鄭思建， 徐 嬋， 楊 潔， 黃 蘊， 文琰章，宋 萍， 林親雄， 王 強， 楊新洲*

(1.中南民族大學 藥學院， 武漢 430074; 2.華中科技大學 同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 藥學部， 武漢 430000；3.青海民族大學 科學科技處， 西寧 810007)

藏藥抗肝癌活性研究

鄭思建1， 徐 嬋2， 楊 潔1， 黃 蘊1， 文琰章1，宋 萍3， 林親雄1， 王 強1， 楊新洲1*

(1.中南民族大學 藥學院， 武漢 430074; 2.華中科技大學 同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 藥學部， 武漢 430000；3.青海民族大學 科學科技處， 西寧 810007)

本實驗采用快速溶劑萃取法制備收集100種常用藏藥的環(huán)己烷、乙酸乙酯和甲醇提取物，并運用MTT法對兩個肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721進行各提取物的抗肝癌活性測試，同時選用L-02細胞來評價其體外毒性.抗肝癌活性結(jié)果顯示100種常用藏藥中17種藏藥材有良好的抗肝癌活性，其IC50值均小于150 μg/mL，其中馬兜鈴、藍翠雀花、甘青青蘭、掌葉橐吾的乙酸乙酯提取物顯示出顯著的抗肝癌活性，其IC50值均小于50 μg/mL，但馬兜鈴乙酸乙酯提取物對正常肝細胞L-02顯示出一定的毒性.在進一步的抗HepG2肝癌活性驗證中，結(jié)果顯示藍翠雀花乙酸乙酯提取物和甘青青蘭乙酸乙酯提取物具有顯著的抗肝癌活性，兩者在抗HepG2肝癌細胞株活性中皆顯示出顯著的時效和量效關系.運用倒置顯微鏡以及Hoechst 33258熒光染色法對經(jīng)過藍翠雀花乙酸乙酯提取物或甘青青蘭乙酸乙酯提取物作用的HepG2細胞形態(tài)進行觀察，結(jié)果提示藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯提取物可能是通過誘導HepG2細胞凋亡而顯示抗癌活性.

原發(fā)性肝癌； 藏藥； 抗肝癌活性篩選； MTT； 快速溶劑萃取

原發(fā)性肝細胞癌(Primary hepatocellular carcinoma，HPC)也稱肝癌，是一種起源于肝臟實質(zhì)或肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管細胞癌及肝細胞和肝內(nèi)膽管細胞混合型癌，是世界上最常見的腫瘤之一，每年估計約有50萬至100萬新病例，在各種致死惡性腫瘤中居第二位，占各種惡性腫瘤死亡率的第二位[1].肝癌的致病因素，目前尚未有明確闡述.有研究報道表明，原發(fā)性肝癌與肥胖、糖尿病、肝炎等疾病有關[2].原發(fā)性肝癌在亞洲和撒哈拉以南非洲的某些地區(qū)特別常見，其中年發(fā)病率高達50 000例/10萬人口.2002年全世界發(fā)生的癌癥新病例數(shù)為1 090萬例，其中原發(fā)性肝癌為62.6萬例，死亡59.8萬例，兩者幾乎相等，而其中55%的PHC發(fā)生在我國[3].我國PHC死亡率在惡性腫瘤中居第二位，在農(nóng)村僅次于胃癌，在城市僅次于肺癌[4].迄今為止，對治療肝癌的藥物多為化學藥，而原發(fā)性肝癌多為肝細胞癌(HCC)，其對化學藥敏感，且其開發(fā)費用昂貴，毒副作用大[5].因此，人們試圖從天然藥物中尋找毒副作用小、作用獨特的抗腫瘤藥物，這已是當今抗腫瘤藥物研發(fā)的戰(zhàn)略重點之一.

藏藥是我國傳統(tǒng)藥學的重要組成部分，是我國醫(yī)藥學中僅次于中醫(yī)藥學的一門民族醫(yī)藥.藏醫(yī)藥有著悠久的歷史與雄厚的應用基礎，是凝聚著藏族人民長期與疾病作斗爭的寶貴經(jīng)驗的獨特理論體系，富含濃厚的民族特色.近年來，藏藥以其獨特的療效，特有的植物生態(tài)及其封閉的原始環(huán)境引起了藥物研究者的極大關注，藏藥的研究與應用得到越來越多的重視[6-8].藏藥傳統(tǒng)的治療方法，具備著自身的獨特與優(yōu)勢，在某些特殊的疑難病證的治療方面有特定的療效，尤其在治療心血管系統(tǒng)、肝膽疾病、呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病和多種疑難雜癥等方面有著顯著療效，許多植物來源的藏藥和藏藥方劑已顯示出潛在的抗癌活性[9-13].立足于青海省豐富的藏藥資源和青海民族大學的研究基礎和條件，目前已建立了100種常用藏藥的提取物庫.每種原藥材5.0 g，采用溶劑加壓提取技術快速制備了環(huán)己烷、乙酸乙酯和甲醇3個部位提取物，供抗肝癌活性篩選.選用兩個肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721，采用MTT法測試100種藏藥環(huán)己烷、乙酸乙酯和甲醇提取物的抗肝癌活性，選用肝細胞株L-02來評價藏藥對人體正常細胞的毒性.抗肝癌活性篩選結(jié)果顯示17種藏藥提取物顯示出抗肝癌活性，它們的IC50值均小于150 μg/mL，其中馬兜鈴乙酸乙酯提取物顯示出顯著的抗肝癌活性，其IC50值均小于50 μg/mL，但對正常肝細胞L-02顯示出一定的毒性.在進一步的抗HepG2肝癌活性驗證中，結(jié)果顯示藍翠雀花乙酸乙酯提取物和甘青青蘭乙酸乙酯提取物具有顯著的抗肝癌活性，兩者在抗HepG2肝癌細胞株活性中皆顯示出顯著的時效和量效關系.運用倒置顯微鏡以及Hoechst 33258熒光染色法對經(jīng)過藍翠雀花乙酸乙酯提取物或甘青青蘭乙酸乙酯提取物作用的HepG2細胞形態(tài)進行觀察，結(jié)果提示藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯提取物可能是通過誘導HepG2細胞凋亡而顯示抗癌活性.本研究為進一步從藏藥中發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物提供思路.

1材料與方法

1.1藥物與試劑

100種常用藏藥于2010年6月至9月采集于青海省互助縣北山林場，經(jīng)青海民族大學化學與生命科學學院毛繼祖教授鑒定，所有藥材標本存放于青海民族大學化學與生命科學學院標本館.采用快速溶劑萃取儀(Thermo Fisher ASE 350型)、平行蒸發(fā)儀(英國GeneVac EZ-2)對100種常用藏藥進行提取與收集，分別得到100種常用藏藥的各溶劑部位，即環(huán)己烷、乙酸乙酯和甲醇提取物.詳細步驟為：取干燥的藏藥原藥材，每種7.0 g，粉碎成粉末，稱取5.0 g，以ASE350型快速溶劑萃取儀制備環(huán)己烷、乙酸乙酯和甲醇的提取物，具體的制備流程按照以前文獻[10]的描述進行.制備的藏藥的乙酸乙酯和甲醇提取物供抗肝癌活性篩選，臨用前分別用DMSO進行溶解，用時分別用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度.活性測試用顯微鏡：Olympus B202型；酶標儀：Spectra Max 340PC型；CO2培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板：上海拜力生物科技有限公司；細胞株：肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721及人正常肝細胞株L-02(American Type Culture Collection，Rockville， MD， USA)；CDDP(順鉑)(純度>98%)：Sigma公司；小牛血清：上海拜力生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基：上海拜力生物科技有限公司；MTT： Sigma公司；雙抗：上海博耀生物科技有限公司；環(huán)己烷、乙酸乙酯和甲醇(AR)：國藥集團.

1.2細胞培養(yǎng)

將人肝癌細胞株 HepG2、SMMC-7721、L-02 3種細胞株(武漢中國典型物保藏中心)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)和1%抗生素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，在37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)生長、傳代.每隔一天更換一次培養(yǎng)基.

1.3抗肝癌活性測試

[14-15]，取對數(shù)生長期的HepG2、SMMC-7721、L-02 3種細胞株接種到96孔板中(調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104個/mL，每孔0.2 mL)，于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔分別添加由含10%小牛血清和1%雙抗的DMEM液配制成的待測樣品0.1 mL，使樣品濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)；每個濃度一式3孔，同時設不加測試樣品的實驗對照和不加樣品和細胞的空白對照，培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，然后分別加入5 mg/mL的MTT 100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入0.15 mL DMSO，振搖10 min，充分溶解細胞內(nèi)生成的紫色甲臜結(jié)晶，于550 nm下測定每孔A值.生長抑制率=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%. 按文獻[14]計算半數(shù)抑制濃度(IC50)．

1.4抗HepG2肝癌細胞株時效-量效實驗研究

取對數(shù)生長期的HepG2細胞株接種到96孔板中(調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104個/mL，每孔0.2 mL)，于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔分別添加由含10%小牛血清和1%雙抗的DMEM液配制成的待測樣品0.1 mL，使具有最佳抗癌活性的藏藥提取物濃度分別為25、50、100、200 μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)；每個濃度一式3孔，同時設不加測試樣品的實驗對照和不加樣品以及細胞的空白對照，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，棄掉培養(yǎng)液，分別加入含5 mg/mL MTT 10 μL的100 μL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h.吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振搖10 min，充分溶解細胞內(nèi)生成的紫色甲臜結(jié)晶，于550 nm下測定每孔A值.生長抑制率=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%. 按文獻[14]計算半數(shù)抑制濃度(IC50)．

1.5HepG2肝癌細胞株形態(tài)學分析

運用倒置顯微鏡以及Hoechst 33258熒光染色法進行細胞形態(tài)觀察.Hoechst 33258熒光染色法[16]：將處于對數(shù)生長期的 HepG2 細胞接種于 24孔培養(yǎng)板中(細胞數(shù)為每孔 1 ×105個)，每孔1 mL，培養(yǎng) 24 h后，分別加入濃度為25、50、100 μg/mL的具有最佳抗癌活性的藏藥提取物，空白對照組不加藥物，陽性對照組加入25 μg/mL的順鉑，培養(yǎng)至 24 h 后棄掉培養(yǎng)基，每孔加入1 mL細胞固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，固定細胞15 min后，立即吸出，并用PBS洗滌，洗滌3次，風干后于暗室中每孔點加1 mL Hoechst 33258熒光染色液，避光染色30 min.PBS洗滌3次后，每孔加入1 mL甘油進行封片，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài).

1.6統(tǒng)計學處理

單因素方差分析用于多組比較. 使用Pearson相關分析進行相關分析. 數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準誤差(M±SEM).P值<0.05被認為是顯著的.使用GraphPad Prism 5.0軟件包進行統(tǒng)計分析.

2結(jié)果

2.1100種常用藏藥提取物抗肝癌活性結(jié)果

運用MTT法選用兩個肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721來測試100種藏藥的抗肝癌活性，其抗肝癌活性結(jié)果見表1.活性結(jié)果表明，100種藏藥中，17種藏藥的乙酸乙酯和甲醇提取物顯示出抗肝癌活性，沙參、車前草、臭蒿、茜草、川西獐牙菜、白芨、蒲公英、藍翠雀花、甘青青蘭、掌葉橐吾、馬薕子、余甘子、菟絲子、丹參和馬兜鈴的乙酸乙酯部位及茜草、甘青青蘭、麻黃、大黃甲醇提取物的抗肝癌活性IC50值范圍在2.9～147.8 μg/mL之間.其中，馬兜鈴，藍翠雀花、甘青青蘭、掌葉橐吾的乙酸乙酯提取物顯示出顯著的抗肝癌活性，其IC50值均小于50 μg/mL(表1).馬兜鈴的乙酸乙酯提取物顯示出最強的抗肝癌活性，對兩個肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721的IC50值分別為2.9 μg/mL和3.2 μg/mL，但在200 μg/mL的濃度下對正常肝細胞L-02顯示出較強的毒性；另外兩種藥材藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯提取物顯示較好的抗肝癌活性，其對HepG2細胞的IC50值分別為28.8 μg/mL和39.9 μg/mL，其對SMMC-7721細胞的IC50值分別為31.4 μg/mL和33.1 μg/mL，且對L-02細胞的毒性較小.

表1 17種藏藥提取物抗肝癌活性結(jié)果(IC50， μg/mL; mean±SD， n=3)

aE：乙酸乙酯提取物；bM：甲醇提取物；c順鉑作為陽性對照．

2.2藍翠雀花和甘青青蘭抽提前后的抗肝癌活性對比

利用MTT法檢測藍翠雀花和甘青青蘭抽提前后的抗肝癌活性對比，以選擇最佳的抗肝癌活性部位.對培養(yǎng)良好的HepG2細胞分別給予0、50、100、200 μg/mL的待測樣品和25 μg/mL順鉑(CDDP)，孵育24 h后，檢測細胞存活能力，并以百分比表示.如圖1所示，藍翠雀花總提取物(抽提前) (圖1A)抑制肝癌細胞增殖的能力較其乙酸乙酯提取物的弱，同樣的，甘青青蘭總提取物(抽提前) (圖1B)對肝癌細胞增殖的抑制能力亦不如其乙酸乙酯提取物.

圖1 A. 蘭翠雀花總提物(8)和藍翠雀花乙酸乙酯部位(8E)抑制HepG2增殖結(jié)果B. 甘青青蘭總體物(9)和甘青青蘭乙酸乙酯部位(9E)抑制HepG2增殖結(jié)果Fig.1 A. Inhibitory effects of total extract of Delphinium caeruleum (8) and the ethyl acetate extracts of Delphinium caeruleum (8E) on the proliferation of HepG2 cells; B.Inhibitory effects of Dracocephalum tanguticum (9) and the ethyl acetate extracts of Dracocephalum tanguticum (9E) on the proliferation of HepG2 cells.

2.3藍翠雀花和甘青青蘭抗HepG2肝癌活性的量效以及時效研究

利用MTT法檢測蘭翠雀花乙酸乙酯部位(8E)、甘青青蘭乙酸乙酯部位(9E)抑制HepG2增殖的能力，并且進行抗肝癌HepG2細胞株時效-量效實驗.對培養(yǎng)良好的HepG2細胞株分別給予25、50、100、200 μg/mL待測樣品和25 μg/mL順鉑(CDDP)，孵育12、24和48 h后，檢測細胞生存能力，并以百分比表示.如圖2所示， 圖A、B、C分別表示蘭翠雀花乙酸乙酯提取物對HepG2細胞作用12、24、48 h的結(jié)果，從圖2中可以觀察到，蘭翠雀花抑制HepG2細胞增殖的能力隨著作用時間的增加而增強，并顯示劑量依賴的效果.圖D、E、F分別表示甘青青蘭乙酸乙酯提取物對HepG2 細胞作用12、24、48 h 的結(jié)果.從圖可以觀察到，甘青青蘭對HepG2 的抑制能力沒有蘭翠雀花的強，但亦顯示出明顯的時效、量效關系，即隨著作用時間的增加，甘青青蘭對HepG2細胞的抑制能力增加，且呈現(xiàn)出劑量依賴的關系.

圖2 蘭翠雀花乙酸乙酯部位8E(A～C)和甘青青蘭乙酸乙酯部位9E(D～F)抑制HepG2增殖的時效-量效圖Fig.2 The ethyl acetate extract of Delphinium caeruleum 8E (A～C) and the ethyl acetate extract of Dracocephalum tanguticum 9E (D～F) time-dependently provoked HepG2 cells apoptosis in vitro.

2.4倒置相差顯微鏡觀察HepG2細胞株形態(tài)學變化

經(jīng)藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯部位處理后的人肝癌細胞HepG2于倒置相差顯微鏡下觀察，形態(tài)如下(圖3)：未給藥組HepG2細胞生長良好，輪廓清晰，貼壁完整，排列整齊，間隙緊密，細胞體飽滿；而經(jīng)藥處理后，細胞變圓、皺縮，細胞間隙變大，同時貼壁性下降，多數(shù)細胞脫落并漂浮于培養(yǎng)液中，并且呈現(xiàn)一定的量效關系.

2.5熒光顯微鏡觀察HepG2細胞形態(tài)學變化

經(jīng)藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯部位分別處理HepG2細胞，細胞經(jīng)Hoechst 33258熒光染色液染色，熒光顯微鏡下觀察.陰性對照組無明顯凋亡細胞(見圖 4A、4F)，細胞生長狀態(tài)良好，分布均勻，細胞核著色均一、飽滿，呈橢圓形或圓形分布，并且細胞呈現(xiàn)出均勻藍色熒光.當藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯部位作用 HepG2 細胞 24 h后，出現(xiàn)了早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞(見圖4)，即細胞染色質(zhì)密集，細胞核皺縮，細胞核發(fā)出強烈的藍色熒光，且隨著給藥劑量的增加，細胞核藍色熒光強度也逐漸增強.

圖3 倒置相差顯微鏡檢測HepG2細胞形態(tài)學變化Fig.3 Morphologic changes of HepG2 cells were observed by a phase contrast microscope

圖4 Hoechst 33258染色觀察細胞形態(tài)學變化Fig.4 Morphologic changes of HepG2 cells by Hoechst 33258 staining

3結(jié)論

在本研究中，采用快速溶劑萃取法制備100種常用藏藥的3種不同溶劑的提取物，運用MTT法對300種藥材提取物進行體外抗肝癌活性篩選，結(jié)果顯示17種藏藥具有一定的抗肝癌活性，其中馬兜鈴的乙酸乙酯提取物顯示出顯著的活性，但對正常肝細胞L-02也顯示較強的肝毒性，另外兩種藥材藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯提取物顯示較好的抗肝癌活性，其對HepG2細胞的IC50值分別為28.8 μg/mL和39.9 μg/mL，其對SMMC-7721細胞的IC50值分別為31.4 μg/mL和33.1 μg/mL，且對L-02細胞的毒性較小；此外，抗肝癌活性結(jié)果顯示，蘭翠雀花乙酸乙酯提取物和甘青青蘭乙酸乙酯提取物的抗肝癌活性均比植株抽提前的抗肝癌活性強；進一步研究顯示藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯提取物對HepG2細胞抗肝癌活性顯示良好的量效和時效關系，且經(jīng)倒置相差顯微鏡和熒光倒置顯微鏡檢測給藥后HepG2細胞形態(tài)變化，結(jié)果提示藍翠雀花和甘青青蘭乙酸乙酯提取物可能是通過誘導HepG2細胞凋亡而顯示抗癌活性.據(jù)文獻報導，從藥用植物中提取的黃酮、生物堿、二萜等，具有良好的抗肝癌活性[17].藍翠雀花中含有的中等極性成分8-甲氧基-5，7，3’，4’-四羥基黃酮[18]、二萜生物堿[19]、藍翠雀寧[19]有可能是其乙酸乙酯部位抗肝癌的有效成分.甘青青蘭中所含的中等極性成分5，7，4’-三羥基-3’，5’-二甲氧基黃酮、5，3’，4’-三羥基-6，7-二甲氧基黃酮、5，6，4’-三羥基-7-甲氧基黃酮等[20]黃酮類成分可能是甘青青蘭乙酸乙酯部位抗肝癌的有效成分.關于藍翠雀花乙酸乙酯提取物和甘青青蘭乙酸乙酯提取物的抗肝癌有效化學成分，還待進一步的研究.我們對常用藏藥系統(tǒng)性的抗肝癌活性篩選及初步的機制研究以及抗肝癌活性成分的初步探討將為資源豐富的藏藥的開發(fā)和利用打下一定的基礎.

參考文獻：

[1] SIEGEL R， NAISHADHAM D， JEMAL A. Cancer statistics， 2012 [J]. Ca-Cancer J Clin， 2012， 62: 10-29．

[2] EL-SERAG H B， RUDOLPH K L. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis [J]. Gastroenterology， 2007， 132: 2557-2576．

[3] PARKIN D M， FERLAY J. Global cancer statistics [J]. Cancer J Clin， 2005， 55: 74-108．

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.2004年中國衛(wèi)生統(tǒng)計提要[D]. 北京: 中華人民共和國衛(wèi)生部， 2004: 5， 78．

[5] 周岱翰. 原發(fā)性肝癌的姑息治療與經(jīng)方應用[J]. 中醫(yī)雜志， 2012， 53(15): 1288-1290.

[6] 房靈敏， 吳小瓊， 占 堆. 西藏藏藥產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新能力比較分析研究[J]. 西藏研究， 2007， 2(2): 82-89．

[7] 宇脫·云丹貢布等著. 四部醫(yī)典[M]. 馬士林譯.上海： 上海科學技術出版社， 1987．

[8] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會. 中華本草:藏藥卷[M]. 上海： 上海科學技術出版社， 1999．

[9] 宗玉英， 黨合群， 駱桂法， 等. 110種藏藥抗腫瘤體外篩選實驗研究[J]. 藥學實踐雜志， 2000， 18: 290-291．

[10] 宋 萍， 徐 嬋， 馬云瑞， 等. 100種常用藏藥抗肝癌的體外活性篩選[J]. 中南民族大學學報， 2015， 34: 64-67．

[11] 李 艷， 江 南， 羅 霞， 等. 藏藥塞卡有效部位的分離鑒定及其抗腫瘤活性研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 1998， 19: 1118-1120．

[12] 劉 昕， 潘興斌， 李興玉. 藏藥柳茶提取物對K562腫瘤細胞生長的影響[J].中國病理生理雜志， 2003， 19: 253-255．

[13] 李海峰. 藏藥六味木香丸治療腫瘤化療后惡心嘔吐72例觀察[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志， 2007， 9: 13．

[14] SONG P， YANG X Z， YUAN J Q. Cytotoxic constituents from Psoralea corylifolia [J]. J Asian Nat Prod Res， 2013， 15(6): 624-630．

[15] 黃琪佳， 吳敏， 黃玉瑩， 等. 鳶尾內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum YW1的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究[J]. 華中師范大學學報(自然科學版)， 2016， 50(6): 880-885．

[16] 張 倫， 楊光忠， 歐澤亮， 等. 野木瓜三萜皂苷類化合物抗炎活性研究[J]. 華中師范大學學報(自然科學版)， 2013， 47: 348-352.

[17] 劉 斐， 商 倩， 張士俊. 中藥活性成分抗肝癌的研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2012， 6: 624-628．

[18] 劉世軍， 廖志新， 唐志書， 等. 藍翠雀花的化學成分研究[J]. 中藥材， 2016， 2: 318-321．

[19] 潘遠江， 王 銳， 陳紹農(nóng)， 等. 藏藥藍翠雀花中的新二萜生物堿[J]. 高等學?；瘜W學報， 1992， 11: 1418-1419．

[20] 沈 杰， 葉蘊華， 周亞偉. 藏藥甘青青蘭的生物活性成分研究[J]. 中國藥學雜志， 2009， 3: 170-175．

In vitro anticancer screening of Tibetan medicines

ZHENG Sijian1， XU Chan2， YANG Jie1， HUANG Yun1， WEN Yanzhang1，SONG Ping3， LIN Qinxiong1， WANG Qiang1， YANG Xinzhou1

(1.College of Pharmacy， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074;2.Tongji Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430000;3.Division of Science & Technology， Qinghai University for Nationalities， Xining 810007)

The extraction of cyclohexane， ethyl acetate and methanol from 100 commonly used Tibetan medicines was prepared by the accelerated solvent extraction method. The MTT method was used to test antitumor activity of these 100 tibetan medicines against two hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 and SMMC-7721， while preliminary toxicity towards normal human cells was investigated using a human liver cell line L-02. The antitumor screening results showed that 17 tibetan medicines exhibited antitumor activities against HepG2 and SMMC-7721 withIC50values less than 150 μg/mL. Among them， the ethyl acetate extracts ofAristolochiaimpresinervis，Delphiniumcaeruleum，DracocephalumtanguticumandLigulariaprzewalskiishowed significant antitumor activity against HepG2 and SMMC-7721 withIC50values less than 50 μg/mL， but tthat ofAristolochiaimpresinervisshowed certain toxicity against L-02 up to 200 μg/mL. In the further validation of anti-HepG2 liver cancer activity， the results signified that the ethyl acetate extracts ofDelphiniumcaeruleumandDracocephalumtanguticumhad significant anti-hepatocarcinoma activities， both of which presented significant time and dose dependent relationships against HepG2 hepatocarcinoma cell lines. The morphological changes of HepG2 cells treated with the ethyl acetate extracts ofDelphiniumcaeruleumorDracocephalumtanguticumwere investigated by inverted microscope and Hoechst 33258 fluorescent staining method. The results demonstrated that apoptosis were induced by the ethyl acetate extracts ofDelphiniumcaeruleumandDracocephalumtanguticumanti-cancer in HepG2 cells．

primary hepatocellular carcinoma; Tibetan medicines; anti-cancer screening; MTT; accelerated solvent extracting

2017-01-29.

國家自然科學基金項目(81573561);青海省自然科學基金項目(2012-Z-904).

1000-1190(2017)03-0328-07

R285.5

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: xzyang@mail.scuec.edu.cn.