唐麗江，孫振華，汪鳳媛，顧棚，彭西

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，四川 溫江 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130；3.西華師范大學(xué)，四川 南充 637002）

小鼠脾臟胚后發(fā)育細(xì)胞的增殖規(guī)律研究

唐麗江1，孫振華1，汪鳳媛2，顧棚2，彭西*3

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，四川 溫江 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130；3.西華師范大學(xué)，四川 南充 637002）

本試驗(yàn)以健康昆明小鼠為研究對(duì)象，研究不同日齡小鼠脾臟胚后發(fā)育細(xì)胞的增殖規(guī)律，以探討脾臟發(fā)育與功能的關(guān)系。結(jié)果顯示：隨著小鼠日齡增加，脾臟臟器指數(shù)增加，結(jié)構(gòu)日益清晰，支持組織及小梁逐漸增多，分界明顯，淋巴濾泡隨日齡逐步增大，且與周圍組織分界漸清晰，25、50日齡時(shí)在紅髓與白髓區(qū)均可見較多的巨噬細(xì)胞。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)與免疫功能的關(guān)系，隨著日齡增長(zhǎng)，脾臟結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育成熟，免疫功能迅速增強(qiáng)。

脾臟指數(shù)；脾臟結(jié)構(gòu)；小鼠

脾臟是機(jī)體外周最大的免疫器官，具有造血、儲(chǔ)血、濾血及免疫功能。尤其是脾臟的免疫功能在機(jī)體淋巴器官中占有重要的地位。本研究采用昆明小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，研究不同日齡小鼠脾臟胚后發(fā)育細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化，以探討脾臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)育與免疫功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康懷孕昆明雌鼠30只，購(gòu)于華西醫(yī)學(xué)培育中心，幼鼠于20日齡斷乳后雌雄分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度控制在 20～25℃，自然照明，自由飲水和攝食。

1.2 脾臟指數(shù)測(cè)定及形態(tài)學(xué)觀察 分別取5、10、25、50日齡小鼠10只，稱量小鼠個(gè)體重，頸椎脫臼致死后取脾臟，小心地剝離臟器外周結(jié)締組織，用濾紙吸去血漬，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。計(jì)算公式如下：

器官指數(shù)=器官重（g）/體重（kg）

將脾臟制作成常規(guī)石蠟切片，采用H.E.染色法染色后[1]，400倍光鏡下觀察脾臟的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 脾臟的細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè) 隨機(jī)抽取10、25、50日齡小鼠各5只，剖殺，立即取適量脾臟組織塊，用機(jī)械法制成細(xì)胞勻漿，300目篩過(guò)濾后，500～800r/min低速離心，棄上清液，以pH值7.0～7.4的PBS洗兩次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。細(xì)胞周期檢測(cè)：細(xì)胞液經(jīng)過(guò)PI染液染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處于靜息期（G0G1），DNA合成期（S期）及分裂期（G2M）細(xì)胞所占的數(shù)量百分率，并計(jì)算增殖指數(shù)（PI）。計(jì)算公式如下：

細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取100μL細(xì)胞懸液于流式管中，加入5μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和5μL PI染液，輕微振蕩混勻，室溫避光染色15min；加入400μL結(jié)合緩沖液，振蕩混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cell Quest軟件分析早期凋亡細(xì)胞的百分率。

1.4 數(shù)據(jù)處理 用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析，用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 脾臟臟器指數(shù) 由表1得出：10日齡小鼠的脾臟臟器指數(shù)顯著高于5日齡（P＜0.05），25日齡和50日齡的脾臟臟器指數(shù)極顯著高于5日齡（P＜0.01）。表明隨著日齡增長(zhǎng)，脾臟逐漸發(fā)育成熟。

表1 脾臟臟器指數(shù)檢測(cè)（×1000）

2.2 脾臟胚后發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化 隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，脾臟結(jié)構(gòu)日益清晰，脾臟支持組織增多，小梁逐漸增多，分界明顯，淋巴濾泡逐步增大，且與周圍組織分界漸清晰；同時(shí)，脾臟內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，尤其是25、50日齡時(shí)在紅髓與白髓區(qū)均可見較多的巨噬細(xì)胞。

2.3 脾臟中細(xì)胞周期變化 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示（表2）：小鼠從10日齡開始，G0G1期細(xì)胞百分率呈下降趨勢(shì)，G2M期和S期細(xì)胞數(shù)量呈上升趨勢(shì)（P＞0.05），PI值也呈上升趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 脾臟細(xì)胞周期各時(shí)相變化

表3 小鼠脾臟細(xì)胞各日齡凋亡率的變化

圖1 小鼠脾臟細(xì)胞凋亡隨日齡增長(zhǎng)的變化

2.4 脾臟中細(xì)胞凋亡變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如表3和圖1所示。結(jié)果表明，隨著日齡增加，脾臟細(xì)胞的凋亡呈現(xiàn)不穩(wěn)定的趨勢(shì)。與10日齡比較，25日齡時(shí)，脾臟細(xì)胞的凋亡率極顯著升高（P＜0.01），50日齡時(shí)變化不明顯（P＞0.05）。

3 討論

3.1 脾臟胚后發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察 據(jù)報(bào)道，提高小鼠免疫臟器指數(shù)（包括胸腺、脾臟指數(shù)），有利于增強(qiáng)小鼠的免疫功能[2]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：10日齡時(shí)小鼠脾臟臟器指數(shù)顯著高于5日齡（P＜0.05），25日齡和50日齡時(shí)的脾臟臟器指數(shù)極顯著高于5日齡（P＜0.01）。

3.2 脾臟胚后發(fā)育的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化 脾臟是機(jī)體最大的外周淋巴器官，是免疫活性細(xì)胞受到抗原刺激后增殖分化的場(chǎng)所，小鼠從出生到性成熟，脾臟隨小鼠日齡的增長(zhǎng)而逐漸增大，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)也發(fā)生較大的變化。淋巴濾泡又稱脾小結(jié)或脾小體，是脾實(shí)質(zhì)的主要組成部分，由B淋巴細(xì)胞聚集而成，脾淋巴濾泡的生發(fā)中心是淋巴細(xì)胞增殖、生成的部位，其數(shù)量、體積反映了活性程度[3]。小鼠在出生后2～3d才出現(xiàn)脾小結(jié)，生發(fā)中心不明顯。有報(bào)道指出，隨著日齡增長(zhǎng)，脾臟各種特征結(jié)構(gòu)不斷發(fā)育成熟，7日齡時(shí)具備近似成熟的組織結(jié)構(gòu)，但直至35日齡才趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)觀察到隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，脾臟指數(shù)增加，結(jié)構(gòu)日益清晰，支持組織及小梁逐漸增多，分界明顯，淋巴濾泡隨之逐步增大，且與周圍組織分界漸清晰，25、50日齡時(shí)在紅髓與白髓區(qū)均可見較多的巨噬細(xì)胞。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)與免疫功能密切相關(guān)的說(shuō)法[4]，隨著日齡增長(zhǎng)，脾臟免疫功能迅速增強(qiáng)，發(fā)育好的脾小體生發(fā)中心可見樹突狀細(xì)胞（DC）及巨噬細(xì)胞，位于脾網(wǎng)架結(jié)構(gòu)及白髓間的紅髓使血流緩慢，從而使抗原與吞噬細(xì)胞的接觸成為可能，紅髓內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞（APC）與T、B細(xì)胞直接接觸，遞呈抗原，然后發(fā)生免疫反應(yīng)。B淋巴細(xì)胞受病原體刺激后，引起一系列變化，最終轉(zhuǎn)化成能產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。

3.3 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡變化 關(guān)于細(xì)胞凋亡的報(bào)道，有學(xué)者認(rèn)為，就免疫器官中的免疫細(xì)胞而言，凋亡的細(xì)胞需要通過(guò)細(xì)胞增殖來(lái)補(bǔ)充；淋巴細(xì)胞發(fā)育分化，不論是胸腺內(nèi)的淋巴細(xì)胞，還是脾臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞，都存在著陽(yáng)性選擇和陰性選擇，陽(yáng)性選擇是發(fā)育中對(duì)細(xì)胞死亡的拯救過(guò)程，而陰性選擇是通過(guò)細(xì)胞程序性凋亡而使細(xì)胞死亡的過(guò)程[5]，當(dāng)細(xì)胞增殖增多時(shí)，細(xì)胞凋亡將減少。又有說(shuō)法認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是為了保持機(jī)體自身組織穩(wěn)定、調(diào)控自身細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡，且保證細(xì)胞周期各時(shí)相的順利通過(guò)，細(xì)胞增殖不會(huì)阻滯于任一時(shí)期，這為細(xì)胞凋亡創(chuàng)造了條件[6]，故細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡有著相同的趨勢(shì)。本結(jié)果顯示，小鼠發(fā)育至25日齡時(shí)細(xì)胞凋亡達(dá)到一個(gè)高點(diǎn)，而細(xì)胞周期結(jié)果也顯示，在25日齡時(shí)細(xì)胞增殖達(dá)到最高，與前者結(jié)果相同，可能是細(xì)胞增殖分化過(guò)程中自由選擇的結(jié)果。

[1] 王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學(xué)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.

[2] 王衛(wèi)國(guó)，方娜.谷朊粉酶解物對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能和免疫臟器的影響[J].糧食與飼料工業(yè)，2010（15）：56-59.

[3] Mark F Cesta.Normal structure，function，and histology of the spleen[J].Toxicologic Pathology，2006，34（5）：455-465.

[4] Mast J，Goddeeris B M.Development of immunocompetence of broiler chickens[J].Vet Immunol Immunopathology，1999，70（34）：245-256.

[5] 李奎，孫桂榮，康相濤，等.固始雞免疫器官內(nèi)細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（8）：953-956.

[6] 劉麗，金宏，王先遠(yuǎn)，等.大豆異黃酮對(duì)電離輻射小鼠脾臟細(xì)胞周期、凋亡與增殖的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2006，22（4）：497-500.

The Cell Proliferation Laws of Spleen During Postembryonic Period in Mice

Tang Lijiang1，Wang Fengyuan2，Peng Xi3*，et al.
（1.Department of Animal and Veterinary Science，Chengdu Agricultural Science and Technology Vocational College，Sichuan Wenjiang 611130；2.College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University，Sichuan Wenjiang 611130；3.China West Normal University，Sichuan Nanchong 637002，China）

In this experiment，healthy Kunming mice were used to study the cell proliferation laws of the spleen，the relationship between the morphological structure and the immunological function was also discussed.The result showed that during the growth of mice，the structure of spleen was more and more clear，and the supporting tissue and trabecula increased with obvious boundary.The lymph follicles increased gradually and had a clear limit out of the surrounding tissue with the increase of age.There were more macrophages in the red pulp and white pulp area when the mice were 25 and 50 days old.According to the relationship between tissue structure and immune function，with the increase of age of the mice， the spleen structure developed gradually and the immune function increased rapidly.

Spleen index；Spleen structure；Mice

S852.167

B

1001-8964（2017）06-0026-02

2017-02-12

唐麗江（1985-），女，碩士，講師，研究方向：動(dòng)物解剖生理學(xué)。

*通訊作者：彭西