王雪芹, 王光華, 喬 飛, 高其康, Kong Luen HEONG, 祝增榮, 程家安,*

1 浙江大學(xué)水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 310058 2 浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所, 杭州 310058 3 浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)學(xué)部分析測試中心, 杭州 310058

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高通量測序及其在食物網(wǎng)解析中的應(yīng)用進(jìn)展

王雪芹1,2, 王光華1,2, 喬 飛1,2, 高其康2,3, Kong Luen HEONG1,2, 祝增榮1,2, 程家安1,2,*

1 浙江大學(xué)水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 310058 2 浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所, 杭州 310058 3 浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)學(xué)部分析測試中心, 杭州 310058

高通量測序是DNA測序技術(shù)發(fā)展中的重大突破,它的出現(xiàn)為現(xiàn)代生物科學(xué)研究提供了前所未有的機遇,例如基于獵物和寄主植物DNA分子解析生態(tài)系統(tǒng)的食物網(wǎng)研究已逐漸成為捕食性動物與植食性動物食物網(wǎng)研究的新型模式。在簡要總結(jié)Roche 454、Illumina和Ion Torrent為代表的第二代測序技術(shù)的原理及最新進(jìn)展的基礎(chǔ)上,綜述了近年來利用高通量測序技術(shù)在捕食性和植食性動物食物網(wǎng)解析構(gòu)建研究方面取得的最新進(jìn)展及存在的問題,以期為探索捕食性和植食性動物的獵物/寄主范圍、獵物/寄主轉(zhuǎn)換、資源分配、生物防治、生物保護(hù)和生態(tài)恢復(fù)新方法提供思路和啟發(fā)。

第二代測序；捕食/植食性動物；營養(yǎng)關(guān)系；食物轉(zhuǎn)換；宏條形碼技術(shù)

1970年代中期,英國生物化學(xué)家Sanger發(fā)明了Sanger測序法(雙脫氧核苷酸末端終止法),為科研人員開啟了深入研究生命遺傳密碼的大門,Sanger也因此獲得1980年的諾貝爾化學(xué)獎[1- 2]。自1977年以Sanger法為代表的第一代測序技術(shù)幫助人們完成了第一個完整基因組圖譜的繪制以來,測序技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步。進(jìn)入21世紀(jì)后,以Roche 454、Illumina和Ion Torrent 等測序系統(tǒng)為代表的第二代測序技術(shù)誕生,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能[3]。第二代測序技術(shù)又稱高通量測序技術(shù)(High Throughput Sequencing, HTS),下一代測序技術(shù)(Next Generation Sequencing, NGS),它能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定,具有測序通量高、速度快及成本低等優(yōu)點,是DNA測序發(fā)展歷程的一個里程碑,使人們進(jìn)入了基因組和后基因組時代[4],為現(xiàn)代生命科學(xué)研究提供了前所未有的機遇。

基于高通量測序技術(shù)獲得生物特異性基因識別DNA條形碼序列的擴增子測序方法,稱為DNA宏條形碼技術(shù)(DNA Metabarcoding)。該技術(shù)可將整個混合樣本的DNA片段擴增后再進(jìn)行高通量測序,進(jìn)而確定取樣環(huán)境中生物的分布狀況,目前已用于微生物和動物等環(huán)境DNA (Environmental DNA, eDNA) 科學(xué)方面的研究[5- 6]。DNA 宏條形碼技術(shù)具有快速、靈敏、可重復(fù)、高效及省時省力等優(yōu)點,不僅為生物多樣性調(diào)查提供了高效有力的方法,而且在環(huán)境監(jiān)測、資源管理和生態(tài)評估等方面具有重要的意義[7- 10]。

食物網(wǎng)是生物群落內(nèi)各物種之間營養(yǎng)關(guān)系的基本聯(lián)系,反映了自然界各種生物之間相互依存、相互制約、協(xié)同進(jìn)化等互作關(guān)系的自然屬性,其研究結(jié)果可直接體現(xiàn)生態(tài)群落的功能結(jié)構(gòu),因此物種間食物網(wǎng)的研究始終是生態(tài)學(xué)中非常重要和活躍的研究領(lǐng)域[11]。近年來,基于DNA宏條形碼技術(shù)分子解析構(gòu)建捕食者-獵物和植食者-植物營養(yǎng)關(guān)系研究發(fā)展迅速,并逐漸成為食物網(wǎng)研究的新型模式[12],高通量測序的出現(xiàn)為研究捕食性和植食性動物復(fù)雜的食物網(wǎng)提供了前所未有的機遇[13]。本文在簡要總結(jié)以Roche 454、Illumina和Ion Torrent為代表的高通量測序技術(shù)原理及最新進(jìn)展的基礎(chǔ)上,綜述了近年來基于高通量測序的DNA宏條形碼技術(shù)在食物網(wǎng)解析構(gòu)建方面的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景,以期為探索捕食/植食性動物的獵物/寄主范圍、獵物/寄主轉(zhuǎn)換、資源分配、生物防治、生物保護(hù)和生態(tài)恢復(fù)新方法提供思路和啟發(fā)。

1 高通量測序技術(shù)原理及發(fā)展

第二代測序技術(shù)以高通量低成本為其主要特征,并在此基礎(chǔ)上保持了第一代測序技術(shù)的高準(zhǔn)確性。第二代測序技術(shù)主要包括基于合成測序(Sequencing by synthesis, SBS)的Roche 454,Illumina和Ion Torrent測序技術(shù)[3, 14- 16]。

1.1 Roche 454測序技術(shù)原理

2005年,454生命科學(xué)公司生產(chǎn)了第一臺商品化的高通量測序儀-基因組測序20[17]。454 測序儀利用焦磷酸法測序(Pyrosequencing),其原理是：首先將長度合適的單鏈DNA片段連接測序接頭和模板接頭制備成樣品文庫(圖1A中文庫制備)。將固化引物的磁珠與樣品文庫制成“一個磁珠=一個DNA片段”的微反應(yīng)器,進(jìn)行多輪油包水乳滴PCR(emulsion PCR,emPCR)后,每個磁珠表面都結(jié)合了數(shù)千個相同的DNA拷貝,形成“一個磁珠=一個讀長序列” (圖1A中模板制備)。然后富集磁珠到微孔板上,每個微孔容納一個磁珠,微孔板為流通池的一部分,其中一面通過測序反應(yīng)的化合物,另一面則與 CCD光學(xué)檢測系統(tǒng)的光纖相接觸。堿基測定采用邊合成邊測序,利用ATP硫?；负蜔晒馑孛冈谌姿岷塑战Y(jié)合到DNA鏈上釋放焦磷酸基團(tuán)(PPi)光信號(圖1A中測序技術(shù))。順次向流通池中加入4種dNTP中的一種,通過每個微孔之中釋放的光信號確定DNA 模板上的互補堿基,從而實現(xiàn)對 DNA 片段的準(zhǔn)確快速測定[18]。目前454技術(shù)平臺讀取長度達(dá)到600—1000bp,使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確,但測序通量相對較低和成本較高是其發(fā)展的瓶頸(表1)。近年來,隨著測序技術(shù)的發(fā)展,后來上市的測序儀(如Illumina的MiSeq和Life Technologies的Ion Torrent系統(tǒng))更是將454儀器排擠到研究邊緣,因此羅氏關(guān)閉了454義務(wù),聯(lián)合PacBio公司發(fā)展第三代測序技術(shù)[19]。

1.2 Illumina測序技術(shù)原理

Illumina 公司的Genome Analyzer 于2006年問世。首先把待測序列打斷成200—500 bp的小片段,兩端加上不同的接頭,連接載體,構(gòu)建單鏈DNA文庫(圖1B中文庫制備)。DNA轉(zhuǎn)移到表面固定有很多接頭的8泳道微纖維板組成的流動槽,向反應(yīng)體系中添加核苷酸和酶,進(jìn)行橋式PCR (Bridge PCR)。Bridge PCR以流動槽表面固定的接頭為模板,將橋型單鏈DNA 擴增成橋型雙鏈DNA,經(jīng)過不斷的變性擴增循環(huán),每種單鏈DNA 都在各自的位置產(chǎn)生約2000個分子的高密度DNA簇(圖1B中模板制備)。DNA簇在Genome Analyzer綜合分析儀上進(jìn)行序列分析。向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP。由于這些 dNTP的3′羥基被化學(xué)方法保護(hù),因而每輪合成反應(yīng)都只能添加1個dNTP。在dNTP 被添加到合成鏈上后,未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫。加入激發(fā)熒光緩沖液,用光學(xué)設(shè)備記錄激光激發(fā)的熒光信號,再通過計算機分析轉(zhuǎn)化為測序結(jié)果。信號記錄完成后,加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除 dNTP 的3′羥基保護(hù)基團(tuán),進(jìn)行下一輪測序反應(yīng)(圖1B中測序技術(shù))[16]。目前Illumina最新的測序平臺的讀取長度可以達(dá)到 2×150 bp(Hiseq 4000),2×300 bp(Miseq300),通量高和成本較低是其占據(jù)市場的優(yōu)勢(表1)。

1.3 Ion Torrent 測序技術(shù)原理

Ion Torrent 測序原理是在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定納米尺度的連接100萬條相同DNA片段的磁珠(Ion SphereTM)形成微型反應(yīng)池(圖1C中模板制備),隨后依次摻入ACGT。隨著每個堿基的摻入,釋放出氫離子,改變反應(yīng)溶液的pH值,離子傳感器檢測到pH變化后,實時判讀堿基,即刻從化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息 (圖1C中測序技術(shù))[20]。這種方法直接檢測DNA的合成,少了CCD掃描,熒光激發(fā)等環(huán)節(jié),大大縮短了運行時間。這種技術(shù)跟芯片連接在一起,使得生物學(xué)和計算機學(xué)完全融為一體,創(chuàng)造了技術(shù)上的革新。

Ion Torrent測序平臺有Ion Torrent PGM (Personal Genome Machine)和 Ion Proton兩種測序儀。PGM有3種芯片可供選擇,Ion Proton目前僅有PI芯片。芯片技術(shù)的發(fā)展使測序儀2 h 堿基產(chǎn)量從10 Mb 提升到 10 Gb。伴隨著試劑的優(yōu)化和測序通量的提高,Ion Torrent讀取長度也從2011年的200 bp提升到目前的400 bp。不斷提高的芯片密度、讀取長度和優(yōu)化的數(shù)據(jù)處理方式,將使Ion Torrent的測序通量在不久的將來進(jìn)一步提高(表1)[21-22]。

圖1 Roche 454 (A)、Illumina (B)和 Ion Torrent (C)3種常用高通量測序平臺工作原理比較圖(改編自Del Chierico等[23])Fig.1 Comparison of principle schemes from library preparation to sequencing technology among Roche 454 (A), Illumina (B) and Ion Torrent (C) (Modified from Del Chierico et al.[23])

表1 Roche 454 、Illumina 和 Ion Torrent常用高通量測序平臺主要技術(shù)參數(shù)和測序通量

1.4 第三代測序技術(shù)

Roche 454、Illumina和 Ion Torrent 為代表的這些平臺原理各有不同,在通量、讀長、準(zhǔn)確度、速度和成本方面各具優(yōu)勢,目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各項研究領(lǐng)域,并且在測序市場占有絕對優(yōu)勢地位。但是,近年來基于單個分子信號檢測的單分子測序 (Single Molecule Sequencing, SMS),或第三代測序 (Third Generation Sequencing, TGS)技術(shù)發(fā)展快速,這些新技術(shù)包括PacBio的單分子實時測序(Single Molecule Real-time Sequencing, SMRT),Helicos的真正單分子測序(True Single Molecule Sequencing, tSMS)和Oxford的納米孔測序(Nanopore Sequencing)等[24]。

2 高通量測序在食物網(wǎng)研究中的應(yīng)用

生態(tài)學(xué)是探索生物與環(huán)境關(guān)系的學(xué)科,而特定生態(tài)系統(tǒng)中物種間的食物聯(lián)系,或食物網(wǎng)常是生態(tài)學(xué)研究的重點之一。數(shù)十年來,國際上植物-植食性生物-捕食性生物的食物網(wǎng)研究方法主要分為三大類,即傳統(tǒng)方法(野外人工或攝像觀察法、田間籠罩法、消化道內(nèi)容物解剖分析法),生化方法(脂肪酸分析法、穩(wěn)定同位素技術(shù)、蛋白質(zhì)電泳分析法)和現(xiàn)代分子方法(多克隆抗體和單克隆抗體技術(shù)、DNA分子技術(shù)),這些方法針對不同環(huán)境和研究對象各有其優(yōu)缺點[25-26]。傳統(tǒng)方法直觀快速、可信度高,適用簡單環(huán)境下大型動物的取食,不足之處是耗時耗力,具有偶然性；生化分析方法相對簡便、效率高,適用于多種生態(tài)系統(tǒng),缺點是不同生物之間成分的組成和重合、樣品的處理方式等都會影響準(zhǔn)確評估攝食信息；獵物蛋白抗體技術(shù)相對比較準(zhǔn)確、甚至可以制作特定發(fā)育階段的單克隆抗體,適合研究某種或幾種特定獵物的捕食者,劣勢之處是抗體制備繁瑣、需要特殊細(xì)胞和組織培養(yǎng)系統(tǒng),耗時長,成本高。近來,隨著物種分子鑒定技術(shù)的發(fā)展和NCBI、BOLD等數(shù)據(jù)庫的豐富完善,DNA分子追蹤食物鏈和食物網(wǎng)正成為分子生態(tài)學(xué)營養(yǎng)關(guān)系研究的主流方法[26]。

基于高通量測序的DNA metabarcoding 分子解析食物方法不受獵物種類限制,尤其適合研究陸地和海洋等自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不同生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性的廣食性動物不同時空條件下的復(fù)雜食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)、時空轉(zhuǎn)換和食物資源分配等。目前,該方法已廣泛應(yīng)用于捕食者-獵物和植食者-寄主植物食物鏈研究,進(jìn)而可以組合開展食物網(wǎng)的研究,如基于消化道內(nèi)容物或糞便DNA 研究動物的食性以及在生態(tài)系統(tǒng)中的作用[6, 27-28]。該技術(shù)不僅可以通過計算測序產(chǎn)生序列的種類數(shù)定性和比較不同食物序列的相對豐度定量分析食物網(wǎng)內(nèi)不同物種之間的關(guān)系[29- 31],而且可以分析不同時空尺度下的食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)特征和食物轉(zhuǎn)換,以解決生態(tài)學(xué)、生物進(jìn)化、生物保護(hù)和種群群落構(gòu)建恢復(fù)等方面的問題[6, 28]。例如,高通量測序通過對不同廣食性捕食者或植食者樣品消化道內(nèi)容物或糞便樣品進(jìn)行PCR擴增時在引物的5′末端加上由不同堿基組成的多重識別標(biāo)簽(Multiplex Identifier Sequences, MIDs),就能在一次測序中對不同來源,不同種類的廣食性動物的各種獵物殘留或寄主植物目標(biāo)序列進(jìn)行測序分析,既節(jié)約了時間、人力和物力,又避免了污染,具有簡便、快速和信息量大等特點[13,32]。分子生態(tài)學(xué)雜志在2014年8月出版了專刊,對該技術(shù)的研究和分析方法以及應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛的討論[28]。

2.1 捕食性脊椎動物

Deagle等[33]通過Roche GS-FLX平臺研究了澳大利亞塔斯馬尼亞島3個不同海域的南非海狗Arctocephaluspusillusdoriferus的270份糞便樣本,結(jié)果顯示南非海狗的主要獵物為新西蘭紅珍珠魚Emmelichthysnitidus和青背竹筴魚Trachurusdeclivis,并且發(fā)現(xiàn)以前不被重視的澳洲鯖Scomberaustralasicus也是其重要獵物,這是宏條形碼技術(shù)在捕食性動物食物網(wǎng)研究中的第一次應(yīng)用,從而使得對大規(guī)模的野生動物的食物組成的研究成為可能。

本土珍稀物種的保護(hù)和培育甚至遷地保護(hù)是生物保護(hù)的重要內(nèi)容。Brown等[34]通過Roche 454測序研究毛里求斯馬埃堡自然保護(hù)區(qū)本土珍稀物種蜥蜴Leiolopismatelfairii和入侵鼩鼱SuncusMurinus的獵物譜及資源分配,結(jié)果表明盡管兩種捕食者不存在種間捕食,但食物網(wǎng)分析和Pianka生態(tài)位重疊指數(shù)表明這兩種捕食者存在很高程度的獵物重疊和較強的獵物資源競爭,清除外來入侵的鼩鼱?wèi)?yīng)是保護(hù)蜥蜴的首要措施。

蝙蝠是許多農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲的天敵,也是種子的傳播者和花粉的傳授者,在生態(tài)系統(tǒng)占據(jù)獨特的生存空間,因此研究和保護(hù)蝙蝠在維護(hù)生態(tài)環(huán)境中具有十分重要的意義。Clare等[35]基于Ion Torrent PGM測序平臺,結(jié)合316芯片研究了加拿大安大略省劍橋市郊森林斑塊大棕蝠Eptesicusfuscus不同時間獵物的多樣性及獵物轉(zhuǎn)換,表明大棕蝠對甲蟲捕食率最高,其獵物譜中鱗翅目具有最高的多樣性,獵物種類組成在不同年份和季節(jié)變化很大,但鱗翅目和蜉蝣目是其恒定的獵物成分,獵物多樣性隨著昆蟲多樣性的減少而增加。這說明當(dāng)獵物資源有限時,大棕蝠可以改變攝食策略以維持其生態(tài)穩(wěn)定性。

2.2 植食性脊椎動物

海島為許多瀕危鳥類提供了棲息環(huán)境,但是對外來物種可能是脆弱的生態(tài)系統(tǒng)。Ando等[36]通過擴增植物葉綠體tRNA L(trnL)基因條形碼結(jié)合Roche 454焦磷酸測序研究了日本小笠原諸島瀕危黑林鴿Columbajanthinanitens在不同島嶼和不同時間的食物譜及食物轉(zhuǎn)換,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑林鴿更喜歡取食外來植物,因此建議在清除外來植物和保護(hù)本島植物之間應(yīng)該有個權(quán)衡,以保持黑林鴿的食物資源。

人類活動造成的森林景觀碎片化極大地影響了靈長類動物的棲息。Quéméré等[37]利用Illumina Genome Analyzer IIx 平臺結(jié)合metabarcoding 技術(shù)對馬達(dá)加斯加島達(dá)賴納地區(qū)瀕臨滅絕的金冠冕狐猴Propithecustattersalli的食性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)金冠冕狐猴的食譜里至少有130 種植物,并且在森林邊緣生活的金冠冕狐猴食物中發(fā)現(xiàn)許多栽培和野生的植物種類,表明多樣性的食譜有利于狐猴靈活改變食物結(jié)構(gòu)應(yīng)對棲息地的改變和環(huán)境的變化。

Kartzinel等[30]通過Illumina HiSeq 2500平臺結(jié)合DNA Metabarcoding 技術(shù),應(yīng)用相對讀長豐度(Relative Read Abundance, RRA)比較研究了肯尼亞南部非洲熱帶稀樹草原艮氏小羚Madoquaguentheri,非洲象Loxodontaafricana,平原斑馬Equusquagga,細(xì)紋斑馬Equusgrevyi,非洲水牛Synceruscaffer,瘤牛Bosindicus和高角羚Aepycerosmelampus等7種大型食草動物的食譜寬度、組成和重疊度。研究表明,食草的兩種斑馬食物中99%以上的序列都是禾本科植物,而食嫩葉的艮氏小羚食物中禾本科植物卻不足1%,同一種食草動物食物譜相似,而不同種食草動物具有更加分化的食物譜,因此植物種類的多樣性為維持非洲草原食物譜分化的大型食草動物的多樣性奠定了基礎(chǔ)。

2.3 捕食性無脊椎動物

Boyer等[38]應(yīng)用Roche 454焦磷酸測序技術(shù)結(jié)合蚯蚓的組特異性引物研究了46頭瀕危的軟體動物蝸牛Powelliphantaaugusta捕食蚯蚓的食物譜,分析了蝸牛與不同生物學(xué)特性蚯蚓的生態(tài)聯(lián)系,并提出了保護(hù)遷移蝸牛的建議。

評價農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中捕食性天敵對害蟲的控制作用是生態(tài)學(xué)研究的重要課題,也是實施害蟲綜合治理防治策略的基礎(chǔ)。研究農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)某種捕食者是否影響目標(biāo)獵物的種群動態(tài),并不能僅僅簡單地通過捕食者的捕食率來計算。Piol等[39]通過Ion Torrent PGM測序平臺研究了英國燕麥田皿蛛Oedothoraxfuscus的獵物譜,高通量測序生成200萬條讀長,去掉無效和捕食者本身讀長,剩下6萬多條有效讀長,有效讀長中比較豐富的是彈尾目、鱗翅目、雙翅目和線蟲的序列,也包含了蚜蟲和集團(tuán)內(nèi)捕食(Intraguild Predation, IGP)而殘留的蜘蛛的序列。結(jié)果表明,廣食性天敵皿蛛O.fuscus具有寬廣的獵物譜。

通過提高種植園植物多樣性,為廣食性捕食者提供替代獵物,以增加捕食者的密度來增強天敵對農(nóng)業(yè)害蟲的自然調(diào)控作用,是生態(tài)調(diào)控農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分。Mollot等[40]基于構(gòu)建香蕉園節(jié)肢動物mini-barcodes數(shù)據(jù)庫和Roche 454高通量測序平臺,通過建立種植牧草伏生臂形草Brachiariadecumbens的香蕉園和對照園比較的方式,比較了兩種類型實驗田捕食性天敵的獵物選擇及對主要害蟲香蕉象甲Cosmopolitessordidus控制作用。結(jié)果表明因為廣食性捕食者轉(zhuǎn)向捕食替換獵物,香蕉園種植牧草對天敵調(diào)控害蟲種群可能有負(fù)作用。

2.4 植食性無脊椎動物

Valentini等[41]設(shè)計了擴增植物葉綠體tRNA L(trnL)基因條形碼的通用引物,結(jié)合Roche 454測序研究了異色雛蝗Chorthippusbiguttulus,北京棒角蝗Gomphocerippusrufus,智利螺旋蝸牛Helixaspersa,鼻涕蟲Derocerasreticulatum和Arionater等動物的36份糞便樣品,解析了這些植食性動物的食物譜,結(jié)果表明大約50%的植物可以鑒定到種,這也是宏條形碼技術(shù)在植食性動物食物研究中的第一次應(yīng)用,為研究植食性動物食物譜和資源分配提供了切實可行的方法。

Kajtoch[42]通過ABI Sanger 測序和高通量測序平臺 Illumina MiSeq 解析了波蘭中南部、波蘭北部、烏克蘭西部和斯洛伐克-摩拉維亞地區(qū)四個地理種群干熱象甲Centricnemusleucogrammus寄主植物的rbcL(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的大亞基基因)和trnL兩種基因的條形碼,比較了這兩種測序技術(shù)對基于rbcL和trnL兩種基因條形碼的寄主植物解析深度,并分析了這4個地理種群的寄主植物范圍。研究表明Illumina 高通量測序比Sanger傳統(tǒng)測序具有更詳盡的解析度；并且,基于rbcL和trnL雙基因條形碼系統(tǒng)能為研究植食者的寄主植物(至少鑒定到屬)提供足夠的信息；4個不同地理種群的干熱象甲食物譜并不相同,這可能反應(yīng)了干熱象甲的地理種群的生態(tài)適應(yīng)和遺傳隔離,為保護(hù)稀有和瀕危物種提供了借鑒。

研究直翅目昆蟲單食性到廣食性的寬廣食物譜有助于我們探究植食性昆蟲食性的分化和進(jìn)化。通常認(rèn)為蝗科的北方綠帶蝗Chortophagaviridifasciata是禾草性植食者,赤腿蝗Melanoplusfemurrubrum是雜草性植食者,而黑帶雙蝗Melanoplusbivittatus和卡羅來納蝗Dissosteiracarolina是混合性植食者。McClenaghan等[43]基于Illumina MiSeq 平臺通過擴增野外采集的這4種蝗蟲的消化道內(nèi)容物的rbcL基因,運用 DNA metabarcoding 技術(shù)研究了這四種蝗蟲的食性。結(jié)果證實黑帶雙蝗和卡羅來納蝗是混合性植食者,北方綠帶蝗是禾草性植食者,而赤腿蝗消化道內(nèi)既有雜草也有禾本科植物,揭示了這些蝗蟲種間存在食物資源競爭。

3 總結(jié)與展望

3.1 存在的問題

盡管近年來基于高通量測序技術(shù)的DNA metabarcoding 技術(shù)解決了全面分析捕食者/植食者食物鏈和食物網(wǎng)的技術(shù)障礙,從而發(fā)展成為分子生態(tài)學(xué)研究中一個十分活躍的領(lǐng)域,但是其結(jié)果的可靠性仍受多方面因素的影響：

(1) 目的基因的選擇 細(xì)胞內(nèi)多拷貝的動物線粒體基因組和植物葉綠體基因組具有保守的結(jié)構(gòu)和大小,因此適合作為動物分子鑒定和植物分子鑒定的標(biāo)記[44-45]。但是,動物體的線粒體基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的線粒體假基因(Nuclear Mitochondrial-like Sequences, NUMTs)、內(nèi)共生菌干擾、線粒體DNA的多態(tài)性和異質(zhì)性可影響物種的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建[46-47]。

(2) 基因區(qū)域的選擇 動物線粒體基因組DNA主要選擇在COI,16S 等區(qū)域,而COI 的658bp 長的DNA條形碼(DNA Barcoding)區(qū)域是動物分類鑒定最常用的區(qū)域[48- 49],也具有包括NCBI和BOLD (www.boldsystems.org)等豐富的數(shù)據(jù)庫資源[50],但COI 基因進(jìn)化速率的差異使其在一些類群中缺乏鑒定能力,因此有時需要多基因條形碼鑒定系統(tǒng)[51]。同時,植物葉綠體DNA主要選擇在rbcL,matK(葉綠體賴氨酸基因(trnK)的內(nèi)含子),trnH-psbA3個條形碼片段及近來發(fā)現(xiàn)的植物核糖體ITS條形碼片段,同樣對于困難類群,很多學(xué)者建議使用多個條形碼協(xié)同鑒定[52-53]。

(3) 引物的選擇和評估 由于消化道殘留或糞便是降解的短片段DNA,因此 metabarcoding 分析其多樣性時常用兼并的擴增短片段的通用引物,而通用引物的選擇或組合、擴增偏向性、擴增成功率和擴增片段的分辨率等都會導(dǎo)致稀有的或者難擴增物種的數(shù)據(jù)丟失或失真等錯誤,從而影響到對捕食者和植食者與其食物間數(shù)量關(guān)系的解析,因而尚需在進(jìn)一步明確這些因素與擴增效率關(guān)系的基礎(chǔ)上完善食物網(wǎng)關(guān)系的定量分析方法[13, 54- 55]。

(4) 阻止擴增捕食者本身的特異性阻斷引物(Blocking primers)的使用 研究未解剖小型捕食性節(jié)肢動物的獵物時,未添加阻斷引物的情況下,會產(chǎn)生大量捕食者本身的序列,有時即使在阻斷引物存在的情況下,也未必能保證阻止成功[39, 56- 57]。

(5) 公共數(shù)據(jù)平臺DNA 條形碼參考數(shù)據(jù)庫的不盡完善 生物DNA 條形碼是建立在物種形態(tài)分類基礎(chǔ)上的分子鑒定,生物形態(tài)特征的可塑性和遺傳多樣性直接影響基于傳統(tǒng)形態(tài)分類的生物鑒定,而當(dāng)前訓(xùn)練有素的分類學(xué)家越來越少,形態(tài)分類學(xué)工作又不可避免地會遇到人為的錯誤及其他無法克服的困難,因此形態(tài)分類和系統(tǒng)分類的發(fā)展研究水平將直接影響物種的傳統(tǒng)分類鑒定,進(jìn)而影響其構(gòu)建物種DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫、物種信息庫、信息共享和應(yīng)用[58- 59]。

(6) 生物信息學(xué)專家和人才的短缺 高通量測序技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)的整合和分析在生物研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,而動物食物網(wǎng)海量數(shù)據(jù)的分子解析不僅需要前期生態(tài)學(xué)、分類學(xué)工作者的基礎(chǔ)工作,更需要后期生物信息學(xué)工作者的儲存、檢索、處理和分析以揭示大量而復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)所賦有的生態(tài)學(xué)奧秘[60]。

3.2 展望

從復(fù)雜的野外觀察、攝像到室內(nèi)的消化道內(nèi)容物解剖分析,從脂肪酸、同位素標(biāo)記的生化分析到獵物蛋白特異的抗體技術(shù),從普通PCR、定量PCR再到基于高通量測序的宏條形碼技術(shù),捕食性和植食性動物的食物鏈和食物網(wǎng)研究發(fā)展的每一步都離不開科學(xué)的發(fā)展和技術(shù)的創(chuàng)新[12-13, 25, 61-62]。盡管基于高通量測序數(shù)據(jù)的 metabarcoding 方法還存在一些問題,如擴增區(qū)域的選擇、引物的選擇或組合、PCR的偏好性、擴增效率的差異、讀長的清晰度或解析度和數(shù)據(jù)庫的完善度等[63-65],但隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和不斷完善,尤其是測序通量的增加、讀長的增長、信息儲備量的增大、測序成本的降低、數(shù)據(jù)分析軟件的優(yōu)化以及生物條形碼的發(fā)展和基因數(shù)據(jù)庫資源的豐富[3, 66-67],特別是近年來發(fā)展的無偏見精確定量的PCR-free深度鳥槍法測序(Shot-gun Sequencing)[68-71]和線粒體捕獲富集深度測序多樣性評估技術(shù)[72-73],都將為高通量、準(zhǔn)確、快速和低成本的全面深入研究捕食性和植食性動物的食物網(wǎng)提供更理想的資源和平臺,為進(jìn)一步應(yīng)用高通量測序探索捕食性和植食性動物的獵物/寄主范圍、獵物/寄主轉(zhuǎn)換、生物防治、資源分配、生物保護(hù)、生態(tài)工程等生態(tài)恢復(fù)提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)[27-28, 30]。

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Progress on high-throughput sequencing and its applications in food web analysis

WANG Xueqin1,2, WANG Guanghua1,2, QIAO Fei1,2, GAO Qikang2,3, Kong Luen HEONG1,2, ZHU Zengrong1,2, CHENG Jiaan1,2,*

1StateKeyLaboratoryofRiceBiology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China2InstituteofInsectSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China3AnalysisCenterofAgrobiologyandEnvironmentalSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China

High-throughput sequencing is a major breakthrough in the development of DNA sequencing technology and provides an unprecedented opportunity for modern biological scientific research, such as the DNA-based approach tracking the food chains among predators-prey or herbivores-host plants trophic interactions in ecosystems. This review illustrates and compares the principles of various types of technology, including the Roche 454, Illumina, and Ion Torrent technologies, and other recent progress. We also summarize studies that have used high-throughput sequencing technology to study interactions among generalist predators/herbivores and their prey/hosts. This review could provide new information and novel approaches to exploring molecular trophic interactions and improving our understanding of the prey/host spectrum, prey/host shift, biological control, resource allocation, conservation biology, and ecological restoration.

next generation sequencing; generalist predator; generalist herbivore; trophic interactions; diet switching; metabarcoding

國家科技支撐計劃項目(2012BAD19B01)；浙江省自然科學(xué)基金項目(LY16C140002);科技部國家“973”基礎(chǔ)重點研究發(fā)展規(guī)劃項目(2010CB126200)

2015- 11- 16; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2016- 10- 29

10.5846/stxb201511162317

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jacheng@zju.edu.cn

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