侯垚瑤，劉科賽，李 詩(shī)，劉細(xì)霞，侯建軍，李運(yùn)濤

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三峽水庫(kù)干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物多樣性研究

侯垚瑤1,2，劉科賽1,2，李 詩(shī)1，劉細(xì)霞1，侯建軍1，李運(yùn)濤1*

（1.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北師范大學(xué))，湖北 黃石 435002 2. 湖北師范大學(xué) 文理學(xué)院，湖北 黃石 435002）

以三峽水庫(kù)長(zhǎng)江干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物為研究對(duì)象，在三峽水庫(kù)干流庫(kù)區(qū)設(shè)置2個(gè)采樣點(diǎn)（CJ01，CJ05），分別在2015春季（4月）、夏季（8月）、秋季（10月）和冬季（12月）進(jìn)行季度采樣；采用IlluminaMiseq PE250高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)8個(gè)樣本的18S rDNA進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，三峽水庫(kù)長(zhǎng)江干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物群落主要的類群有隱藻、纖毛蟲以及領(lǐng)鞭毛蟲等，此外還有大量未分類物種。群落結(jié)構(gòu)存在時(shí)空演化，其時(shí)空演化以時(shí)間為主。三峽水庫(kù)長(zhǎng)江干流庫(kù)區(qū)群落物種豐富度和多樣性從春季開(kāi)始逐漸增加，到冬季后開(kāi)始降低。水體溫度（WT）、化學(xué)需氧量（COD）與春季群落成正相關(guān)，與秋季群落成負(fù)相關(guān)?？偭?TP)、磷酸鹽(P-PO4）、溶解氧（DO）、氧化還原電位（ORP）與秋季群落成正相關(guān)，與春夏季群落成負(fù)相關(guān)。

三峽水庫(kù)；超微型真核浮游生物；18S rDNA；高通量測(cè)序；生物多樣性

三峽水庫(kù)是目前世界上最大的水利工程，其庫(kù)區(qū)的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。水庫(kù)從2003年開(kāi)始蓄水后，由于水動(dòng)力學(xué)條件等水體環(huán)境的改變，造成水體流速降低、營(yíng)養(yǎng)元素積累、水環(huán)境自凈功能減弱等問(wèn)題。同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)鹽以及污染物不斷地匯入水庫(kù)，加上水環(huán)境容量變化，容易出現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化，這些勢(shì)必導(dǎo)致水庫(kù)水生生物群落也隨之發(fā)生很大改變[1][2]。

超微型浮游生物是粒徑小于和等于5μm的浮游生物[3]。超微型浮游生物在水體中大量存在，其數(shù)量、生物量和生產(chǎn)力大小可作為水域生態(tài)系統(tǒng)質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。超微型浮游生物作為水域生態(tài)系統(tǒng)最主要的初級(jí)生產(chǎn)者和消費(fèi)者，在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)以及信息傳遞中起著重要的作用。超微型浮游生物的群落組成、數(shù)量分布及季節(jié)動(dòng)態(tài)是其群落結(jié)構(gòu)的重要特征。超微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)、功能與水質(zhì)和生物地化循環(huán)都有著極為密切的關(guān)系[4][5]。

本研究以三峽水庫(kù)中的干流庫(kù)區(qū)為對(duì)象，采用高通量測(cè)序方法并結(jié)合多元分析技術(shù)，探討超微型真核浮游生物的群落組成、時(shí)空分布特點(diǎn)和演替規(guī)律、多樣性格局及其與環(huán)境因子變化的互動(dòng)關(guān)系，進(jìn)而指示區(qū)域水體的生物多樣性特征及水環(huán)境變化規(guī)律，為探討其在生物地化循環(huán)中的功能等后續(xù)研究提供工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與試劑

在三峽水庫(kù)的干流庫(kù)區(qū)設(shè)置2個(gè)采樣點(diǎn)（CJ01，CJ05），分別在2015春季（4月）、夏季（8月）、秋季（10月）和冬季（12月）進(jìn)行季度采樣。每次采集表層深度0.5m的水樣，先用篩絹初濾，再用5μm Isopore濾膜過(guò)濾，然后用GF/F濾膜進(jìn)行二次過(guò)濾，獲得的過(guò)濾樣品保存在超低溫冰箱被測(cè)。Pfu PCR MasterMix、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

同步監(jiān)測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)理化指標(biāo)包括：水體溫度（WT）、溶解氧（DO）、pH、氧化還原電位（ORP）；室內(nèi)水化學(xué)指標(biāo)主要有硝酸鹽(N-NO3)、總氮（TN）、銨鹽(N-NH4)、總磷(TP)、磷酸鹽(P-PO4）、化學(xué)需氧量（COD）。本研究的理化指標(biāo)數(shù)據(jù)由合作單位中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所峽口工作站提供。

圖1 采樣點(diǎn)的位置

1.2 基因組DNA提取

DNA提取采用改良CTAB法[6]。保存的膜樣品剪下一半于1.5μL ep管中，每管加入700μL預(yù)熱裂解緩沖液（1.0mol/L NaCl; 50mmol/L EDTA; 50mmol/L Tris; 1% PVP），混勻后65℃恒溫水浴30 min；水浴結(jié)束后12000g離心5min，取上清，加入1/5倍體積的5×CTAB，65℃水浴10min；接著加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，8000g 4℃離心10min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），8000g 4℃離心10min，取上清，加入1/10體積3M醋酸鈉，混勻，加2倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于-20℃放置1h；12000g離心20min，去上清，加入1ml 70%乙醇，12000g離心5min，去上清，干燥；加入30μL的無(wú)菌水，-20℃保存。

1.3 高通量測(cè)序及分析

提取的基因組DNA送上海美吉生物公司使用IlluminaMiseq PE300平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序引物為0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）。測(cè)序原始序列數(shù)據(jù)委托公司進(jìn)行過(guò)濾、拼接，舍棄低質(zhì)量序列，選擇長(zhǎng)度在400bp左右的有效序列進(jìn)行環(huán)境微生物多樣性和相關(guān)生物信息分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 宏基因組DNA提取及18S rDNA擴(kuò)增

分別提取來(lái)自四個(gè)季度中2個(gè)站點(diǎn)超微型浮游生物的基因組DNA，提取到的宏基因組DNA如圖2所示，質(zhì)檢顯示其條帶清晰，能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 基因組DNA

M:Marker；泳道1-8：提取的基因組DNA

2.2 測(cè)序總體情況分析

測(cè)序的原始序列經(jīng)質(zhì)控處理后，8個(gè)樣本總共得到有效序列319818條，序列平均長(zhǎng)度400bp左右，絕大部分序列長(zhǎng)度分布在390-400bp范圍內(nèi)。序列相似性大于等于97%的序列歸為一個(gè)操作分類單元（operationaltaxonomicunit，OTU），總共可以分為192個(gè)OUT。其中除真菌外有131個(gè)OUT， 247765條有效序列。各個(gè)樣本的稀釋性曲線均趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，樣本的測(cè)序深度足夠。

表1 各樣本有效序列分布情況

圖3 各樣本稀釋性曲線

2.3 群落組成及其多樣性

測(cè)序深度指數(shù)使用Good’s coverage表示，結(jié)果表明所有樣本的Coverage指數(shù)均大于0.999，顯示樣本的測(cè)序深度足夠。

表2 各樣本多樣性指數(shù)

8個(gè)樣本中，CJ01aut的 Chao和Shannon指數(shù)最高，ACE指數(shù)也較高，而Simpson指數(shù)最低，提示CJ01aut具有最高的群落豐富度和群落多樣性。CJ01spr的Shannon指數(shù)最低，Chao和ACE指數(shù)也很低，顯示CJ01spr是群落豐富度和群落多樣性最低的樣本之一。

整個(gè)干流Chao、ACE和Shannon指數(shù)的總體變化趨勢(shì)為春、夏、秋季逐漸升高，到冬季下降，表明三峽庫(kù)區(qū)干流的超微型真核浮游生物物種豐富度和多樣性從春季開(kāi)始逐漸增加，到冬季后開(kāi)始降低?？傮w上，一年中夏、秋季的物種豐富度和多樣性較高，而冬春季較低。

圖4 樣本等級(jí)豐度曲線

樣本的等級(jí)豐度曲線顯示，群落物種組成均勻程度最高的為CJ05sum，其次為CJ01sum；物種豐度最高的是CJ05sum，其次是CJ01sum。這些結(jié)果表明，在三峽干流庫(kù)區(qū)，一年中超微型真核浮游生物群落物種均勻程度和豐度最高的季節(jié)是夏季。

分類學(xué)分析結(jié)果表明，三峽水庫(kù)干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物具有豐富的多樣性，群落結(jié)構(gòu)在空間和時(shí)間尺度均存在明顯變化。主要的類群有隱藻、纖毛蟲，領(lǐng)鞭毛蟲等，豐度較少的有甲藻、硅藻、金藻等。此外還有大量的序列尚不能歸屬于已知的任何生物類群，屬于未分類的物種。令人意外的是，我們?cè)跇悠分羞€檢測(cè)到了典型海洋生不等鞭毛類浮游生物（MAST-12）。整個(gè)干流庫(kù)區(qū)，隱藻始終占優(yōu)勢(shì)；夏季未分類浮游生物占優(yōu)勢(shì)，同時(shí)隱藻也較多，01站點(diǎn)纖毛蟲的類群也處于優(yōu)勢(shì)地位。

根據(jù)各樣本中OUT的類型及OTU所含的序列數(shù)，利用非加權(quán)組平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）算法，使用Bray-Curtis距離，進(jìn)行了各樣本群落結(jié)構(gòu)的聚類分析，結(jié)果顯示如下：

圖5 群落結(jié)構(gòu)組成圖

圖6 樣本群落結(jié)構(gòu)聚類圖

干流中01測(cè)站秋、冬季的群落結(jié)構(gòu)較為相似，聚為一個(gè)小類，表明秋、冬季群落結(jié)構(gòu)相似性最高，秋季到冬季群落結(jié)構(gòu)變化較小；夏季群落與秋冬季聚為一個(gè)大類，春季群落單獨(dú)成為一支，顯示春季群落結(jié)構(gòu)組成與其他3個(gè)季節(jié)差別較大。05站點(diǎn)春冬季的群落結(jié)構(gòu)較為相似，聚為一個(gè)小類，表明春冬季群落結(jié)構(gòu)相似性最高，冬季到春季群落結(jié)構(gòu)變化較??；夏季群落與春冬季聚為一個(gè)大類，秋季群落單獨(dú)成為一支，顯示秋季群落結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)季節(jié)差別較大。整個(gè)干流樣本的聚類顯示，8個(gè)樣本按季節(jié)聚成4個(gè)小類，夏冬季聚為一個(gè)稍大的類，春季群落單獨(dú)成為一支，表明整體上干流的群落結(jié)構(gòu)夏冬季差異較小，春季群落結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)季節(jié)差別較大。整個(gè)干流樣本的聚類結(jié)果還表明，三峽水庫(kù)干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)的演替存在著時(shí)空演化規(guī)律，其時(shí)空演化以時(shí)間演化為主，時(shí)間變化的影響要大于空間變化的影響。

將8個(gè)樣本分別按站點(diǎn)和季節(jié)分組進(jìn)行ANOSIM 相似性分析，結(jié)果顯示站點(diǎn)之間群落結(jié)構(gòu)的差異不顯著，而季節(jié)之間群落差異極顯著。ANOSIM分析結(jié)果也表明干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)空演化以時(shí)間為主，這和聚類的分析結(jié)果十分一致。

表3 ANOSIM相似性分析

aCJ01sprCJ01sumCJ01autCJ01win，CJ05sprCJ05sumCJ05autCJ05win

bCJ01spr CJ05spr，CJ01sum CJ05sum，CJ01aut CJ05aut，CJ01win CJ05win

2.4 群落與環(huán)境因子的關(guān)系

超微浮游生物生長(zhǎng)于水庫(kù)的水體中，受水體中多個(gè)理化因子的影響和制約，如總磷、磷酸磷、氮、銨態(tài)氮、水溫、溶氧等，這些因子可能對(duì)其生物多樣性造成影響。

在11個(gè)環(huán)境理化因子中，篩選出了7個(gè)影響較大的因子進(jìn)行分析。選用OUT類型與環(huán)境因子一起進(jìn)行冗余分析來(lái)探究群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系。排序結(jié)果顯示，水體溫度（WT）、化學(xué)需氧量（COD）與春季群落成正相關(guān)，與秋季群落成負(fù)相關(guān)，與冬夏季群落關(guān)系不大?？偭?TP)、磷酸鹽(P-PO4）、溶解氧（DO）、氧化還原電位（ORP）與秋季群落成正相關(guān)，與春夏季群落成負(fù)相關(guān)，與冬季群落關(guān)系不大。在7個(gè)理化因子中，其中pH的影響較小。

圖7 OUT類型與環(huán)境因子的CCA排序圖

3 討論

三峽水庫(kù)干流庫(kù)區(qū)超微型真核浮游生物群落多樣性Shannon指數(shù)均小于3，說(shuō)明水體處于重度富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)，結(jié)果提示2015年長(zhǎng)江干流的水質(zhì)較差，超微型浮游生物的結(jié)果與黃真理和周廣杰等人的結(jié)果不盡一致[8] [9]，顯示近兩年來(lái)庫(kù)區(qū)的水質(zhì)在變差。春季兩個(gè)站點(diǎn)的多樣性指數(shù)（Shannon，Chao和ACE）明顯較低，說(shuō)明它們的物種種類數(shù)量較少，但優(yōu)勢(shì)種明顯，提示有發(fā)生水華的可能性，這與楊正健等人的研究結(jié)果相同[10]。超微型浮游生物群落多樣性的總體變化趨勢(shì)為春、夏、秋季逐漸升高，到冬季下降，這與王英才等的結(jié)果也比較一致[11]。

本研究結(jié)果表明，干流庫(kù)區(qū)群落結(jié)構(gòu)的演替以時(shí)間序列為主。本課題組前期的研究顯示支流香溪河的群落演替規(guī)律與此相似。同時(shí)我們前期對(duì)干流庫(kù)區(qū)的超微型真核浮游生物群落多樣性也做過(guò)研究，所取兩個(gè)站點(diǎn)為CJ01、CJ07，其群落結(jié)構(gòu)的演變以空間變化為主，與本文的結(jié)論不一致（課題組前期研究結(jié)果，待發(fā)表）。綜合分析顯示，本研究的取樣點(diǎn)CJ01、CJ05之間沒(méi)有較大的支流注入，而前期研究中的CJ01、CJ07站點(diǎn)之間有支流香溪河、童莊河注入，且干流的采樣點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，且在蓄水時(shí)產(chǎn)生的庫(kù)灣其流速減緩，因此其浮游生物種類會(huì)發(fā)生一定程度的改變，故而在空間尺度上產(chǎn)生較明顯的差異。這些結(jié)果提示支流的注入會(huì)對(duì)干流的浮游生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，且會(huì)改變干流的群落演替規(guī)律。

在諸如水庫(kù)和人工湖泊等這類水體中，超微型浮游生物群落的種類數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成的變化一般存在著相似的規(guī)律，相關(guān)的生物、物理和化學(xué)等環(huán)境因子是影響其變化規(guī)律的主要因素[12]。水庫(kù)的類型不同，在成庫(kù)過(guò)程的不同階段，以及不同時(shí)期，其水環(huán)境中主導(dǎo)因子的作用也會(huì)存在著差異[13]。一般來(lái)說(shuō)，水溫和營(yíng)養(yǎng)鹽是影響超微型浮游生物生長(zhǎng)的主要因子，水體中的氮和磷及氮、磷比值也會(huì)促進(jìn)或抑制著藻類等浮游生物類群的生長(zhǎng)與分布，但其它物理和化學(xué)因子以及生物因子也都能夠通過(guò)一定方式來(lái)綜合影響著氮、磷、營(yíng)養(yǎng)鹽變化，其他一些環(huán)境理化因子有會(huì)有相應(yīng)的變化[14-16]。

本研究結(jié)果的分析表明，水溫、化學(xué)需氧量都會(huì)對(duì)春季的超微型生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生正面的影響；其隨著溫度上升及水體中有機(jī)物含量增加，群落多樣性增加，這與水體中浮游植物群落多樣性從春季到夏季逐漸升高的結(jié)論是吻合的。秋季的群落多樣性較高，需要大量的營(yíng)養(yǎng)鹽，因此，營(yíng)養(yǎng)鹽因子也與其群落結(jié)構(gòu)組成和群落演替等變化成正相關(guān)。

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Study on the Biodiversity of Ultra Micro Eukaryotic Plankton in the Three Gorges Reservoir

HOU Yao-yao1,2, LIU Ke-sai1,2, LI Shi1, LIU Xi-xia1, HOU Jian-jun1, LI Yun-tao1

（1. Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization ( Hubei Normal University, Huangshi Hubei 435002, China；2. College of Arts & Science of Hubei Normal University, Huangshi Hubei 435002, China）

High-throughput sequencing of the 18S rRNA gene was used to analyze the picoeukaryotic diversity, which came from two sampling sites located in the Three Gorges Reservoir of Yangtse River at four seasons during 2015. The major groups of community were Cryptophyta, ciliate and Choanozoa, etc. In addition, a large number of species was unclassified. Temporal and spatial variations were detected in the samples of community structures, and community-level changes were largely explained by temporal patterns. Species richness and diversity of community increased gradually from spring, and decreased after winter. Water temperature and chemical oxygen demand were positively correlated with the community structure of spring, and negatively correlated with the community structure of fall. Total phosphorus, phosphate, dissolved oxygen and redox potential were positively correlated with the community structure of autumn, negatively correlated with the community structure of spring and summer.

Three Gorges Reservoir; micro eukaryotic plankton; 18S rDNA; high-throughput sequencing; biodiversity

Q943

A

2095－414X(2017)03－0074－07

李運(yùn)濤（1979-），男，副教授，研究方向：水域生態(tài)學(xué).

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41171045），湖北師范大學(xué)研究生創(chuàng)新科研基金項(xiàng)目（201718），湖北師范大學(xué)文理學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目（DK201510），湖北師范大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（T201504）.