唐飛龍，欒 佐，吳南海，唐湘鳳，盧 偉，井遠方

·干細胞·

臍帶間充質(zhì)干細胞治療兒童移植相關并發(fā)癥的療效觀察

唐飛龍，欒 佐，吳南海，唐湘鳳，盧 偉，井遠方

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)治療異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后兒童急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)和出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis，HC)的療效及安全性。方法 Allo-HSCT后發(fā)生aGVHD 15例(合并HC 5例)，難治性aGVHD的13例(合并HC 5例)對一線免疫抑制劑及CD25單抗治療無效，聯(lián)合靜脈滴注UCMSCs治療。UCMSCs的平均使用劑量為3.6(1.3～6.0)×106/kg，平均使用次數(shù)為5(2～21)次，中位隨訪時間47(36～73)個月。然后觀察aGVHD和HC的恢復、再發(fā)情況及UCMSCs治療相關不良反應。結果 13例聯(lián)合UCMSCs治療后8例獲得完全緩解、5例獲得部分緩解；5例HC患兒經(jīng)水化、堿化治療后效果欠佳，聯(lián)合靜脈滴注UCMSCs治療后有效。未觀察到UCMSCs治療相關不良反應。結論 Allo-HSCT后聯(lián)合UCMSCs治療兒童aGVHD和HC安全有效。

臍帶間充質(zhì)干細胞；急性移植物抗宿主病；出血性膀胱炎；造血干細胞移植

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)已成為惡性、難治性血液系統(tǒng)疾病及遺傳代謝病有效的治療方法之一。但移植相關并發(fā)癥，尤其是急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)和出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis，HC)仍然是影響移植成功率及患者長期生存率的主要因素?，F(xiàn)階段針對aGVHD的常規(guī)治療包括糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑療效有限，僅對部分患者有效。HC缺乏針對性的預防和治療措施，主要以水化、堿化、利尿、膀胱沖洗及藥物灌注為主，難治性HC可借助外科干預[1]，但療效均不甚理想。臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)因具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)及組織修復作用[2]，在aGVHD和HC治療上取得了令人振奮的療效，為aGVHD和HC的治療提供了一種新的有效方法。海軍總醫(yī)院兒科于2010年4月—2013年5月15例行allo-HSCT后發(fā)生難治性aGVHD 13例(合并HC 5例)，在常規(guī)治療的基礎上聯(lián)合運用UCMSCs靜脈滴注，取得較好療效。

1 資料與方法

1.1 病例資料 2010年4月—2013年5月在海軍總醫(yī)院行allo-HSCT的血液病及遺傳代謝病患兒15例，男性9例、女性6例；其中，急性淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)2例，急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)5例，骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS) 3例，再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)3例，幼年型粒單核細胞(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)1例，腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(adrenoleukodystrophy，ALD)1例。15例一般情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 骨髓移植 15例中，血緣造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)13例；非血緣臍血移植(umbilical cord blood transplantation，UCBT)2例，其中病例12為單份UCBT、病例15為雙份UCBT。人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型不全相合者11例，除2例行UCBT外，余9例為血緣骨髓造血干細胞＋外周血干細胞移植(peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT)；HLA配型全相合者4例，病例2行血緣骨髓造血干細胞＋PBSCT，余3例為血緣PBSCT移植。骨髓造血干細胞/PBSCT單個核細胞中位數(shù)為19.04(5.20～30.00)×108/kg，CD34＋細胞的中位數(shù)為5.14(2.69～14.46)×106/kg。UCBT單個核細胞中位數(shù)為2.74 (1.16～4.32)×108/kg，CD34＋細胞的中位數(shù)為1.82 (0.87～2.76)×106/kg。見表1。

1.2.2 預處理方案 15例中，13例采用清髓性預處理，其中11例選用白消安/環(huán)磷酰胺(busulfan/ cytoxan，BU/CTX)為基礎的預處理方案、2例ALL采用CTX/全身照射(total body irradiation，TBI)為基礎的預處理方案；余2例采用非清髓預處理，其中1例采用氟達拉濱(fludarabine/cytoxan，F(xiàn)LU)/CTX預處理方案、1例選用抗胸腺球蛋白(antithymocytic globulin/cytoxan，ATG)/CTX為主的預處理方案。15例具體預處理方案見表1。

1.2.3 并發(fā)癥及其預防

1.2.3.1 aGVHD 除3例HLA全相合白血病移植患兒選用環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)＋短程甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)方案預防aGVHD、2例UCBT患兒采用CsA＋麥考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)＋甲潑尼龍(methylprednisolone，MP)外，余10例均采用CsA＋短程MTX＋MMF方案預防。CsA 1.5～4 mg/(kg· d)，24 h靜脈滴注，CsA血質(zhì)量濃度維持在200～400 ng/mL，腸道恢復正常改為口服。MTX 15 mg/m2、10 mg/m2、10 mg/m2、10 mg/m2分別于移植后＋1、＋3、＋5、＋11 d應用。MMF 25 mg/(kg·d)，分2次口服，移植后＋1～＋30 d。按照aGVHD診斷標準[3]，15例在行allo-HSCT后均發(fā)生aGVHD，發(fā)生程度不等的皮膚型aGVHD 15例中，合并10例胃腸道型aGVHD、5例肝臟型aGVHD；aGVHD出現(xiàn)的平均時間為40(＋19～＋65)d；接受激素聯(lián)合免疫抑制劑MP 1～2 mg/(kg· d)、他克莫司(tacrolimus，TM)0.03～0.05 mg/(kg· d)及CD25單抗1 mg/(kg·d)治療后，患兒病情繼續(xù)進展的加用UCMSCs治療。見表1。

1.2.3.2 HC 所有移植患兒均給予充分水化、堿化等措施預防HC，預處理期間使用CTX患兒則在靜脈滴注的同時和靜脈滴注后3、6、9 h給予美司鈉解救，總劑量為CTX的200%。15例發(fā)生aGVHD患兒合并Ⅲ～Ⅳ度HC 5例，出現(xiàn)的中位時間為27(－2～＋43)d，經(jīng)水化、堿化尿液2周癥狀不緩解或加重后給予UCMSCs治療(表1)。

1.2.4 UCMSCs制備、輸注及療效判斷

1.2.4.1 UCMSCs制備 UCMSCs由海軍總醫(yī)院兒科實驗室(符合生物治療要求的良好作業(yè)規(guī)范標準)制備，已通過相關倫理委員會批準，且獲臍帶捐獻者家屬同意，患兒治療前其家屬均簽署UCMSCs治療同意書。制備具體步驟:①用75%乙醇浸泡足月健康產(chǎn)新生兒臍帶組織30 s，無菌磷酸鹽緩沖溶液沖洗后將臍帶組織剪切至約1 cm×1 cm×1 cm大小并移至離心管中，經(jīng)0.2%Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)37℃消化13～15 h；②再用含10%胎牛血清的達伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(美國Gibco公司)洗滌細胞，1 600 r/min離心(離心半徑13.5 cm)5 min后加入適量生長培養(yǎng)基重懸細胞，按2.0×104/cm2接種于培養(yǎng)瓶，置于含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱(MCO-20AIC，日本SANYO公司)中培養(yǎng)；③待細胞貼壁生長至80%匯合后，以0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸消化液(美國Gibco公司)消化，進行傳代培養(yǎng)，收集3代細胞；④利用流式細胞儀(FACSCalibur，美國Becton-Dickimson公司)鑒定顯示UCMSCs高表達CD13、CD29、CD44、CD90、CD105，低表達CD34、CD45和HLA-DR；⑤第3代經(jīng)鑒定的UCMSCs用于臨床研究，且使用前需行細胞培養(yǎng)液污染、胎牛血清殘留量、內(nèi)毒素、支原體等相關檢測及細胞活性鑒定。1.2.4.2 UCMSCs使用 參考文獻[4-5]，靜脈滴注UCMSCs平均細胞數(shù)為3.6(1.3～6.0)×106/kg，平均次數(shù)為5(2～21)次，每周1次；使用前給予異丙嗪預防過敏，靜脈滴注時間＞1 h，使用后1周內(nèi)觀察療效、不良反應及血常規(guī)、生化檢驗結果。

1.2.5 療效評估與觀察

1.2.5.1 aGVHD療效評估 完全緩解(complete remission，CR):aGVHD癥狀完全消失(包括皮疹消退，膽紅素正常，無aGVHD所致腹瀉發(fā)生)；部分緩解(partial remission，PR):至少1個臟器減少至少1個級別；進展:臟器均無改善，甚至進展[6]。

1.2.5.2 HC療效觀察 每日檢查尿常規(guī)，記錄體溫、癥狀、體征、尿色、尿量以及尿路刺激癥狀、肉眼血尿、鏡下血尿消失時間。

隨訪時間到2016年5月。

2 結果

2.1 aGVHD 15例allo-HSCT發(fā)生aGVHD患兒在一線免疫抑制劑及CD25單抗治療的基礎上，病例5、6 aGVHD患兒達CR；13例難治性aGVHD患兒癥狀均無明顯改善，予以次數(shù)不等的UCMSCs靜脈滴注治療，其中8例CR、5例達PR，總有效率(CR＋PR)為100%。其中13例皮膚型aGVHD患兒在UCMSCs靜脈滴注后均達到CR，改善中位時間為靜脈滴注后22(8～32)d；5例肝臟型aGVHD患兒中，病例4、8經(jīng)UCMSCs治療后PR，余3例達CR，緩解中位時間為靜脈滴注后3(12～46)d；10例胃腸道型aGVHD患兒中，病例1、11、14(均為重度aGVHD)經(jīng)UCMSCs治療后達PR，余7例達CR，緩解中位時間為靜脈滴注后39(11～59)d。見表2。

2.2 HC 5例HC患兒在靜脈滴注次數(shù)不等UCMSCs后均達不同程度緩解(表2)。UCMSCs使用平均次數(shù)為4(3～7)次，尿路刺激癥狀消失中位時間為治療后15(8～30)d，肉眼血尿消失中位時間為治療后28(12～49)d，鏡下血尿消失中位時間為治療后36 (15～54)d。

2.3 隨訪 截至2016年5月，隨訪中位時間47 (36～73)個月，3例死亡；其中，病例1移植后＋102 d死于嚴重肺部真菌感染，病例8移植后約10個月死于慢性移植物抗宿主病合并肺部感染，病例11于移植后5個月死于巨細胞病毒間質(zhì)性肺炎。病例14失訪；余11例均存活，隨訪期內(nèi)存活患兒未出現(xiàn)aGVHD及HC復發(fā)，且均未出現(xiàn)UCMSCs治療相關不良反應(表2)。

表2 15例治療情況及轉歸

3 討論

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，可來源于骨髓、脂肪、臍帶等不同組織，且在不同培養(yǎng)條件下可向肌腱、神經(jīng)、脂肪、肌肉、骨骼、軟骨細胞等組織細胞分化，具有低免疫原性、支持造血、免疫調(diào)控、促進植入和組織修復等特點。本研究使用的UCMSCs與脂肪、骨髓來源的MSCs相比，具有增殖能力更強、免疫原性更低、取材方便、無倫理限制等特點，是MSCs臨床應用更為理想的種子細胞。Bartholomew等[7]早期進行狒狒同種異體皮膚移植后就發(fā)現(xiàn)MSCs輸注可顯著推遲皮膚排異時間。此外，體外實驗也顯示，當組織器官有炎癥或者損傷時，MSCs會迅速歸巢到炎癥或損傷部位發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及組織修復作用[8]。目前MSCs已成功應用于allo-HSCT后嚴重并發(fā)癥如aGVHD、HC的治療。

MSCs治療aGVHD的具體作用機制尚未完全闡明，一般認為MSCs對T淋巴細胞激活和增殖具有非選擇性和劑量依賴性抑制作用，這一抑制作用得益于MSCs分泌的可溶性細胞因子，如前列腺素E2、轉化生長因子-β、吲哚胺2，3-雙加氧酶、肝細胞生長因子等[9]。MSCs還可以通過誘導CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞被證實可誘導免疫耐受及抑制炎癥反應[10-11]。此外，MSCs可減少輔助性T細胞1(helper T cell 1，Th1)、Th17炎癥因子的釋放，增加抗炎作用的Th2細胞因子的分泌[12]，在抗炎、預防aGVHD發(fā)生或減輕其嚴重程度的同時，且不削弱移植物抗白血病作用[13]。

aGVHD是allo-HSCT后最主要并發(fā)癥，也是直接影響患者預后及allo-HSCT成功與否的關鍵。2004年Le Blanc等[14]首次報道MSCs對常規(guī)治療無效的aGVHD治療有效以來，越來越多的臨床研究結果顯示MSCs對于allo-HSCT后重度移植物抗宿主病有預防及治療作用[4，14]。Chen等[15]用UCMSCs治療19例激素耐藥型aGVHD患兒，11例均CR、4例PR、4例無效。喬淑敏等[4]報道UCMSCs成功治療5例重度aGVHD兒童，所有患兒經(jīng)UCMSCs治療后均達不同程度的緩解，且治療過程中未出現(xiàn)UCMSCs治療相關不良反應。本研究15例aGVHD患兒中，13例對一線免疫抑制劑和CD25單抗治療無效，經(jīng)UCMSCs靜脈滴注治療后均達不同程度緩解，與國外報道基本一致[14]。本研究13例難治性皮膚型aGVHD患兒經(jīng)UCMSCs治療后均可達到CR，且較胃腸道型aGVHD及肝臟型aGVHD改善時間要短。除與aGVHD程度及個體差異有關外，是否能說明UCMSCs對治療皮膚型aGVHD要優(yōu)于肝臟型、胃腸道型aGVHD尚需要更大樣本和更深入的臨床研究。

HC是HSCT后主要并發(fā)癥之一，HSCT后180 d HC發(fā)生率為7%～70%[16]。大多數(shù)研究認為其發(fā)生多與血小板減少、預處理藥物毒性、全身大劑量放療、病毒感染、移植物抗宿主病及免疫紊亂等因素有關[17-18]。各種因素均可造成尿道黏膜上皮細胞損傷，加之移植后抗排異藥物的使用使骨髓受到抑制、血小板計數(shù)低下，最終患者膀胱順應性降低，出現(xiàn)血尿、尿頻、尿急及排尿困難等癥狀。Ringden等[5]用MSCs治療成人7例allo-HSCT后發(fā)生Ⅱ～Ⅳ度HC，靜脈滴注中位細胞數(shù)為1.0(0.7～2.0)×106/kg MSCs后，5例癥狀得到控制。本研究5例HC患兒經(jīng)靜脈滴注UCMSCs后癥狀均可不同程度緩解，有效率達100%，優(yōu)于國外文獻報道[5]。原因:①本研究所用UCMSCs取自正常足月產(chǎn)胎兒臍帶，較文獻報道骨髓源性MSCs具有更強的增殖及組織修復能力[19]；②本研究5例靜脈滴注的UCMSCs中位細胞數(shù)(3.0×106/kg)高于文獻報道(1.0×106/kg)[5]。但UCMSCs治療HC效果是否呈劑量依賴性，目前尚缺乏對照研究，相信隨著UCMSCs治療HC理論基礎及臨床研究的深入、大樣本對照研究的開展定會給予解答。

本研究15例行allo-HSCT后發(fā)生難治性aGVHD 13例(合并HC 5例)，經(jīng)UCMSCs治療后均達不同程度緩解，且靜脈滴注后無任何不良反應。UCMSCs為HSCT后發(fā)生重度aGVHD和HC并發(fā)癥患兒提供了一種新的安全有效的治療手段，但如何優(yōu)化UCMSCs靜脈滴注劑量、時機、途徑與療程亟待進一步研究。相信隨著UCMSCs免疫調(diào)節(jié)機制研究的不斷深入及臨床研究的不斷推進，UCMSCs的臨床應用也將有更為廣闊的前景。

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Therapeutic effect of umbilical cord-mesenchymal stem cell on transplantation-related complications in children

TANG Feilong1，LUAN Zuo1，2，WU Nanhai2，TANG Xiangfeng2，LU Wei2，JING Yuanfang2
(1.Postgraduate School，Anhui Medical University，Hefei Anhui 230032，China；2.Department of Pediatrics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective To evaluate the efficacy and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells(UCMSCs)in children with acute graft versus host disease(aGVHD)and hemorrhagic cystitis(HC)after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT).Methods A total of 15 pediatric patients with refractory aGVHD or HC after allo-HSCT.Thirteen pediatric patients with aGVHD include 5 cases of HC with first-line immunosuppressor and CD25 monoclonal antibody. After failure treatment we gave combined intravenous infusion with UCMSCs.The mean dose of UCMSCs was 3.6×106/kg[range(1.3—6.0)×106/kg]cells per kg bodyweight and the mean therapeutic times were 5(range 2—21).Then we observed the recovery，recurrence of aGVHD and HC and adverse reactions for 47 months(range 36—73).Results Thirteen cases after combined treatment with UCMSCs administration，and 8 patients had a complete response and 5 patients had a partial response.With a poor outcome after hydration and alkalization in 5 cases HC patients，symptoms disappeared after combined intravenous infusion with UCMSCs.No patients had obvious side effect after infusion with UCMSCs.Conclusion UCMSCs are safe and effective for the combined treatment in children with aGVHD or HC after allo-HSCT.

Umbilical cord mesenchymal stem cells(UCMSCs)；Acute graft versus host disease(aGVHD)；Hemorrhagic cystitis(HC)；Hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)

R726

B

2095-3097(2017)03-0132-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.002

2017-01-16 本文編輯:徐海琴)

國家自然科學基金青年科學基金項目(81601055)

230032安徽合肥，安徽醫(yī)科大學研究生學院(唐飛龍，欒 佐)；100048北京，海軍總醫(yī)院兒科(欒 佐，吳南海，唐湘鳳，盧 偉，井遠方)

欒 佐，E-mail:luanzuo＠yahoo.com