王春梅，薛曉鷗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院婦科，北京 100700)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

“滋陰填精”方調(diào)控卵巢癌耐藥的作用及機(jī)理初探

王春梅，薛曉鷗*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院婦科，北京 100700)

目的：通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討“滋陰填精”方對(duì)卵巢癌耐藥的作用并探尋其作用機(jī)理。方法：動(dòng)物模型，分為模型組、順鉑組、中藥+順鉑組，中藥高、低劑量組。按要求分別進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)過程中觀察動(dòng)物的一般狀態(tài);動(dòng)物處死后，處理瘤體標(biāo)本，應(yīng)用HE染色法檢測(cè)各組移植瘤的組織結(jié)構(gòu)，觀察組織結(jié)構(gòu)的變化，IH法檢測(cè)各組瘤體LRP、GST-π的表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，“滋陰填精”方高劑量組、“滋陰填精”順鉑協(xié)同作用組均可顯著下調(diào)LRP的表達(dá)，差異具有顯著性，P<0.01,P<0.05;“滋陰填精”方與順鉑協(xié)同組、“滋陰填精”方高、低劑量組均可明顯下調(diào)GST-π的表達(dá)，與正常組相比，差異顯著，P<0.05。結(jié)論：“滋陰填精”方可降低卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性，其機(jī)制可能與其降低LRP、GST-π的表達(dá)相關(guān)。

滋陰填精法；卵巢癌；化療耐藥

卵巢癌的惡性度及癌相關(guān)死亡率在婦科惡性腫瘤中一直居于首位[1-3]。因起病隱匿，多數(shù)患者直至晚期才能發(fā)現(xiàn)。鉑類與紫杉醇的聯(lián)合化療是一線方案，大部分初治卵巢癌患者對(duì)聯(lián)合化療十分敏感，但50%～80%的患者在初治18～28個(gè)月后復(fù)發(fā)，并逐漸產(chǎn)生耐藥，卵巢癌的5年生存率不到45%。耐藥成為影響卵巢癌化療療效及患者生存率的主要因素之一[4]。因此，尋求一種增強(qiáng)鉑類化療效果或降低鉑類耐藥的方法十分必要。

中醫(yī)學(xué)將卵巢癌歸于“癥瘕”的范疇。認(rèn)為其發(fā)生與氣滯、血瘀、痰濕有關(guān)?；熕帪楣シブ罚m能殺滅腫瘤細(xì)胞，但會(huì)損傷脾胃，耗精傷血。因多次化療后，精血損傷與腫瘤耐藥同時(shí)出現(xiàn)，這種陰精損傷的狀態(tài)可能與腫瘤耐藥密切相關(guān)，因此推測(cè)“滋陰填精”法可能會(huì)調(diào)控卵巢癌耐藥性。本研究基于“滋陰填精”法，探討臨床驗(yàn)方影響卵巢癌鉑類耐藥的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人卵巢癌耐順鉑株SKOV3-DDP及人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3均購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/C裸鼠25只，雌性，4～6月周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)買于SLAC公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)清潔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周，即開始進(jìn)行移植瘤實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及主要實(shí)驗(yàn)試劑

滋陰填精方主要組成部分黃精、麥冬、白芍、白術(shù)購(gòu)買于北京東直門醫(yī)院中藥局；順鉑購(gòu)買于齊魯制藥廠；RPMI-1640培養(yǎng)液：Gib-co公司；胎牛血清：NQBB公司；免疫組織化學(xué)用一抗(GST-pi、LRP)、二抗購(gòu)買于北京中衫金橋公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥性的測(cè)定

培養(yǎng)方法：SKOV3和SKOV3-DDP細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、105U/L青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代一次。耐藥性測(cè)定：將胰酶消化的SKOV3-DDP和SKOV3細(xì)胞以一定濃度制成單細(xì)胞懸液，以每孔103的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)立4個(gè)副孔，培養(yǎng)24 h后，每孔依次加入梯度濃度的順鉑液(0、2.5、5、10、20、40、80、160)，再次培養(yǎng)24h后， MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率，計(jì)算抑制率，證實(shí)SKOV3-DDP細(xì)胞的耐藥性是否滿足實(shí)驗(yàn)的需求。

2.2 滋陰填精方的制備

“滋陰填精”方藥物組成比例：黃精20 g，麥冬15 g，白芍15 g，生白術(shù)15 g，生藥浸泡1 h，水煎2次，第1次40 min，第2次25 min，濾紙過濾去渣，22 μm過濾膜滅菌處理后，配成一定生藥濃度的母液，儲(chǔ)存于-20℃中，待用。

2.3 動(dòng)物模型的建立及分組、給藥

SKOV3-DDP細(xì)胞培養(yǎng)、傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至2×107個(gè)/mL，混勻后每只裸鼠右肩胛區(qū)皮下注射0.2 mL單細(xì)胞懸液。注射后，每日觀察裸鼠一般狀態(tài)如飲食、飲水量，皮毛，大便，每3日測(cè)體質(zhì)量、腫瘤生長(zhǎng)及周圍組織情況，7 d后所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肩胛區(qū)均出現(xiàn)直徑約5～7 mm的皮下結(jié)節(jié)，至此，移植瘤模型建立成功。

將動(dòng)物模型分為5組，每組5只裸鼠，包括：模型組、順鉑組、滋陰填精方協(xié)同順鉑組，滋陰填精方高劑量組，滋陰填精方低劑量組。給藥原則：灌胃的液體體積均相同，腹腔注射的液體體積均相同。給藥方式：模型組：腹腔注射生理鹽水，同時(shí)灌胃生理鹽水；順鉑組：腹腔注射順鉑液，同時(shí)灌胃生理鹽水；滋陰填精方高、低劑量組：腹腔注射生理鹽水，同時(shí)滋陰填精方灌胃；滋陰填精方+順鉑組：滋陰填精方灌胃，同時(shí)腹腔注射順鉑液，連續(xù)14 d。結(jié)束給藥第2天，斷頸處死，完整剝?nèi)×鼋M織。

2.4 觀察指標(biāo)

每日觀察裸鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食量、進(jìn)水量、活動(dòng)力、反應(yīng)力、大便形態(tài)等，瘤體生長(zhǎng)情況，有無感染及破潰等；每3日測(cè)量1次裸鼠體質(zhì)量。

2.5 HE法檢測(cè)瘤組織病理結(jié)構(gòu)的變化

瘤組織經(jīng)福爾馬林液固定、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片后，HE染色，光鏡下觀察各組裸鼠移植瘤病理組織學(xué)變化。

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GST-pi、LRP的表達(dá)

移植瘤組織經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，常溫備用。經(jīng)歷脫蠟、復(fù)水、免疫、染色、蘇木素復(fù)染等過程。觀察GST-pi、LRP在100和400倍鏡下的表達(dá)，并隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，IPWIN6032軟件計(jì)算胞漿內(nèi)染色面積，取平均值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 SKOV3-DDP細(xì)胞的耐藥性

MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，并計(jì)算IC50。結(jié)果顯示：順鉑作用于SKOV3-DDP及SKOV3細(xì)胞24 h后IC50分別為(44.92±1.59) 及(8.95±1.47)μmol/L。計(jì)算后，SKOV3-DDP細(xì)胞的耐藥性為SKOV3細(xì)胞的5倍。耐藥性較強(qiáng)，可應(yīng)用于卵巢癌耐順鉑動(dòng)物模型的建立。

3.2 一般情況

裸鼠成瘤及給藥過程中，各組裸鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，反應(yīng)敏捷，皮膚顏色如常，進(jìn)食、飲水、大小便未見異常，移植瘤組織未見破潰及感染。

3.3 各組瘤組織病理結(jié)構(gòu)變化

見圖1。實(shí)驗(yàn)各組瘤體病理圖片都出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞排列紊亂、不規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞邊界不清、細(xì)胞核較深染、異型性明顯等現(xiàn)象。模型組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞核染色均勻，少見核固縮、核碎裂；用藥組部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯核固縮、核深染，部分細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、核邊際等細(xì)胞凋亡征象，部分細(xì)胞則出現(xiàn)壞死征象。

圖1 HE染色觀察各組移植瘤病理組織變化

3.4 LRP的表達(dá)

見表1、圖2。LRP是一種肺耐藥蛋白，其表達(dá)主要位于細(xì)胞漿或核膜中，免疫組織化學(xué)呈黃褐色染色。圖2示，100倍及400倍顯微鏡下各組裸鼠移植瘤組織中，LRP的表達(dá)情況。表1可見模型組LRP表達(dá)最多，用藥組不同程度減少，與正常組相比，順鉑組+中藥組、順鉑組、中藥高劑量組均具有顯著差異(P<0.05)。

表1 各組裸鼠移植瘤組織LRP表達(dá)的比較

注：與正常組相比，□P<0.01,■P<0.05

3.5 GST-pi的表達(dá)

GST-pi主要存在于胞漿之中，為黃褐色染色。圖3所示為100倍和400倍鏡下GST-pi表達(dá)的差異性。表2所示，模型組GST-pi表達(dá)較強(qiáng)，給藥組均顯示出GST-pi表達(dá)下降。與模型組相比，順鉑+中藥組，中藥的高、低劑量組均顯示出顯著的抑制作用，與正常組相比，均具有顯著性。

表2 各組裸鼠移植瘤組織GST-π表達(dá)的比較

注：與正常組相比，□P<0.01,■P<0.05

4 討論

鉑類耐藥是影響卵巢癌療效及患者死亡率的主要原因之一。順鉑在血漿和細(xì)胞外基質(zhì)中，具有相對(duì)惰性，一旦進(jìn)入細(xì)胞中，具有活性，形成蛋白質(zhì)、DNA、RNA的加合物，是其作用的主要毒性位點(diǎn)。鉑類藥物耐藥機(jī)制復(fù)雜，與DNA修復(fù)異常、細(xì)胞表面藥泵蛋白促使藥物外排、活化細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)、 阻滯凋亡通路的進(jìn)行、腫瘤細(xì)胞微環(huán)境異常、細(xì)胞內(nèi)藥物毒性降低等密切相關(guān)[1-2,4]。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是機(jī)體中催化谷胱甘肽與親電子物質(zhì)發(fā)生結(jié)合的一類酶類，共包含5類，其中以GST-pi與惡性腫瘤關(guān)系最為密切[5]，其基因定位于11q13。研究表明，GST-pi在惡性腫瘤組織中表達(dá)升高顯著，且可能與腫瘤細(xì)胞耐藥導(dǎo)致化療失敗關(guān)系最密切[6-7]。其原因可能包括：GST-pi能催化GSH與化療藥物結(jié)合而解毒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性；GST-pi也可與親脂性藥物結(jié)合增加其水溶性，促進(jìn)外排而降低化療藥物的細(xì)胞毒作用，引起腫瘤細(xì)胞耐藥。 很多研究報(bào)導(dǎo)證實(shí)，在多種耐藥的腫瘤組織中，GST-pi呈陽(yáng)性高表達(dá)[8]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤組織中存在 GST-pi高表達(dá)，而耐藥的乳腺癌細(xì)胞株 GST-pi的表達(dá)量是非耐藥株的5倍[9]。卵巢癌以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療為主要方案，GST-pi陽(yáng)性表達(dá)與鉑類耐藥密切相關(guān)，GST-pi可能成為卵巢癌化療耐藥以及判斷遠(yuǎn)期療效的一個(gè)獨(dú)立有效的指標(biāo)。

肺耐藥蛋白(lung resistance protein, LRP)因首次被發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)而命名，主要分布于胞漿內(nèi)或核膜上。后續(xù)的研究表明，LRP與多種腫瘤的原發(fā)及繼發(fā)性耐藥相關(guān)[10]，主要介導(dǎo)的耐藥為鉑類或烷化劑耐藥，為預(yù)測(cè)化療耐藥及結(jié)局的重要指標(biāo)。LRP作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，化療藥物為攻伐之品，在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，亦對(duì)人體精血損傷，從而出現(xiàn)一系列精血損傷的癥狀，如：面部潮紅、口干、少津、低熱、惡心、嘔吐等。而前期的臨床觀察中我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷化療的病人，大部分會(huì)出現(xiàn)一系列精血損傷的癥狀。所以我們提出：以滋陰填精法調(diào)控卵巢癌耐藥，臨床效果十分顯著。滋陰填精方的君藥為黃精，具有滋補(bǔ)肺、腎之陰，同時(shí)補(bǔ)脾益氣的功能。臣藥為麥冬和白芍，麥冬可補(bǔ)充肺、胃之陰，白芍又可滋補(bǔ)肝陰，二藥同用，既可補(bǔ)充因攻伐之品損傷的陰精，又可助君藥滋陰之力；佐使藥為生白術(shù)，白術(shù)可平補(bǔ)肺、脾、腎三氣，既可健脾益氣，又可緩解攻伐之品對(duì)脾胃之損傷，推動(dòng)藥物在體內(nèi)的運(yùn)化。

中草藥是個(gè)巨大的寶庫(kù)，目前正在研究中的抗腫瘤藥，70%～80%來源于自然產(chǎn)物，而中草藥是其中重要的組成部分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，很多中草藥中的有效成分被證明具有抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，如：大黃酸、青蒿素、何首烏、葡萄籽、靈芝多糖、黃芪甲甙等[11-12]。滋陰填精方中的組成藥物，其有效成為被證明具有一定的抗腫瘤作用。如：黃精中的有效成分黃精皂甙具有顯著的抗腫瘤作用，對(duì)卵巢癌及胃癌的耐藥菌株有明顯的逆轉(zhuǎn)耐藥作用；麥冬中有很多糖苷類物質(zhì)，其中麥冬多糖可顯著提高小鼠的免疫功能，并可顯著增加小鼠脾臟的重量[13-14]。白芍的主要成分為芍藥甙，研究證實(shí)，芍藥甙與腫瘤免疫密切相關(guān)，可以明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的肅清能力，并可增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞的含量，抑制其向M2型表達(dá)[15]。白術(shù)中的有效成分能活化并增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，使巨噬細(xì)胞的吞噬百分率，吞噬指數(shù)及其溶酶體消化平均較對(duì)照組顯著增加。研究表明，白術(shù)有明顯的升白作用，可上調(diào)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，且明顯增高IgG。而以白術(shù)為主的方劑可有效促進(jìn)T細(xì)胞免疫功能，其提取物還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[16-19]。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)“滋陰填精”方的組成藥物從不同角度干預(yù)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及耐藥，在本實(shí)驗(yàn)中，通過體外培養(yǎng)上皮性卵巢癌耐藥細(xì)胞株，成功構(gòu)建卵巢癌耐藥裸鼠移植瘤模型，探討“滋陰填精”方對(duì)其耐藥性的影響及機(jī)理。結(jié)果表明，“滋陰填精法”可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類的耐藥性，其作用機(jī)制可能與下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。

[1] J. Permuth-Wey, T.A.Sellers. Epidemiology of ovarian cancer[J].Methods in Molecular Biology,2009，472:413-437.

[2] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al. Cancer statistics[J].Cancer Journal for Clinicians,2008,58(2):71-96.

[3] 閆珺，趙磊，劉松江.蟲類藥治療卵巢癌的研究概況[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(5):111-113.

[4] Zhi Jiang, Bao-An Chen, Guo-Hua Xia, et al.The reversal effect of magnetic Fe3O4nanoparticales loaded with cisplation on SKOV3/DDP ovarian carcinome cells[J].International Journal of Nanomedicine,2009,4(4):107-114.

[5] Gigante M, Toffoli G, Bertola A. Radiosensitivity in multidrug-resistant and cisplatin resistant human carcinoma cell lines[J].Am J Clin Oncol,2003,26(4):73-79.

[6] RP Perez. Cellular and molecular determinants of cisplatin resistance[J].Eur J Cancer,1998,34(10):1535-1542.

[7] C Meijer, A Timmer, EG De Vries.Role of metallothionein in cisplatin sensitivity of germ cell tumours[J].Int J Cancer,2000,6(85):777-781.

[8] 李國(guó)材，石景森.P-糖蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶在膽囊癌的表達(dá)及臨床意[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011,19(4):727-730.

[9] Batist G, Tuplule A, Sinha B K, et al. Over expression of a novel anionic alutathione transferase in multidrug-resistant human breast cancer cells[J].J Biol Chem,1986,261(33):15544-15549.

[10] 張桂香，劉金萍，李心蘭.MDRl、BCRP和LRP基因在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(1):79-83.

[11] 王華，劉霞．葡萄籽原花青素抗癌活性及其機(jī)制研究進(jìn)展.安徽大學(xué)學(xué)報(bào)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012，4(21):24-27.

[12] 康訊雷，黃新志.大黃素抑制腫瘤細(xì)胞HIF-1克服化療耐藥的機(jī)制涉及活性氧對(duì)SUMO的影響[J].中國(guó)腫瘤學(xué)雜志，2013，5(3)：35-39.

[13] 劉躍亮，羅進(jìn)勇，曾照芳.雙氫青蒿素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B影響的研究[J].激光雜志,2012，4(26):348-350.

[14] Jiang D, ChenY, Hou X. Influence of Paeonialactiflora roots extract on cAMP-phosphor-diesterase activity and related anti-inflammatory action[J].J Ethnopharmacol,2011,137(1):914-920.

[15] 吳勃巖，韓玉英，梁穎，等.龍牙楤木葉總皂苷抗腫瘤作用機(jī)理研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2009，37(1)：175-179.

[16] Wu CR,Jiang X,He ST,et al.Effects of QWBZP on T-cell subsets and their cytokines in intestinal mucosa of HRV infection suckling mice[J].J Ethnopharmacol,2010，131(1):130-134.

[17] 馬艷春,韓宇博,賈曉聰,等.中醫(yī)藥治療腎細(xì)胞癌的現(xiàn)狀分析及展望[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(1):81-83.

[18] 趙曉寧,薛文翰.健脾化瘀方聯(lián)合化療治療晚期胃癌療效及對(duì)生活質(zhì)量的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(3):105-108.

[19] 王寬宇,陳靜,趙可君,等.扶正消巖湯對(duì)EMT-6乳腺癌荷瘤裸鼠免疫功能的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(1):55-57.

2016-07-17

2016-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173293)

王春梅(1982-)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療婦科腫瘤。

*通訊作者：薛曉鷗(1963-)，女，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治婦科腫瘤。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0001-04