梁剛　侯春　冀航等

[摘要]目的：研究青蒿琥酯抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（HSFBs）增殖作用機(jī)制及miR-21所起的作用，為青蒿琥酯抑制皮膚瘢痕增生提供依據(jù)。方法：原代分離人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，分別使用100、200、300、500 μmol/L的青蒿琥酯處理24h，采用CCK8檢細(xì)胞的增值，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-21的表達(dá)情況。調(diào)控青蒿琥酯干預(yù)的HSFBs中的miR-21的表達(dá)，通過qRT-PCR和WB檢測(cè)細(xì)胞中結(jié)締組織生長因子（CTGF）以及機(jī)制金屬蛋白酶1（MMP-1）的表達(dá)。結(jié)果：青蒿琥酯能抑制HSFBs的增值，并且抑制miR-21的表達(dá)。HSFBs細(xì)胞使用mimics處理，能顯著降低青蒿琥酯對(duì)HSFBs的增值抑制作用，同時(shí)CTGF的表達(dá)升高，而MMP-I的表達(dá)降低。結(jié)論：青蒿琥酯可能通過調(diào)控miR-21的表達(dá)來抑制HSFBs的增值。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；青蒿琥酯；miR-21

[中圖分類號(hào)]R619⁺.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）03-0080-04

皮膚增生性瘢痕是病理性瘢痕的主要類型之一，常常給人們帶來瘙癢，病痛甚至活動(dòng)障礙等多種并發(fā)癥。降低了人類正常的生活質(zhì)量，特別是形成于面部的瘢痕嚴(yán)重影響美觀，給患者帶來很大的精神壓力。增生性瘢痕主要組織學(xué)特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞的增加，細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積以及膠原纖維紊亂無章的排列。

青蒿琥酯又稱青蒿酯，是由菊科植物黃花蒿葉提取的倍半萜烯的一種內(nèi)過氧化物。長期以來，人們一直用它作為一種治療瘧疾的傳統(tǒng)中藥。青蒿琥酯及其衍生物被世界衛(wèi)生組織列為治療瘧疾的首選藥物。它能特異性地抑制惡性瘧原蟲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣腺苷三磷酸酶的活性。除了抗瘧活性外，青蒿琥酯及其衍生物在一些自身免疫疾病模型中也表現(xiàn)出潛在的免疫抑制活性，例如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫腦脊髓炎。近年來，人們發(fā)現(xiàn)一定劑量的青蒿琥酯可以抑制HSFBs的增值，誘導(dǎo)其凋亡。

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小約為20～25個(gè)核苷酸。miRNAs可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和組織分化，與生命過程中發(fā)育、疾病密切相關(guān)。有研究顯示，miR-21能促進(jìn)纖維化的發(fā)生，可以通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積從而促進(jìn)纖維化的出現(xiàn)。慕生枝等人指出，下調(diào)HSFBs中miR-21的表達(dá)可以抑制HSFBs的增值。本研究通過體外培養(yǎng)HSFBs，采用不同濃度的青蒿琥酯進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)其對(duì)HSFBs增值的影響。同時(shí)通過抑制HSFBs中miR-21的表達(dá)，再一次驗(yàn)證青蒿琥酯對(duì)HSFBs的增值影響，探討青蒿琥酯對(duì)HSFBs抑制作用可能的機(jī)制，為開發(fā)抗瘢痕藥劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器：TS-IOOF倒置顯微鏡，日本Nikon公司；全自動(dòng)多功能型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀，美國ABI公司。

1.2主要試劑：青蒿琥酯，純度99.99%，桂林南藥股份公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibico公司；CCK8，美國Sigma公司；鼠抗人波形蛋白、鼠抗人CTGF單克隆抗體、鼠抗人Ⅰ型膠原多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體，武漢博士德公司；RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，日本Takara公司；miR-21 mimics，上海吉碼生物。

2方法

2.1 HSFBs的原代培養(yǎng)及鑒定：瘢痕標(biāo)本來源于廣州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院燒傷整形科外科手術(shù)切除的增生性瘢痕，取材前經(jīng)患者知情同意。組織采納的標(biāo)準(zhǔn)為3年內(nèi)沒有接受抗瘢痕治療，沒有系統(tǒng)性疾病。采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按照1：3反復(fù)傳代純化成纖維細(xì)胞。原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞均通過倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。取3代成纖維細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行波形蛋白免疫組化染色鑒定。

2.2 CCK8檢測(cè)HSFBs增值：細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，棄去PBS，加入0.25%胰酶，在顯微鏡下觀察，當(dāng)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸液；然后調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁵/μl，取100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板，即每孔種1×10⁴個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)；分別加入100、200、300、500μmol/L處理HSFBs，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。細(xì)胞處理結(jié)束的前4h，吸去培養(yǎng)液，按每lml完全培養(yǎng)基加入100 μl CCK-8將二者混合均勻后，每孔加入100 μl的CCK-8混合液，避免產(chǎn)生氣泡，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，4h后，將96孔板中的液體移至酶標(biāo)板中，在492nm波長下測(cè)定吸光度（A）值。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-21、CTGF及MMP1mRNA的表達(dá)：各組經(jīng)處理后的細(xì)胞根據(jù)RNA快速提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Vet.3.0說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA的第1鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析、DNA吸光度掃描檢測(cè)；顯色條帶圖像分析系統(tǒng)（Alpha Imager 2000）檢測(cè)其積分吸光度值，與內(nèi)參GAPDH條帶的比值為mRNA表達(dá)水平參數(shù)。miR-21的基因表達(dá)檢測(cè)是以U6小RNA為內(nèi)參。所用引物均由上海生工有限公司合成。具體引物序列表1。

2.4免疫熒光檢測(cè)波形蛋白：細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%～100%時(shí)，用1×PBS洗3次，每次10min；4%的甲醛室溫固定25min；O.2%TritonX-100透化2～5min；5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30min，加一抗波形蛋白（用1%BSA按照1：1000稀釋）4℃過夜，1×PBS洗滌3次，每次10min；加二抗IgG（用1%BSA按照1：1000稀釋）暗室避光30min，95%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍攝圖片。

2.5 Western blot檢測(cè)CTGF和MMP1的表達(dá)：每25cm²細(xì)胞加入蛋白裂解液200 μl，冰上裂解細(xì)胞30min，離心收集總蛋白。常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，4℃孵育一抗過夜（CTGF1：500稀釋，Ⅰ型膠原1：1000稀釋），室溫下孵育二抗30min（1：5000稀釋）；GAPDH作為內(nèi)參照（1：10000稀釋）。暗室內(nèi)ECL化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。

2.6數(shù)據(jù)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 HSFBs原代分離及鑒定結(jié)果：培養(yǎng)5～7d可見組織塊周圍有細(xì)小呈長梭狀貼壁細(xì)胞，之后梭形細(xì)胞快速增值，20d左右可長滿25cm²培養(yǎng)瓶，生長狀態(tài)如圖1A；傳至第三代，可以獲得較純的成纖維細(xì)胞，所有細(xì)胞胞質(zhì)均呈抗波形蛋白染色陽性（圖1B）。

3.2青蒿琥酯對(duì)HSFBs的增值及miR-21的表達(dá)的影響：100、200、300、500μmol/L的青蒿琥酯處理HSFBs，CCK8結(jié)果顯示，隨著青蒿琥酯濃度的增加，對(duì)HSFBs增值的抑制作用增加，且與對(duì)照組相比，48h后，300及500μmol/L青蒿琥酯處理組有顯著性差異（P<0.05）（圖2A）。miR-21的表達(dá)也明顯下降，且200、300、500μmol/L的青蒿琥酯處理組與對(duì)照組相比，有顯著性差異（P<0.05）（圖2B）。使用300μmol/L的青蒿琥酯進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

3.3上調(diào)miR-21后，青蒿琥酯對(duì)HSFBs增值抑制作用鑒定：用青蒿琥酯處理HSFBs，處理后將細(xì)胞分成3組，分別為對(duì)照組，mimics NC組和mimics組。分別對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR，wB和CCK8檢測(cè)。與對(duì)照組和mimics NC相比，mimics組miR-21（圖3A）和CTGF mRNA（圖3B）表達(dá)上升，而MMP-1 mRNA（圖3C）的表達(dá)下降，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組和mimics NC相比，mimics組CTGF的蛋白表達(dá)上升，MMP-1蛋白表達(dá)下降（圖3D）。與對(duì)照組和mimics NC相比，mimics組HSFBs增值抑制作用降低，且48h后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4討論

增生性瘢痕是人體對(duì)創(chuàng)傷產(chǎn)生過度愈合反應(yīng)的結(jié)果，是人體燒傷、外傷或者炎癥一種過度的皮膚纖維增生性疾病，成纖維細(xì)胞增殖旺盛、細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原、糖蛋白等過度的沉積，膠原蛋白排列紊亂為主要的病理特征。而人們認(rèn)為其可能與異物反應(yīng)、膠原降解、免疫反應(yīng)異常有關(guān)。成纖維細(xì)胞在傷口上皮化以后繼續(xù)旺盛增殖且凋亡過程發(fā)生抑制、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡、部分生長因子的大量產(chǎn)生和持續(xù)性存在，這三者密切關(guān)聯(lián)構(gòu)成了增生性瘢痕形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。增生性瘢痕與正常皮膚的成纖維細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)為纖維細(xì)胞持續(xù)旺盛同時(shí)大量分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，使組織體積不斷的增大引起副作用，比如功能型障礙。所以成纖維細(xì)胞的生長異常，被認(rèn)為是瘢痕形成過程中的主要因素。

miRNA是一種長度約為19-22nt的非編碼RNA，調(diào)節(jié)正常生理過程及病理過程，如器官的發(fā)育，創(chuàng)傷的愈合以及腫瘤的發(fā)生，幾乎參與調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)。有報(bào)道指出，miR-21參與間質(zhì)纖維化和心肌肥厚的成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，miRNA-21的表達(dá)失調(diào)也可能調(diào)控肺纖維化的。本研究發(fā)現(xiàn)，使用青蒿琥酯可以降低miR-21的表達(dá)以及降低HSFBs的增殖。而通過加入miR-21minics可以降低青蒿琥酯的作用。這表明通過青蒿琥酯降低miR-21的表達(dá)能夠抑制瘢痕的形成。

Ⅰ型膠原的過度合成和降解減少是增生性瘢痕形成的原因之一。抑制成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的形成可以明顯地抑制瘢痕增生。而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的持續(xù)降解。MMP-1能夠破壞膠原熱穩(wěn)定性。組織中的MMP-1含量的多少級(jí)活性的強(qiáng)弱和細(xì)胞外基質(zhì)的降解程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，提高miR-21的含量可以降低青蒿琥酯抑制HSFBs的增殖，而此過程與CTGF的表達(dá)升高和MMP-1的表達(dá)降低有關(guān)。從而推測(cè)青蒿琥酯可能一方面通過下降miR-21的表達(dá)而影響CTGF的表達(dá)，與此同時(shí)，通過上調(diào)MMP-1的表達(dá)，加速膠原的降解。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)揭示青蒿琥酯可以抑制HSFBs增殖，通過下調(diào)miR-21的表達(dá)，而通過上調(diào)miR-21的含量，可以上調(diào)CTGF的表達(dá)而降低MMP-1的表達(dá)。從而增加細(xì)胞外膠原基質(zhì)的沉積，增大HSFBs的增殖。所以miR-21對(duì)瘢痕的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用，這對(duì)于臨床上應(yīng)用miR-21靶向分子治療增生性瘢痕提供了理論基礎(chǔ)。