秦力維，張寧坤，郭建巍，高 原，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，陳 潔

人臍帶間充質(zhì)干細胞對實驗性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用研究

秦力維，張寧坤，郭建巍，高 原，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，陳 潔

目的 觀察體外培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)對實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)的治療作用。方法 組織塊貼壁法培養(yǎng)HUCMSCs、流式細胞術(shù)鑒定。用視網(wǎng)膜光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)誘導EAU模型。C57BL/6小鼠尾靜脈注射HUCMSCs，每日用裂隙燈顯微鏡對小鼠眼前節(jié)的炎癥情況進行觀察。流式細胞術(shù)檢測實驗小鼠脾臟淋巴細胞CD11c、CD86表型。結(jié)果 建模后的C57BL/6小鼠于注射IRBP后7～9 d開始發(fā)病，12～14 d發(fā)病達高峰，16～20 d眼前節(jié)炎癥自限性減輕，21 d后眼內(nèi)炎癥逐漸消退、自愈。HUCMSCs治療后，建模小鼠EAU發(fā)病時間延長，炎癥程度減輕，實驗組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。建模后的小鼠脾臟CD11c＋CD86－細胞數(shù)量增加非常明顯，經(jīng)HUCMSCs治療后第9天CD11c＋CD86－細胞數(shù)量接近治療前水平。建模后小鼠脾臟中CD86＋CD11c＋/CD11c比值下降，經(jīng)HUCMSCs治療后有所回升，但在第15天時仍未恢復至正常水平。結(jié)論 HUCMSCs對IRBP誘導的小鼠EAU有治療作用，HUCMSCs作用于樹突狀細胞等抗原呈遞細胞，抑制了EAU的進展。

人臍帶間充質(zhì)干細胞；實驗性自身免疫性葡萄膜炎；樹突狀細胞

葡萄膜炎是眼科常見的一種多因素影響的疾病，與感染、外傷、自身免疫、腫瘤等多種因素有關(guān)。其中，自身免疫性的內(nèi)因性葡萄膜炎在臨床上屬于難治性葡萄膜炎，反復發(fā)病可造成視力明顯下降甚至全盲。雖然激素、免疫抑制劑的使用，使葡萄膜炎的治療有了飛躍性的進步，但不良反應的影響，限制了這類藥物的長久、持續(xù)性以及在兒童、老人等特殊人群中的使用。探尋新的治療方法一直是國內(nèi)外眼科界同仁努力的方向。

本研究建立實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠模型，制備人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)[1-2]懸液，對小鼠EAU治療進行，觀察及評價HUCMSCs在EAU治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 6～10周齡雌性健康C57BL/6野生型(wide type，WT)小鼠，海軍總醫(yī)院實驗動物中心[SCXK(京)2011-0006]提供。光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoidbinding protein，IRBP)多肽片段(第1169～1191氨基酸，PTARSVGAADGSSWEGVGVVPDV)由北京中科亞光生物科技有限公司合成。弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)，百日咳毒素(美國Sigma公司)，所用流式抗體均購自美國Becton Dickinson公司。新生兒臍帶取自海軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科(37～40周胎齡剖宮產(chǎn)健康胎兒)。達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM，美國Hyclone公司)，青霉素、鏈霉素(美國Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司)。生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，普通離心機(杭州奧盛儀器有限公司)，恒溫水浴箱(上海森信實驗儀器有限公司)，一次性無菌培養(yǎng)瓶、離心管、移液管、過濾器(美國Gibco公司)。BD FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)，功率15 W，激光光源采用氬離子氣體激光器，波長488 nm，進行藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、甲藻葉綠素蛋白等熒光素的檢測；小功率半導體激光器，波長為635 nm，進行別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)檢測。YZ5G裂隙燈顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑配制 完全DMEM:90 mL DMEM＋20 mL特級FBS，100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。

1.3 方法

1.3.1 HUCMSCs培養(yǎng) 無菌取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶，以平衡鹽溶液洗去臍帶殘留血液，取血管之間血管與外膜之間的膠狀物并剪切成小于1 mm×1 mm×1 mm小塊，把組織塊放置含15%FBS的DMEM，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察組織塊，待組織塊周圍均有貼壁細胞出現(xiàn)時，移出組織塊，當貼壁細胞擴增占80%～90%細胞瓶底面積時，用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸液消化后傳代，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)調(diào)整細胞為2×108/mL，0.01 mol/L PBS洗滌2次后，加入PBS 1 mL重懸細胞，取5× 106個細胞待用。本研究用第3代細胞進行實驗。

1.3.2 HUCMSCs鑒定 取1×106個細胞，加100 μL的細胞表面染色緩沖液，根據(jù)抗體說明書加入相應體積的抗體(小鼠抗人PE、APC或FITC標志的單抗CD105、CD73、CD44、CD90、CD45)和人類白細胞抗原DR位點(human leukocyte antigen-DR，HLADR)，室溫孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS上機檢測。

1.3.3 EAU模型的建立及HUCMSCs治療EAU的臨床評價 6～10周齡雌性健康C57BL/6 WT小鼠60只，隨機數(shù)字法分為3組，其中模型對照組20只、共40只眼，HUCMSCs治療組、空白對照組各20只、共80只眼。所有動物均足墊及頸部皮下注射500 μg的IRBP＋0.8 μg百日咳毒素＋等量的弗氏完全佐劑＋卡介苗0.4 μg共600 μL誘導EAU模型(雙眼均造模)。造模的同時，模型對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL，HUCMSCs治療組尾靜脈注射HUCMSCs 0.1 mL(細胞5×106/mL)。隨機選10只小鼠于造模前及造模治療后每天用裂隙燈顯微鏡觀察小鼠眼前節(jié)的眼部炎癥情況，并進行半定量評分[1]。0分:無炎癥反應；1分:虹膜充血和輕度的視網(wǎng)膜血管炎；2分:前房輕度纖維組織滲出；3分:前房明顯滲出和輕度積膿；4分:前房重度積膿和出血。發(fā)現(xiàn)有角膜白斑、有晶狀體混濁的不入組。眼前、后節(jié)檢查均正常的入組。

1.3.4 脾細胞懸液制備 分別于造模后第9、15天處死各組小鼠，取脾臟，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗滌2次，去除脂肪組織，研磨，用200目的尼龍網(wǎng)過濾制備脾細胞懸液，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加PBS至10 mL，1 500 r/min離心5 min，洗滌2次，取1×106個細胞待用。

1.3.5 脾臟淋巴細胞表面蛋白標志 加100 μL的細胞表面染色緩沖液，根據(jù)抗體說明書加入相應體積的抗體，室溫孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS上機檢測。分別在建模及治療后的第9、15天用流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)特異性標志CD11c和共刺激分子CD86表達及CD86＋CD11c＋/ CD11c比值變化情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0軟件，計數(shù)資料以百分比表示，各組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HUCMSCs的培養(yǎng)及生長情況 原代細胞培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)少量散在的單個貼壁細胞，形態(tài)呈紡錘形、纖維形，之后細胞逐漸增生，至第7、8天成為形態(tài)相對穩(wěn)定的成纖維長梭形細胞，螺旋狀或漩渦狀排列生長(圖1)。

圖1 倒置差顯微鏡下的HUCMSCs(×400)

2.2 HUCMSCs免疫表型的鑒定 流式細胞術(shù)可見HUCMSCs符合髓系干細胞的特征。CD105/CD44和CD73/CD90高表達(圖2)，CD34、CD45和HLADR基本不表達(圖3)。

2.3 EAU模型臨床表現(xiàn) 造模后第7～9天開始發(fā)病，可見虹膜血管擴張、充血，前房內(nèi)有少量滲出。造模后14 d，病變達高峰，瞼裂區(qū)大量白色黏稠分泌物，角膜輕度水腫，虹膜表面血管擴張、充血，前房纖維素樣滲出增多，瞳孔區(qū)虹膜后粘連(圖4A)；散瞳后觀察前房混濁，有大量纖維素樣滲出物覆蓋于晶狀體表面，前部玻璃體絮狀混濁(圖4B)。造模后16～20 d眼前節(jié)炎癥減輕，21 d后眼內(nèi)炎癥逐漸消退、自愈。

圖2 CD105/CD44和CD73/CD90分子表達

圖3 CD34、CD45和HLA-DR熒光直方圖

圖4 EAU模型的裂隙燈觀察

2.4 HUCMSCs對小鼠EAU的治療 HUCNSCs治療組與模型對照組相比，發(fā)病時間延長，炎癥程度減輕。EAU臨床評分見表1。

2.5 HUCMSCs治療后脾臟淋巴細胞CD11c＋CD86－表達 建模后小鼠脾臟CD11c＋CD86－細胞數(shù)量增加，經(jīng)HUCMSCs治療后數(shù)量下降(圖5)，治療后第

9天CD11c＋CD86－細胞數(shù)量接近治療前水平(圖6)。EAU建模后小鼠脾臟CD86＋CD11c＋/CD11c比值下降即成熟DCs百分比下降，經(jīng)HUCMSCs治療后有所回升，但在第15天時仍未恢復至正常水平(圖7)。

表1 小鼠EAU的臨床評分(分)

圖5 HUCMSCs治療后小鼠脾臟CD11c＋CD86－細胞數(shù)量

圖6 HUCMSCs治療后第9天小鼠脾臟CD11c＋CD86－細胞數(shù)量

圖7 HUCMSCs治療后小鼠脾臟CD86＋CD11c＋/CD11c比值

3 討論

葡萄膜炎主要是指發(fā)生在葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管及玻璃體的一類炎癥性疾病，反復發(fā)作可造成視力明顯下降，嚴重時可導致失明，致盲率為2.8%～ 10.0%[3]。因病因復雜，目前對其確切的發(fā)病機制尚不完全清楚。EAU是研究人類葡萄膜炎理想的動物模型[4]，對揭示眼部炎癥機制的研究起到非常重要的作用[5]。IRBP是視網(wǎng)膜表達的在EAU建模中應用最廣泛的抗原，在體內(nèi)具有免疫赦免的特性[6]。當某種條件下IRBP暴露，體內(nèi)就會產(chǎn)生針對IRBP的免疫細胞，攻擊視網(wǎng)膜的IRBP表達細胞，從而引發(fā)葡萄膜炎。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于胚胎中胚層的一類成體干細胞，具有向多胚層細胞分化、向組織損傷部位定向遷移并促進損傷修復、免疫抑制、抗炎及神經(jīng)營養(yǎng)等功能[7]。MSCs免疫原性極低，性能穩(wěn)定，易于獲得和擴增，同時允許同源和異源的移植[8]，已成功應用于自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、神經(jīng)損傷以及骨關(guān)節(jié)再生的治療。由于MSCs不良反應少，可加強機體抗感染和神經(jīng)營養(yǎng)作用，比傳統(tǒng)的激素和免疫抑制劑有更多的優(yōu)點，因此對難治性葡萄膜炎具有更大的潛在價值。

在前期的研究中，將體外培養(yǎng)的HUCMSCs注入小鼠體內(nèi)，注入后觀察到小鼠體內(nèi)外周血細胞及免疫細胞的表型均沒有明顯的變化[2]，為后期進行異體干細胞的安全治療提供了實踐依據(jù)。

MSCs用于治療視網(wǎng)膜疾病有2種移植方法，即靜脈注射和局部注射。靜脈注射的優(yōu)勢更為明顯，它可以使MSCs通過血液循環(huán)到達整個視網(wǎng)膜，作用范圍廣，而且可重復注射[9-10]。本研究在建模的同時開始HUCMSCs干預治療，采用尾靜脈注射的方法，向小鼠體內(nèi)注入HUCMSCs，觀察HUCMSCs對EAU的治療作用；通過對小鼠眼前節(jié)炎癥的觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠EAU模型多在免疫后第7～9天開始發(fā)病，第12～14天達高峰，第16～20天病情緩解，21 d后炎癥基本趨于消退。HUCMSCs治療后小鼠EAU在發(fā)病時間、炎癥程度上HUCMSCs治療組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，具體表現(xiàn)為發(fā)病時間延長、炎癥程度減輕。

DCs為體內(nèi)功能最強的抗原呈遞細胞。在EAU患者，研究發(fā)現(xiàn)DCs位于正常的脈絡膜組織中，有一部分DCs在脈絡膜視網(wǎng)膜的交界處，并與視網(wǎng)膜色素上皮接近，提示這些DCs與EAU肉芽腫的發(fā)生密切相關(guān)[11]；相當數(shù)量的DCs和單核巨噬細胞還滲入到脈絡膜組織中。如何從DCs入手實現(xiàn)EAU的免疫治療一直是關(guān)注和研究的熱點[12-13]。本研究對治療后小鼠脾臟DCs免疫表型進行分析，分別在建模后及治療后的第9、15天用流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟DCs特異性標志CD11c和其表面共刺激分子CD86表達情況，結(jié)果表明EAU發(fā)病后脾臟非成熟的DCs(CD11c＋CD86－)數(shù)量顯著增加；經(jīng)HUCMSCs治療后脾臟非成熟DCs數(shù)量開始下降，到第15天時基本接近治療前水平；同時，EAU建模后小鼠成熟DCs百分比下降，經(jīng)HUCMSCs治療后有所回升，但在第15天時仍未恢復至正常水平。

免疫學理論認為，未成熟DCs在攝取抗原后成為成熟DCs，成熟DCs可激活T細胞，并通過產(chǎn)生不同的細胞因子誘導初始輔助性T細胞(helper T cell，Th)向不同的Th亞群分化。EAU建模后脾臟中非成熟DCs數(shù)量增多，意味著EAU發(fā)病進程中，為了抑制自身免疫應答產(chǎn)生的免疫效應分子對機體的損傷，繼續(xù)維持自身免疫系統(tǒng)的平衡，產(chǎn)生了大量未成熟DCs。未成熟DCs在攝取抗原前具有顯著的免疫抑制功能，這些DCs表達低水平共刺激分子CD80和CD86，誘導T細胞耐受，避免免疫應答的持續(xù)進行。經(jīng)HUCMSCs治療后，非成熟DCs數(shù)量開始下降，治療后第9天基本接近治療前水平，維持了體內(nèi)成熟DCs與非成熟DCs之間的平衡。

有學者將MSCs用于EAU的治療，可抑制T細胞增殖、Th1和Th17細胞因子分泌，增強Th2細胞因子分泌，上調(diào)CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞，顯著改善EAU臨床癥狀，減輕其病理表現(xiàn)[14]。本研究結(jié)果提示，HUCMSCs對EAU治療發(fā)揮作用的方式之一可能是作用于DCs等抗原呈遞細胞，抑制了EAU的進展。能否在EAU發(fā)病初期就讓HUCMSCs直接作用于DCs，通過調(diào)控免疫微環(huán)境而阻斷DCs等抗原呈遞細胞的功能[15-16]，發(fā)揮HUCMSCs在EAU治療中的最大潛能將是下一步要做的工作。

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Study of human umbilical cord mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune uveitis

QIN Liwei1，ZHANG Ningkun2，GUO Jianwei3，GAO Yuan1，WANG Guiqin1，CAO Liqun1，TIAN Chunyu1，CUI Bei1，WANG Jing1，CHEN Jie1
(1.Department of Ophthalmology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Department of Cardiology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；3.Department of Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective To explore an effective treatment schedules of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUCMSCs)for experimental autoimmune uveitis(EAU)in C57BL/6 mice.Methods HUCMSCs were obtained by culturing cesarean section tissues from fetal umbilical cord in vitro by tissues adherent methods.HUCMSCs were identified by flow cytometry.EAU model of C57BL/6 mice were established by using interphotoreceptor retinoid-binding protein(IRBP). HUCMSCs were injected intravenous in C57BL/6 mice.Examine anterior asgment inflammation and hyphema by slit lamp microscope.The expression of CD11c and CD86 molecular of spleen lymphocytes were analyzed by flow cytometry.Results During the course of IRBP induced EAU in C57BL/ 6 mice，inflammatory reactions began at 7 to 9 days，peaked at 12 to 14 days and self relieved at 16 to 20 days.The intraocular inflammation disappeared entirely and spontaneous healed after 21 days. The onset time were prolonged and the inflammatory reaction were alleviated in IRBP induced EAU C57BL/6 mice，which had statistical significance(P＜0.05).The amounts of CD11c＋CD86－cells increased obviously in EAU mice and recovered at 9 days after administrated with HUCMSCs.The ratio of CD86＋CD11c＋/CD11c decreased in EAU mice and recovered gradually after administrated with HUCMSCs but still not to normal levels at 15 days.Conclusion The treatment method of HUCMSCswas effective for IRBP induced EAU in C57BL/6 mice.The data of CD11c＋CD86－cells from flow cytometry supported previous suggestions that HUCMSCs inhibit actions of dendritic cells substantially ameliorate the progression of EAU.

Human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUCMSCs)；Experimental autoimmune uveitis(EAU)；Dendritic cells(DCs)

R773

A

2095-3097(2017)03-0142-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.004

2016-12-06 本文編輯:張在文)

國家自然科學基金面上項目(30872394)；北京市自然科學基金資助項目(面上項目)(7162188)；海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金(CXPY201312)

100048北京，海軍總醫(yī)院眼科(秦力維，高 原，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，陳 潔)，心血管內(nèi)科(張寧坤)，檢驗科(郭建巍)

郭建巍，E-mail:jwkuo＠sina.com

[注 明]秦力維，張寧坤:并列第一作者