危害狀況，結(jié)合室內(nèi)盆栽接種對病害癥狀的觀察，感病植物地上和地下均表現(xiàn)出明顯癥狀特征。

在大田發(fā)病期間，根腫病的主要癥狀表現(xiàn)為感病植株生長遲緩，較正常植株矮小，葉片發(fā)黃。重病田塊病株萎縮，甚至死亡，拔起后可見大小不等的腫瘤，根系腐爛(圖2)。

圖2 十字花科蔬菜根腫病大田發(fā)病癥狀

室內(nèi)盆栽接種試驗，感病幼苗根系變褐，白色新根明顯少于健株，30d后病株主根和側(cè)根可見形成十分明顯的腫大(圖3)。

2.2 根腫菌休眠孢子的顯微觀察

對供接種用提取制備的根腫菌休眠孢子懸浮液，在相差顯微鏡下觀察孢子的形態(tài)特征和萌發(fā)情況。病菌休眠孢子為近圓形，表面不平滑，有突起(圖3A)。用醋酸地衣紅染色，可見未萌發(fā)的孢子染成紅色，萌發(fā)的孢子不能著色，呈空孔(圖3B)。根據(jù)對休眠孢子萌發(fā)的觀察，為人工接種觀察病菌侵染寄主的組織學(xué)變化提供了依據(jù)。

圖4 根腫菌休眠孢子形態(tài)及醋酸地衣紅染色

2.3 根腫菌侵染寄主的組織學(xué)觀察

通過對感病寄主和健康植株根組織石蠟切片、光學(xué)顯微鏡進行比較觀察，受根腫菌侵染的植株下胚軸橫切面層次明顯紊亂，皮層中柱等區(qū)間界限模糊不清，原質(zhì)團分布于組織內(nèi)(圖4B)，而健康根組織各層次結(jié)構(gòu)分明(圖4A)。

圖5 感病組織和健康組織層次結(jié)構(gòu)變化比較

從圖5可以看出，根腫菌侵染寄生后，破壞了根組織的正常結(jié)構(gòu)，從而影響寄主根組織的正常發(fā)育，隨著病菌在組織中不斷擴展，對植株的破壞性進一步加重，導(dǎo)致地下和地上部分出現(xiàn)不同病害癥狀。

圖6 感病寄主根腫菌根毛侵染動態(tài)

利用沙——營養(yǎng)液法培育感病幼苗，接種后不同時間段取樣，使用苯胺藍對根毛進行染色，顯微鏡下可見根腫菌首先聚集到根毛周圍(圖6A)，其后，進入根毛內(nèi)形成初級原生質(zhì)團(圖6B)，進而形成游動孢子囊(圖6C，D，F(xiàn))，隨后次級游動孢子釋放(圖6H)，并伴隨對皮層的初期侵染(圖6E，G)。

采用醋酸洋紅對根系組織進行染色，觀察根腫菌侵染皮層動態(tài)。結(jié)果顯示，病菌次級游動孢子侵染根系后，不斷分裂，形成不定型變形體—次級原生質(zhì)團(圖6A)，侵染后期原生質(zhì)團分化形成圓形或近圓形休眠孢子囊，充滿整個寄主細胞(圖6B)，寄主死亡腐爛后，休眠孢子囊釋放出休眠孢子，成為下次侵染的初侵染源。

圖7 感病寄主根腫菌皮層侵染情況

通過不同方法對根腫菌侵染寄主的組織學(xué)觀察，揭示了病菌侵染寄主的動態(tài)過程，及對根系組織的破壞作用。這一結(jié)果為進一步研究根腫菌在活體寄主中的侵染、發(fā)育與致病等提供了參考。

3 小結(jié)與討論

十字花科根腫病是嚴重影響蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要土傳病害，不同十字花科蔬菜品種感病后，最典型的癥狀是根部形成腫瘤，隨著病情的進一步擴展，感病植株生長發(fā)育受阻，地上部分出現(xiàn)萎焉，嚴重時甚至枯死。 采用室內(nèi)人工接種方法培養(yǎng)小白菜幼苗，不同時期取樣，顯微觀察結(jié)果顯示，土壤中根腫菌的休眠孢子，首先附著在寄主根系周圍，進而萌發(fā)侵入根系皮層組織，并完成整個侵染發(fā)育過程。與此同時，伴隨病菌在根組織中的發(fā)育，根組織的正常結(jié)構(gòu)受到破壞。

通過對感病幼苗根組織進行切片，顯微鏡下可見受根腫菌侵染幼苗的根系皮層組織各層次結(jié)構(gòu)不清，而健康幼苗根結(jié)構(gòu)層次分明。由此說明，根腫菌在對寄主根系的侵染過程中，不僅從根組織中獲取維持生長發(fā)育的各種養(yǎng)分，而且病菌分泌的某些化學(xué)物質(zhì)，破壞寄主的正常代謝，從而在根部出現(xiàn)腫瘤，影響?zhàn)B分和水分的運輸，導(dǎo)致生長后期地上部焉萎或植株死亡。

十字花科作物根腫菌是一種尚不能進行人工培養(yǎng)的專性寄生菌，相較于其他植物病原菌，根腫菌的生活史某些生物學(xué)特性等方面的研究，在一定程度上受到很大限制。因此，探索和創(chuàng)新實驗技術(shù)方法，對根腫菌病系學(xué)研究和病害防控等均具重要意義。

本試驗結(jié)果，初步揭示了根腫菌的侵染與發(fā)育及對寄主組織學(xué)的破壞，人工接種試驗采用的相關(guān)技術(shù)方法，對根腫菌病原學(xué)研究、抗病品種鑒定及防病化學(xué)藥劑的篩選等，具有一定參考借鑒作用。有關(guān)根腫菌侵染不同十字花科作物寄主的組織學(xué)與生理學(xué)變化，病菌與寄主的互關(guān)系有待進一步研究。

[1]黃 云，馬淑青．油菜根腫病菌的形態(tài)和休眠孢子的生物學(xué)特性[J]．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,40(7):1388～1394．

[2]羅紅春．蕓薹根腫菌生活史研究-病原菌的侵染．[D]．重慶：西南大學(xué)，2013．

[3]王 靖，黃 云．十字花科根腫病研究進展[J]．植物保護，2011,37(6):153～158．

[4]肖崇剛，郭向華．甘藍根腫病菌的生物學(xué)特性研究[J]．菌物系統(tǒng)，2002,21(4):597～603．

2016—12—18

蘇子毅(1999— )，男，湖北廣水人，曾獲第29屆湖北省青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果一等獎.

班潔靜，Email：448973503@qq.com，現(xiàn)工作單位：國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作湖北中心.

Q93

A

2096-3149(2017)01- 0040-05

10.3969/j.issn.2096-3149.2017.01.009