蘇子毅，班潔靜

(1.湖北省水果湖高級中學，湖北 武漢 430071；2.華中農業(yè)大學植物科技學院，湖北 武漢 430070)

十字花科蔬菜根腫病菌侵染寄主組織學觀察

蘇子毅1，班潔靜2

(1.湖北省水果湖高級中學，湖北 武漢 430071；2.華中農業(yè)大學植物科技學院，湖北 武漢 430070)

十字花科蔬菜根腫病是影響該類蔬菜的重要病害，有效地防治十字花科蔬菜根腫病是對該類蔬菜生產的產量和品質具有十分重要的意義。通過該病害在湖北田間發(fā)病情況的調查，在實驗室對該病害發(fā)病過程情況的觀察、了解、分析，從而為該類蔬菜抗病品種的鑒定及該類蔬菜病害防治化學藥劑的篩選提供科學根據。

蔬菜；十字花科；根腫病

由蕓薹根腫菌(plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的十字花科蔬菜根腫病是影響蔬菜產量和品質的重要病害，生產上一旦發(fā)病就難以有效防治。結合該病在湖北省發(fā)生的危害，在田間調查的基礎上，通過室內人工接種，顯微鏡下觀察了病菌侵染過程及組織學變化，以期為病害的早期防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及來源

供試菌株為蕓薹根腫菌4號小種，由華中農業(yè)大學植物病理室提供。

1.1.2 蔬菜品種

供試品種為新選早熟5號小白菜。

1.2 試驗方法

1.2.1 感病寄生癥狀觀察

在根腫病大田發(fā)病期間，通過對長陽縣火燒坪十字花科蔬菜根腫病田間發(fā)生危害情況的調查，結合室內盆栽試驗，進一步觀察了本病的主要癥狀特點。

1.2.2 根腫菌休眠孢子的提取

根腫組織用自來水洗干凈，7%乙醇表面消毒 30s，加入無菌水充分研磨，經8層紗布過濾，裝入50mL離心管中，500rpm離心15min，棄上清，轉入新離心管中，400rpm離心10min，加15mL 50%蔗糖溶液混勻，2500rpm離心10min，棄上清，移入新離心管中，加滅菌水至35mL，4000rpm離心10min，沉淀溶于30mL滅菌水，4000rpm離心10min，重復兩次。沉淀重新溶于50mL無菌水中，獲得休眠孢子懸浮液。

1.2.3 供試品種幼苗培養(yǎng)及接種

幼苗培養(yǎng)：采用沙-營養(yǎng)液培養(yǎng)供試品種新選早熟5號小白菜幼苗。普通沙粒經過過濾篩過濾，過濾后的沙粒大小為30～50mm，分別裝入50mL有機玻璃離心管中，然后加入改良的hoagland營養(yǎng)液40mL(表1)，調節(jié)pH為5.0 .

表1 營養(yǎng)液配方

幼苗接種：預先提取的根腫菌休眠孢子懸浮液，基質為經過篩的沙粒，將改良后的營養(yǎng)液裝入50mL有機管內，然后將培養(yǎng)的發(fā)芽幼苗植入填充沙粒5mL吸頭中，在幼苗周邊接種休眠孢子懸浮液，最后置于離心濾架內種植(圖1)。以未接種的幼苗為對照。

圖1 供試品種幼苗培養(yǎng)情況

1.2.4 根腫菌休眠孢子萌發(fā)觀察

制備的根腫菌孢子懸浮液，接種前用地衣紅染色，觀察休眠孢子萌發(fā)情況。將冰醋酸45mL裝入錐形瓶中加熱煮沸，然后加地衣紅1g，冷卻后加蒸餾水55mL振蕩，過濾備用。染色后的休眠孢子在光學顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)動態(tài)，供接種用。

1.2.5 根腫菌侵染組織的石蠟切片

發(fā)病根組織與健康對應組織按下列程序進行切片。

1)固定 分別切取病健組織→FAA中固定2h，使固定液侵透根組織：

2)脫水與透明 從固定液中取出根組織→70%酒精(2h)更換3次→80%酒精(過夜)→85%酒精(2h)→95%酒精+伊紅(2h)→100%酒精(1h)→1/2酒精+1/2二甲苯(1h)更換2次→二甲苯(1h)更換2次。

3)滲蠟 取出脫水透明的根組織置于蠟杯中→加入2/3的碎石蠟(熔點48°～50°)用蓋子蓋好→37°～40°溫箱中溶蠟(24h)移去杯蓋，置于56°恒溫箱3d，使透明劑充分發(fā)揮→取若干小杯放入溶點為60°～62°的石蠟→將根組織轉移到杯中→置70°恒溫箱中，間隔2h更換一次石蠟，連續(xù)3次。

4)包埋 用硬質紙折疊成2cm×2cm×1cm的紙盒→紙盒中倒入石蠟→將小杯中的根組織轉移到紙盒中，豎直排列→待石蠟稍凝固后置于清水徹底冷卻凝固。

5)修蠟與切片 包埋的根組織蠟塊用刀片切割成梯形→將梯形蠟塊固定在木臺上→小木塊固定于切片機上→設置切片厚度為8mm，切片時保持連續(xù)性，使切出的小片成一片完整的蠟帶。

6)粘片與烘片 在載玻片上均勻涂抹粘片劑→滴上蒸餾水→選擇完好的蠟帶地域小段置于載玻片上→置放在恒溫展片臺上燙片，蠟帶充分燙平烘干→載玻片置31°恒溫箱中1d。

7) 脫蠟及染色 100%二甲苯(20min)→1/2二甲苯+1/2酒精(2S)→100%酒精(2S)→95%、 85% 、50%酒精(2S) →1%甲苯胺藍染液(30min)→蒸餾水(2S)。

8)封片觀察 用蓋玻片蓋好后置入普通光學顯微鏡下進行觀察。

1.2.6 醋酸苯胺藍與醋酸洋紅染色根毛侵染觀察

將苯胺藍溶于50%醋酸中，配制成濃度為125mg/L的染液，對接種后不同時期的幼苗進行根毛染色，顯微鏡下觀察根腫菌侵染過程。

稱取洋紅粉末1g，倒入100mL 45%的醋酸溶液中，容器中煮沸(30s)冷卻后過濾。醋酸洋紅染色的根毛，徒手切片，顯微鏡下觀察根腫菌皮層侵染動態(tài)。

1.3 主要試劑與設備

試劑：地衣紅，苯胺藍，洋紅，醋酸，MES，蔗糖，酒精等；

設備：均漿機，pH計，顯微鏡，切片機，培養(yǎng)箱，電子天秤等。

2 結果與分析

2.1 十字花科蔬菜根腫病癥狀

通過對長陽縣火燒坪高山蔬菜實地調查根腫病發(fā)生危害狀況，結合室內盆栽接種對病害癥狀的觀察，感病植物地上和地下均表現出明顯癥狀特征。

在大田發(fā)病期間，根腫病的主要癥狀表現為感病植株生長遲緩，較正常植株矮小，葉片發(fā)黃。重病田塊病株萎縮，甚至死亡，拔起后可見大小不等的腫瘤，根系腐爛(圖2)。

圖2 十字花科蔬菜根腫病大田發(fā)病癥狀

室內盆栽接種試驗，感病幼苗根系變褐，白色新根明顯少于健株，30d后病株主根和側根可見形成十分明顯的腫大(圖3)。

2.2 根腫菌休眠孢子的顯微觀察

對供接種用提取制備的根腫菌休眠孢子懸浮液，在相差顯微鏡下觀察孢子的形態(tài)特征和萌發(fā)情況。病菌休眠孢子為近圓形，表面不平滑，有突起(圖3A)。用醋酸地衣紅染色，可見未萌發(fā)的孢子染成紅色，萌發(fā)的孢子不能著色，呈空孔(圖3B)。根據對休眠孢子萌發(fā)的觀察，為人工接種觀察病菌侵染寄主的組織學變化提供了依據。

圖4 根腫菌休眠孢子形態(tài)及醋酸地衣紅染色

2.3 根腫菌侵染寄主的組織學觀察

通過對感病寄主和健康植株根組織石蠟切片、光學顯微鏡進行比較觀察，受根腫菌侵染的植株下胚軸橫切面層次明顯紊亂，皮層中柱等區(qū)間界限模糊不清，原質團分布于組織內(圖4B)，而健康根組織各層次結構分明(圖4A)。

圖5 感病組織和健康組織層次結構變化比較

從圖5可以看出，根腫菌侵染寄生后，破壞了根組織的正常結構，從而影響寄主根組織的正常發(fā)育，隨著病菌在組織中不斷擴展，對植株的破壞性進一步加重，導致地下和地上部分出現不同病害癥狀。

圖6 感病寄主根腫菌根毛侵染動態(tài)

利用沙——營養(yǎng)液法培育感病幼苗，接種后不同時間段取樣，使用苯胺藍對根毛進行染色，顯微鏡下可見根腫菌首先聚集到根毛周圍(圖6A)，其后，進入根毛內形成初級原生質團(圖6B)，進而形成游動孢子囊(圖6C，D，F)，隨后次級游動孢子釋放(圖6H)，并伴隨對皮層的初期侵染(圖6E，G)。

采用醋酸洋紅對根系組織進行染色，觀察根腫菌侵染皮層動態(tài)。結果顯示，病菌次級游動孢子侵染根系后，不斷分裂，形成不定型變形體—次級原生質團(圖6A)，侵染后期原生質團分化形成圓形或近圓形休眠孢子囊，充滿整個寄主細胞(圖6B)，寄主死亡腐爛后，休眠孢子囊釋放出休眠孢子，成為下次侵染的初侵染源。

圖7 感病寄主根腫菌皮層侵染情況

通過不同方法對根腫菌侵染寄主的組織學觀察，揭示了病菌侵染寄主的動態(tài)過程，及對根系組織的破壞作用。這一結果為進一步研究根腫菌在活體寄主中的侵染、發(fā)育與致病等提供了參考。

3 小結與討論

十字花科根腫病是嚴重影響蔬菜產量和品質的重要土傳病害，不同十字花科蔬菜品種感病后，最典型的癥狀是根部形成腫瘤，隨著病情的進一步擴展，感病植株生長發(fā)育受阻，地上部分出現萎焉，嚴重時甚至枯死。 采用室內人工接種方法培養(yǎng)小白菜幼苗，不同時期取樣，顯微觀察結果顯示，土壤中根腫菌的休眠孢子，首先附著在寄主根系周圍，進而萌發(fā)侵入根系皮層組織，并完成整個侵染發(fā)育過程。與此同時，伴隨病菌在根組織中的發(fā)育，根組織的正常結構受到破壞。

通過對感病幼苗根組織進行切片，顯微鏡下可見受根腫菌侵染幼苗的根系皮層組織各層次結構不清，而健康幼苗根結構層次分明。由此說明，根腫菌在對寄主根系的侵染過程中，不僅從根組織中獲取維持生長發(fā)育的各種養(yǎng)分，而且病菌分泌的某些化學物質，破壞寄主的正常代謝，從而在根部出現腫瘤，影響?zhàn)B分和水分的運輸，導致生長后期地上部焉萎或植株死亡。

十字花科作物根腫菌是一種尚不能進行人工培養(yǎng)的專性寄生菌，相較于其他植物病原菌，根腫菌的生活史某些生物學特性等方面的研究，在一定程度上受到很大限制。因此，探索和創(chuàng)新實驗技術方法，對根腫菌病系學研究和病害防控等均具重要意義。

本試驗結果，初步揭示了根腫菌的侵染與發(fā)育及對寄主組織學的破壞，人工接種試驗采用的相關技術方法，對根腫菌病原學研究、抗病品種鑒定及防病化學藥劑的篩選等，具有一定參考借鑒作用。有關根腫菌侵染不同十字花科作物寄主的組織學與生理學變化，病菌與寄主的互關系有待進一步研究。

[1]黃 云，馬淑青．油菜根腫病菌的形態(tài)和休眠孢子的生物學特性[J]．中國農業(yè)科學，2007,40(7):1388～1394．

[2]羅紅春．蕓薹根腫菌生活史研究-病原菌的侵染．[D]．重慶：西南大學，2013．

[3]王 靖，黃 云．十字花科根腫病研究進展[J]．植物保護，2011,37(6):153～158．

[4]肖崇剛，郭向華．甘藍根腫病菌的生物學特性研究[J]．菌物系統(tǒng)，2002,21(4):597～603．

2016—12—18

蘇子毅(1999— )，男，湖北廣水人，曾獲第29屆湖北省青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果一等獎.

班潔靜，Email：448973503@qq.com，現工作單位：國家知識產權局專利局專利審查協(xié)作湖北中心.

Q93

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2096-3149(2017)01- 0040-05

10.3969/j.issn.2096-3149.2017.01.009