姚 立，彭 濤，李 姣，劉立志，邢文華，賈杏林，袁安文，劉 磊

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128)

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圍產(chǎn)期山羊肝臟穿刺采樣對血常規(guī)和肝功能的影響

姚 立，彭 濤，李 姣，劉立志，邢文華，賈杏林，袁安文，劉 磊*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128)

圍產(chǎn)期是反芻動物普通病及傳染病高發(fā)時期，其最顯著的病理特征是能量負(fù)平衡。肝臟是能量代謝最重要的器官，肝臟樣品的采集在圍產(chǎn)期疾病診斷及發(fā)病機制研究方面尤為重要。用圍產(chǎn)期山羊作為試驗動物，采用穿刺活檢技術(shù)進行肝臟樣本采集。標(biāo)準(zhǔn)穿刺活檢操作對9頭圍產(chǎn)期山羊進行70次穿刺取樣，結(jié)果顯示，肝臟采出率為100%，死亡率為0，流產(chǎn)率為0；血常規(guī)檢查及肝功能檢測顯示血液學(xué)指標(biāo)及轉(zhuǎn)氨酶無明顯異常。說明此法安全可靠，可用于山羊肝臟的活檢取樣。

穿刺；活檢；圍產(chǎn)期；山羊；肝臟

圍產(chǎn)期一般指產(chǎn)前21 d至產(chǎn)后21 d這段時間[1-2]。圍產(chǎn)期母畜由于分娩和啟動泌乳對能量需求增加,但干物質(zhì)采食量反而下降，由此導(dǎo)致了能量負(fù)平衡[1,3]。能量負(fù)平衡被證實是許多圍產(chǎn)期疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)。在此情況下，脂肪組織發(fā)生劇烈脂肪動員，血液非酯化脂肪酸(NEFA)含量升高。肝臟是能量代謝的主要器官，大量脂肪酸流涌入肝臟，極易引發(fā)脂肪肝和酮病等能量代謝紊亂疾病。圍產(chǎn)期疾病發(fā)病率居高不下，據(jù)統(tǒng)計，約30%～50%奶牛受圍產(chǎn)期疾病侵?jǐn)_[4]；圍產(chǎn)期疾病還會導(dǎo)致巨大經(jīng)濟損失，不但會引起患病動物生產(chǎn)性能下降甚至死亡，而且會增加飼養(yǎng)成本及治療費用，據(jù)估算，僅一頭奶牛因患酮病造成損失即達151～312美元[1,5]。正因為圍產(chǎn)期疾病發(fā)病率高、危害大，圍產(chǎn)期疾病的防控成為世界各國研究的熱點。

活檢穿刺是在獸醫(yī)臨床有著廣泛的應(yīng)用的樣本采集方法，常見的穿刺部位包括胸腔、腹腔、心包、瘤胃及瓣胃以及肝臟等。通過穿刺，可以取得動物體腔內(nèi)液、病理產(chǎn)物及活組織，對這些病料進行檢測可達到診斷目的。肝臟是動物機體物質(zhì)代謝最重要的器官，肝活檢穿刺是彌漫性肝病變組織學(xué)診斷中極為重要的一環(huán)[6]。穿刺采樣獲得的肝組織樣本可為診斷和治療肝臟疾病，評價疾病嚴(yán)重性及判斷預(yù)后提供關(guān)鍵信息。有研究評估了106例犬腹腔鏡引導(dǎo)的肝活檢穿刺的并發(fā)癥以及病例康復(fù)的情況，結(jié)果顯示，該法樣品采出率以及合格率均為100%，101例術(shù)后存活，5例由于肝臟疾病惡化以及預(yù)后不良而施行安樂死，表明肝活檢是一種有效的低并發(fā)癥的微創(chuàng)技術(shù)，能安全運用于犬凝血障礙性疾病以及晚期肝病的檢查[7]。盡管肝活檢穿刺在伴侶動物臨床得到了廣泛應(yīng)用，但反芻動物，特別是圍產(chǎn)期反芻動物的穿刺活檢，報道較少，本文對圍產(chǎn)期山羊進行肝臟穿刺采樣，就穿刺對動物血常規(guī)和肝功能的影響進行觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 湖南寧鄉(xiāng)縣覃英養(yǎng)殖場9只圍產(chǎn)期黑山羊，整體狀態(tài)觀察及一般檢查無異常。

1.1.2 材料 Mindray DP30便攜性獸用B超儀；一次性使用16G半自動活檢槍，江蘇華星醫(yī)療器械有限公司；科德士CP6800電推剪；頭孢噻呋鈉，湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司；酚磺乙胺，中農(nóng)康畜動物藥業(yè)公司；Mindray BC-2800血球分析儀；Mindray BS-180全自動生化分析儀；堿性磷酸酶(ALKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前檢查 穿刺活檢前對山羊進行超聲檢查，觀察肝區(qū)大小以及胎兒發(fā)育情況，根據(jù)超聲檢查結(jié)果確定肝臟解剖學(xué)位置及形態(tài)。采取血液以備血常規(guī)及酶活性測定，并記錄山羊體溫、呼吸和脈搏數(shù)。

1.2.2 肝臟穿刺采樣 母羊左側(cè)臥保定，用電推剪將右側(cè)壁肝區(qū)毛發(fā)推凈，酒精絡(luò)合碘酒精依次消毒。向后回拉活檢槍頂端發(fā)射鈕至針基彈簧處于緊繃上膛狀態(tài)，從倒數(shù)第4至第5肋間(第9至第10肋間)與肩關(guān)節(jié)水平線相交處垂直腹壁皮膚用力刺入(圖1)。刺破皮膚后針體與腹壁呈45度角向尾端進針約6 cm(圖2)。若針尖插入肝臟會有破空感，應(yīng)立即停止繼續(xù)進針。此時輕緩?fù)巴苿影l(fā)射鈕至針基彈簧前端，再用力按下發(fā)射鈕。彈射會使外套針自動前進，迅速包裹內(nèi)切割針，將肝臟組織切割至內(nèi)切割針針內(nèi)凹槽中。完成后將活檢槍從山羊體內(nèi)退出，按壓穿刺部位止血，并再次消毒。將采樣槍發(fā)射鈕向后回拉，待針基彈簧再次緊繃上膛，往前輕輕推出切割針，此時可以看到切割下來的肝臟組織暴露在切割針凹槽內(nèi)(圖3)。用無菌鑷子將采集的肝臟組織放入細(xì)胞凍存管，閃凍于液氮。

圖1 活檢槍垂直腹壁皮膚插入

1.2.3 術(shù)后護理 肌肉注射頭孢噻呋鈉(5 mg/kg)及酚磺乙胺(2 mL～4 mL)。密切觀察活檢山羊體態(tài)、行為、采食、反芻、糞便和陰道分泌物等是否正常。給山羊正常喂食，盡量避免驅(qū)趕、大聲呵斥動物，減少應(yīng)激，限制活動，避免其他損傷。保證欄舍整潔通風(fēng)，定期消毒。術(shù)后1周再次測量山羊生理參數(shù)，采取血液進行血常規(guī)及酶活性測定。

1.2.4 血液樣本的實驗室檢查 按照Mindray BC-2800血球分析儀說明書進行血常規(guī)檢查；ALT，AST及ALKP酶活性檢測按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均按平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，選用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

按照所處圍產(chǎn)期階段，對9只山羊共進行70次肝臟穿刺取樣，每只山羊穿刺7～9次。肝臟采出率為100%，流產(chǎn)率為0，死亡率為0。其中1、3、6、9號羊山羊產(chǎn)仔1頭，2號和5號產(chǎn)仔2頭，8號羊產(chǎn)仔數(shù)為3頭。4號羊產(chǎn)仔有弱胎現(xiàn)象，8號羊產(chǎn)仔有一只呈軟蹄表現(xiàn)，經(jīng)鑒定，為飼料配比異常，排除采樣因素。

圖2 刺破皮膚后呈45°插入肝臟組織，進針約6 cm

圖3 穿刺后留在切割槽內(nèi)的肝臟組織

山羊體溫、呼吸和脈搏數(shù)監(jiān)測結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，山羊穿刺后體溫高于術(shù)前(P<0.05)，呼吸和脈搏數(shù)術(shù)前術(shù)后差異不顯著。所有生理參數(shù)均在正常參考值范圍內(nèi)，表示肝活檢采樣未明顯影響山羊的生理功能。

表1 山羊的體溫呼吸脈搏監(jiān)測

注：* 表示與穿刺前相比差異顯著(P<0.05)。

Note:* indicates a significant difference compared with before puncture(P<0.05).

山羊血常規(guī)檢測結(jié)果如表2所示。穿刺后山羊白細(xì)胞相關(guān)參數(shù)(WBC、LYPM、MID和GRAM等)和紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)(RBC、MCV、HCT和HGB等)與產(chǎn)前相比差異均不顯著，提示肝活檢穿刺采樣未影響血液的組成和功能。

表2 山羊血常規(guī)測定結(jié)果

山羊血清酶活性檢查結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，山羊血清ALT和AST等指標(biāo)術(shù)前術(shù)后差異不顯著，且都在正常參考值范圍內(nèi)，提示肝臟并未受到實質(zhì)性損傷。

圖4 山羊術(shù)前和術(shù)后血清ALT和AST活性

3 討論

本研究對9頭圍產(chǎn)期山羊進行共70次肝臟穿刺采樣，肝臟組織采出率為100%，且未發(fā)生死亡流產(chǎn)等情況；術(shù)前術(shù)后山羊的生理參數(shù)未見明顯變化；血常規(guī)和血清酶學(xué)檢測顯示穿刺前后無明顯差異。這些結(jié)果充分表明，山羊圍產(chǎn)期肝臟穿刺采樣是一種安全可靠的肝活檢組織樣本獲得方法。

采樣前用B超對山羊肝區(qū)掃查十分必要，有助于明確肝區(qū)范圍、膽囊解剖學(xué)位置及肝內(nèi)大血管分布，以避開門靜脈，為采樣操作劃定合理的穿刺區(qū)域。由于妊娠山羊膨大的子宮會壓迫腹部器官，選擇穿刺部位時宜靠近頭端，不宜靠后。多次實踐表明，在第9肋與第10肋間與肩關(guān)節(jié)水平線交點處進針，對肝損傷較少，不會傷及肝區(qū)大血管引起大量內(nèi)出血。采樣后山羊紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白含量較之采樣前有所降低但差異不顯著，體溫略升高，加之白細(xì)胞總數(shù)處于高位，提示穿刺已對肝臟造成一定量出血損傷及炎癥。事實上，出血是肝穿刺活檢最常見的并發(fā)癥之一[8]。因此，術(shù)前1 h～2 h可以選用100 g/L CaCl2等提高血液凝固性的藥物預(yù)防出血，或在術(shù)后肌注促凝血的藥物如止血敏和維生素K1等治療出血，此外術(shù)后的抗菌消炎也十分必要。但活檢穿刺后未見血清ALT和AST活性升高，提示采樣并未造成肝實質(zhì)的損傷，未累及肝臟功能。

同為反芻動物，山羊和奶牛在圍產(chǎn)期有著相似的生理特征性改變。首先，圍產(chǎn)期山羊和奶牛有類似的能量代謝特點：兩者產(chǎn)后都存在脂肪動員[1,3]，血液NEFA濃度均高于產(chǎn)前，特別地，產(chǎn)后血液β-羥丁酸含量顯著高于產(chǎn)前[9]。再次，與奶牛類似，圍產(chǎn)期山羊也存在氧化應(yīng)激，隨著妊娠進行，MDA濃度逐漸升高，而血液總抗氧化能力逐漸降低[10]。特別地，MDA含量在山羊產(chǎn)后初期達到峰值[11]。此外，如本研究所示，圍產(chǎn)期山羊體內(nèi)也存在炎性反應(yīng)，但引起炎癥反應(yīng)的機制暫不明確。根據(jù)圍產(chǎn)期奶牛的研究[12]可以推斷，炎癥產(chǎn)生可能與圍產(chǎn)期免疫功能障礙、能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激有關(guān)。這些圍產(chǎn)期共同的生理特征性改變提示，用山羊替代奶牛作為實驗動物來研究圍產(chǎn)期疾病發(fā)病機制具有一定科學(xué)依據(jù)。圍產(chǎn)期奶牛疾病的研究瓶頸之一在于樣本難以收集，特別是肝臟組織樣本。因此，本研究建立的山羊肝組織穿刺采樣方法對圍產(chǎn)期反芻動物能量代謝性疾病的研究可能具有重要意義。

通過對9頭圍產(chǎn)期山羊進行70次肝臟活檢穿刺，結(jié)果顯示，肝臟樣本采出率為100%，動物死亡率為0，流產(chǎn)率為0；血液實驗室檢測顯示采樣前后各指標(biāo)均無明顯異常。這些結(jié)果表明此法安全可靠，適用于山羊圍產(chǎn)期樣本采集，也可為圍產(chǎn)期奶牛肝臟活檢樣本采集提供參考。

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Effect of Liver Biopsy on Blood Routine and Liver Function in Peripartum Goats

YAO Li,PENG Tao,LI Jiao,LIU Li-zhi,XING Wen-hua,JIA Xing-lin,YUAN An-wen,LIU Lei
(CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan，410128，China)

Peripartum period is a time when common diseases and contagious diseases of ruminants often take place,and its most prominent pathological feature is the negative energy balance (NEB).The liver is the major organ for energy metabolism,and thus the collection of liver samples is of particularly importance for the diagnosis and study of pathogenesis of perinatal diseases.In the present study,needle biopsy was employed for liver tissue sampling in peripartum goats.Standard operation of needle puncture was applied to 9 peripartum goats,and 70 times of biopsy were accomplished in total.Results showed that liver samples were taken successfully during each puncture with mortality rate and abortion rate both at 0%.Blood routine test and liver function test suggested no significant difference before and after biopsy.Those data indicated that needle biopsy was a reliable and safe method for collection of liver samples in peripartum goats,and would facilitate the research of perinatal diseases in ruminants.

needle puncture; biopsy; perinatal period; goat; liver

2016-11-14

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(31502135)；湖南省教育廳科研項目(16B124)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)引進人才基金(15YJ05)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)2016年大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目(2016ZK17)

姚 立(1993-)，男，江西上饒人，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)代謝病與小動物疾病研究。*通訊作者

S852.2

B

1007-5038(2017)06-0128-04