陳硯美， 楊 晗， 王 芳， 熊緒杰， 張萬(wàn)舉

(黃岡師范學(xué)院 催化材料制備與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 黃岡 438000)

紫外線吸收劑PBSA與DNA相互作用的光譜研究

陳硯美， 楊 晗， 王 芳， 熊緒杰， 張萬(wàn)舉*

(黃岡師范學(xué)院 催化材料制備與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 黃岡 438000)

采用熒光光譜法和紫外光譜法， 在模擬生理?xiàng)l件下(pH=7.23)對(duì)紫外線吸收劑2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)與脫氧核糖核酸(DNA)的相互作用進(jìn)行了研究.結(jié)果表明PBSA能夠與DNA相結(jié)合形成復(fù)合物，引起了PBSA紫外吸收的降低和熒光的猝滅；PBSA與DNA的相互作用為靜態(tài)猝滅過(guò)程，兩者間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.11.

2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)； DNA相互作用； 光譜法

紫外線吸收劑是一種光穩(wěn)定劑，能夠吸收可引起人產(chǎn)生急性皮炎和皮膚灼傷、變黑的紫外線，從而減輕紫外線對(duì)皮膚的損傷，廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、染料、汽車擋風(fēng)玻璃、化妝品、藥物、防曬劑等各類產(chǎn)品[1].2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)是一種新型紫外線吸收劑，在302 nm紫外波長(zhǎng)處吸收系數(shù)高達(dá)920～990，是普通紫外線吸收劑的3倍以上[2]，由于具有良好的水溶性和較高的紫外線吸收效率，在各類水基防曬化妝品中被廣泛應(yīng)用.防曬劑在使用過(guò)程中，會(huì)不可避免的通過(guò)皮膚吸收進(jìn)入體內(nèi)，所以其安全性尤為引人重視.有研究表明，PBSA能夠在UV照射下產(chǎn)生活性氧物質(zhì)并造成DNA損傷[3]，但是，PBSA在使用過(guò)程中被人體吸收，其在體內(nèi)對(duì)生物體產(chǎn)生的可能影響目前還未見(jiàn)報(bào)道，有必要對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的研究.

圖1 PBSA的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Scheme of PBSA

DNA是生物體內(nèi)最重要的生物大分子之一，是遺傳信息的攜帶和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物的各個(gè)生命活動(dòng)中具有重要的作用.很多外源性物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)后，會(huì)和DNA發(fā)生不同類型的相互作用，從而可能對(duì)DNA的生理功能產(chǎn)生影響[4]，因此，研究小分子化合物與DNA相互作用可以在一定程度上反映該化合物的生物安全性.本文通過(guò)紫外光譜和熒光光譜法，在模擬生理?xiàng)l件下研究了紫外線吸收劑PBSA與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用，以期對(duì)PBSA的應(yīng)用安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器試劑

紫外光譜采用北京譜析Tu-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量；熒光光譜采用島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)測(cè)定.小牛胸腺DNA(CT-DNA)購(gòu)于sigma公司；PBSA由湖北宏源藥業(yè)公司提供；其它試劑均為市售分析純.

Tris-HCl緩沖液的配制：稱取0.605 7 g(5 mmol)的Tris[(CH3OH)3CNH2]溶于25.0 mL水中，得到0.2 M的Tris溶液，再加入37.5 mL的0.1 M的HCl溶液，稀釋至100 mL，得到pH值為7.23的Tris-HCl緩沖溶液.

1.2紫外光譜測(cè)定

CT-DNA用前沒(méi)有作進(jìn)一步處理，溶液由Tris-HCl緩沖溶液配制，純度經(jīng)檢測(cè)符合實(shí)驗(yàn)要求(A260/A280=1.82)，濃度通過(guò)DNA在260 nm處的紫外吸收確定(ε=6600 L·mol-1·cm-1)[5].

1.2.1DNA滴定PBSA 為了研究PBSA與DNA相互作用的模式及強(qiáng)度，以DNA滴定PBSA測(cè)其紫外光譜.實(shí)驗(yàn)中以蒸餾水為參比，在1 cm的石英比色皿中加入3.0 mL濃度為1.0×10-5mol·L-1的PBSA溶液，在220～400 nm進(jìn)行波譜掃描.然后，用微量管往樣品池和參比池中同時(shí)依次加入等量的DNA緩沖溶液，充分混合，靜止10 min后進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，測(cè)定PBSA與DNA相互作用后的紫外吸收光譜.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中等量的DNA緩沖溶液被加入到空白池中以扣除DNA濃度對(duì)其紫外吸收的影響.

1.2.2PBSA滴定DNA 為了研究DNA與PBSA相互作用前后結(jié)構(gòu)的變化，以DNA滴定PBSA測(cè)其紫外光譜.實(shí)驗(yàn)中以Tris-HCl緩沖液為參比，在1 cm的石英比色皿中加入3.0 mL濃度為1.5×10-4mol·L-1的DNA溶液，在220～360 nm進(jìn)行波譜掃描.然后，用微量管往樣品池和參比池中同時(shí)依次加入等量的PBSA水溶液，充分混合，靜止10 min后進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，測(cè)定DNA與PBSA相互作用后的紫外吸收光譜.

1.3熒光光譜測(cè)定

以240 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)記錄PBSA的熒光.然后往樣品池中逐步加入等量的DNA，測(cè)定不同濃度的PBSA-DNA系列試樣在540～630 nm波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化.系列試樣中PBSA的濃度為8 × 10-6mol·L-1，DNA的濃度分別為: (a) 0，(b) 3.95×10-6，(c) 7.90×10-6，(d) 11.85×10-6，(e) 15.80×10-6，(f) 19.75×10-6.

2結(jié)果與討論

2.1PBSA與DNA相互作用的模式及強(qiáng)度

PBSA有兩個(gè)較強(qiáng)的紫外吸收峰，分別位于240 nm和303 nm處，由圖2可知，隨著DNA的加入，PBSA的紫外吸收呈現(xiàn)一定的減色效應(yīng)，但沒(méi)有出現(xiàn)紅移或者藍(lán)移.根據(jù)Long等[6]提出的判據(jù)， 當(dāng)藥物分子與DNA發(fā)生嵌插作用時(shí)， 藥物分子的π軌道和DNA堿基π軌道相互耦合， 最大吸收峰發(fā)生位移且存在減色或增色效應(yīng)，當(dāng)藥物分子與DNA發(fā)生靜電作用時(shí)， 峰位置不變， 只有強(qiáng)度改變.由此我們判斷，PBSA與DNA的作用方式主要為靜電作用[7].DNA加入后，PBSA在240 nm處的紫外吸收峰減色更為明顯，PBSA與DNA相互作用的鍵合常數(shù)根據(jù)以下公式計(jì)算[8]：

[DNA]/(εA-εF)=[DNA]/(εB-εF)+1/Kb(εB-εF)，

其中[DNA]代表DNA的濃度，εA，εF和εB分別代表在各DNA濃度下的、游離的和與DNA鍵合飽和的PBSA的摩爾吸光系數(shù).以240 nm處紫外吸收峰為研究對(duì)象，由[DNA]/(εA-εF)對(duì)[DNA]作圖，得到斜率和截距，斜率和截距之比即為PBSA與DNA相互作用的鍵合常數(shù)Kb=1.30×105M-1.

圖2 PBSA與DNA相互作用前后的紫外光譜Fig.2 Absorption spectra of PBSA in the absence and presence of CT-DNA

2.2PBSA對(duì)DNA構(gòu)象的影響

DNA分子含有堿基生色團(tuán)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，在260 nm附近有一強(qiáng)的紫外吸收，可以根據(jù)DNA與小分子化合物相互作用前后的紫外吸收光譜的變化研究二者間的相互作用.對(duì)于DNA的吸收光譜來(lái)說(shuō)，如果化合物與DNA作用后導(dǎo)致分子的軸向變化即其構(gòu)象變化，會(huì)產(chǎn)生減色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象；如果DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，則產(chǎn)生增色效應(yīng).由圖3可知，隨著PBSA的加入，DNA在260 nm處的紫外吸收光譜沒(méi)有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明PBSA與DNA相互作用后對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象未產(chǎn)生明顯影響[9].

圖3 DNA與PBSA相互作用前后的紫外光譜Fig.3 Absorption spectra of DNA in the absence and presence of PBSA

2.3DNA對(duì)PBSA的熒光猝滅

熒光猝滅過(guò)程可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅.靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)形成復(fù)合物所引起的一種猝滅過(guò)程，動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)分子之間發(fā)生碰撞失去能量，以無(wú)輻射方式回到基態(tài)的熒光猝滅過(guò)程.PBSA的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為240 nm和339 nm.保持PBSA的濃度為5.0×10-6mol·L-1不變，向其中不斷加入DNA，PBSA的熒光峰發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸減小，但峰位置未發(fā)生變化(圖4)，DNA對(duì)PBSA的熒光產(chǎn)生了明顯的猝滅效應(yīng).

動(dòng)態(tài)熒光猝滅遵循Stern-Volmer方程[10]：

F0/F=1+Kqτ0[ DNA]=1+Ksv[DNA]，

式中Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，Ksv為猝滅常數(shù)，τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命(生物大分子熒光壽命約為10-8s)，F(xiàn)0和F分別為未加入和加入DNA 時(shí)PBSA的熒光強(qiáng)度.根據(jù)Stern-Volmer方程由F0/F-1對(duì)[DNA]作圖，即可求得猝滅速率常數(shù)Kq=5.81×1012L·mol-1·s-1，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，因此，DNA對(duì)PBSA的熒光猝滅是形成了復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅[12]，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與紫外光譜研究結(jié)果相吻合，即DNA與PBSA相互作用形成復(fù)合物，引起了PBSA熒光的猝滅.

圖4 DNA對(duì)PBSA的熒光猝滅Fig.4 Fluorescence change that occurs when PBSA is titrated with DNA

在靜態(tài)猝滅中，靜態(tài)猝滅熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可根據(jù)以下公式推出[11]：log[(F0-F)/F]=logK+nlog[C] ，F(xiàn)0與F分別代表總的和游離態(tài)的PBSA的熒光強(qiáng)度，K為PBSA與猝滅劑DNA之間的結(jié)合常數(shù)，[C]為猝滅劑的平衡濃度，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù).根據(jù)公式以log[(F0-F)/F]對(duì)log[C]作圖(圖5)，可得PBSA與DNA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.11，結(jié)合常數(shù)為1.74×105M-1.

圖5 PBSA與DNA相互作用的log[(F0-F)/F]對(duì)log[C]關(guān)系圖Fig.5 The plot of log[(F0-F)/F] vs log[C] of the interaction between PBSA and DNA

3小結(jié)

采用紫外光譜和熒光光譜研究了紫外線吸收劑PBSA與DNA的相互作用.紫外光譜中：DNA的加入能夠使PBSA的紫外吸收呈現(xiàn)一定的減色效應(yīng)，但沒(méi)有發(fā)生位移，兩者間的相互作用模式可能為靜電作用；而PBSA對(duì)DNA的紫外吸收未產(chǎn)生明顯影響，表明PBSA與DNA相互作用后不會(huì)影響DNA結(jié)構(gòu)的變化.熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中：DNA的加入引起了PBSA熒光的顯著猝滅，其猝滅速率常數(shù)(Kq=5.81×1012L·mol-1·s-1)遠(yuǎn)大于猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)，表明PBSA與DNA的相互作用為靜態(tài)猝滅過(guò)程；PBSA與DNA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.11，結(jié)合常數(shù)為1.74×105M-1.

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Study on the interaction of ultraviolet absorbent PBSA with DNA by spectroscopic method

CHEN Yanmei， YANG Han， WANG Fang， XIONG Xujie， ZHANG Wanju

(Hubei Key Laboratory for Processing and Application of Catalytic Materials，Huanggang Normal University， Huanggang， Hubei 438000)

The interaction of ultraviolet absorbent 2-phenyl benzimidazol-5-sulfonic acid (PBSA) and DNA in physiological condition was investigated by fluorescence spectrometry and UV absorption spectrophotometry. The results showed that PBSA interacted with DNA in an electrostatic interaction mode， which resulted in the hypochromic effect as well as fluorescence quenching of PBSA. The combination reaction of them was a single static quenching process， and the binding site was 1.11．

2-phenyl benzimidazol-5-sulfonic acid (PBSA); DNA-binding; spectroscopic method

2016-12-27.

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016CFB147).

1000-1190(2017)03-0324-04

O626.2

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: wz@hgnu.edu.cn.